Name: 在小鼠原代肝细胞测定脂肪酸氧化和脂肪生成的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 了解如何使用小鼠原代肝细胞测定脂肪酸氧化和脂肪生成的方法。该技术通过肝脏灌注分离肝细胞，结合放射性标记底物与液体闪烁分析，为代谢疾病研究提供重要的实验模型。

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我们感谢Susan Gray和Umadevi Chalasani在肝细胞分离实验方案技术细节方面提供的帮助。本研究工作由NIDDK基金5R01DK089185（资助给M.P. Cooper）以及UMMS糖尿病研究中心（DERC）的试点与可行性项目（资助给M.P. Cooper）提供支持。

所有动物实验均应遵循地方和联邦法规，并获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）及辐射安全管理部门的批准。
1. 准备
<ol>
	<li>在实验开始前数天，将500 ml解冻&#160;一瓶肝消化培养基（LDM）并重新冷冻约35 ml&#160;50 ml 分装液&#160;锥形管。于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
	<li>实验前一天，使用高压灭菌器对洁净的解剖工具进行预灭菌。</li>
	<li>在检测当天，用胶原处理所需数量的24孔培养板。
	<ol>
		<li>混合1份3 mg/ml的溶液&#160;大鼠尾胶原与50份PBS混合。加入约500 µl&#160;向24孔板的每孔中加入胶原溶液，室温（RT）孵育3-5分钟。移除胶原溶液，将板置于生物安全柜中晾干。至少重复此步骤一次。 
		注意：胶原包被可提前一周完成，包被后的培养板用塑料膜密封后于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备LDM用于检测：将LDM解冻并升温至37 °C，使用1 N KOH调节pH至7.4。用0.2 µm注射器滤器过滤后，置于循环42 °C水浴中。</li>
	<li>预热 25 ml&#160;将肝灌注培养基在循环水浴中加热至 42 °C。</li>
	<li>制备90%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液：加入1 ml&#160;10倍浓度DPBS溶液1 ml加至9 ml&#160;用聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅。使用0.1 N HCl调节pH至7.4。用无菌0.2 µm注射器滤器过滤。室温保存。</li>
	<li>将铺板培养基预热至 37 °C。</li>
</ol>
2. 小鼠原代肝细胞的分离
<ol>
	<li>安装蠕动泵、管路和解剖台：用 5 ml&#160;70% 乙醇（溶于蒸馏水中）冲洗管路进行消毒，随后用 10 ml&#160;无菌水冲洗。将管路置于肝脏灌注培养基中，启动泵使整个管路充满培养基。</li>
	<li>采用机构批准的方法处死小鼠。</li>
	<li>打开腹腔：在小鼠腹部大量喷洒 70% 乙醇。使用钝头剪刀沿腹部中线切开皮肤至整个腹部长度，并向两侧翻开。在腹膜上做类似切口以暴露内脏。
	<ol>
		<li>使用钝器轻轻移开肠道，暴露腹部血管系统。找到腹部下腔静脉（IVC），并在肾静脉远端的血管下方穿一根缝线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在缝线远端，将针头和导管插入下腔静脉（IVC），并推进至超过缝线水平。保持针头位置不变，将缝线绑在导管周围以固定导管。小心取出针头。若操作正确，血液将流经导管。</li>
	<li>使用移液器将灌注培养基填充至导管剩余空间，确保无气泡存在。极其小心地将管路连接到导管上。</li>
	<li>打开胸腔：轻轻上翻肝上叶以暴露膈肌。用尖头剪刀小心刺破膈肌，然后做侧向切口以暴露胸膜腔，注意避免损伤胆囊和胸膜血管。在肝静脉近端处的胸段下腔静脉上放置一个血管夹（ bulldog clamp）。</li>
	<li>剪开门静脉，并以 3 - 4 ml/min 的流速启动泵。使用约 20 ml&#160;灌注培养基对肝脏进行 5 分钟的灌注。
	 
	注意：肝脏应立即由红色变为灰/褐色。若肝脏部分区域仍呈红色，可能提示灌注不良，成功分离的可能性将显著降低。灌注过程中需特别注意避免培养基耗尽或气泡进入管路。</li>
	<li>完成 5 分钟灌注后，停止泵运行，并将管路切换至肝脏消化培养基。重新启动泵，继续灌注 10 - 15 分钟（直至培养基耗尽）。</li>
	<li>灌注结束后停止泵运行。此时肝脏应呈粉红色且略有肿大。通过精细解剖切除肝脏。去除胆囊，并将肝脏转移至 10 cm 组织培养皿中。</li>
	<li>在生物安全柜中，向肝脏中加入 10 ml&#160;贴壁培养基（表 1）。使用镊子或手术刀轻轻刮取肝脏以释放肝细胞。用 100 µm 细胞滤网过滤悬液，并转移至 50 ml&#160;离心管中。用额外的 10 ml&#160;贴壁培养基冲洗培养皿，并将冲洗液合并至 50 ml&#160;离心管中。</li>
	<li>在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 ml&#160;贴壁培养基中，再加入 10 ml&#160;90% 聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅。轻轻混匀后，按步骤 2.11 的条件离心。离心后，死细胞将漂浮在混合物上层，而活细胞则沉淀至底部。</li>
	<li>吸除上层死细胞及上清液。用 20 ml&#160;贴壁培养基洗涤两次，每次均按步骤 2.11 的条件离心。</li>
	<li>将细胞重悬于 10 ml&#160;贴壁培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并将 9 × 104 个细胞/孔接种于胶原处理过的 24 孔培养板中。在 37 °C 组织培养箱中孵育 2 小时。每块培养板可用于脂肪酸氧化测定或脂质生成测定。</li>
	<li>可选：更换为维持培养基（表 1），并在 37 °C 继续培养。细胞可在不影响检测结果的情况下培养 2 - 3 天。</li>
</ol>
3. 脂肪酸氧化测定
警告：使用放射性物质可能存在危险。放射性材料的采购、储存、操作和处置均须遵循机构、州和联邦的法规与指南。
<ol>
	<li>实验前 16 - 20 小时，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次。将细胞更换至无血清的饥饿培养基（表 1），其中加入 20 nM 胰高血糖素，并在 37 °C 下过夜孵育。 
	注意：由于胎牛血清中含有未知浓度的代谢激素（例如胰岛素、胰高血糖素），需对细胞进行血清饥饿处理，以消除这些激素对实验可能产生的干扰。细胞在饥饿培养基中可存活超过&#62;24 小时。胰高血糖素处理用于刺激肝细胞内的脂肪酸氧化。</li>
	<li>实验当天早晨，配制预孵育培养基：将适量棕榈酸钠溶于超纯水中，配制成 100 mM 溶液，并在 70 °C 加热 10 分钟。同时，准备所需量的 DMEM 培养基（每 24 孔板孔 0.5 ml&#160;），其中含 25 mM HEPES、1% BSA 第五组分和 20 nM 胰高血糖素，并加热至 37 °C。
	<ol>
		<li>待棕榈酸钠完全溶解后，将其加入上述培养基中，终浓度为 250 µM。将肝细胞更换至预孵育培养基，在 37 °C 孵育 2 小时。保留部分预孵育培养基于 37 °C 以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在孵育期间，通过氮气吹干适量的14C-棕榈酸（每孔 0.5 µCi）。
	<ol>
		<li>例如，若需检测 24 孔板中的 24 个样品，可将 120 µl&#160;浓度为 0.1 µCi/ml 的14C-棕榈酸转移至 1.5 ml&#160;离心管中。在通风橱中，从距离液面 3-5 cm 处缓慢通入氮气，吹除乙醇溶剂。溶剂约在 30 - 40 分钟内完全蒸发，管底将留下干燥的14C-棕榈酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在预孵育结束前约 15 分钟&#160;，用 0.1 N NaOH（每 µCi 12.5 µl）重悬14C-棕榈酸，在 70 °C 孵育 10 分钟。加入三倍体积的预热预孵育培养基，通过移液器反复吹打混匀。</li>
	<li>向每孔加入 25 µl&#160;稀释后的14C-棕榈酸。轻轻摇动培养板混匀，于 37 °C 孵育 90 分钟。此即为实验板。</li>
	<li>在孵育期间，准备滤纸板（图 1）。
	<ol>
		<li>取下无菌 24 孔板的盖子，在每个孔底部放置一片 2 cm × 2 cm 的滤纸。将一张 4” × 7” 的 Parafilm 膜覆盖在板上。</li>
		<li>使用较大的矩形物体（如移液器吸头盒），在孔位上方按压 Parafilm 膜，使其在孔口处穿孔，同时在其余区域形成密封。移除覆盖在孔口上的穿孔 Parafilm 圆片。此时，除孔口外，整个板表面应被 Parafilm 膜紧密覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在孵育结束前 10 分钟，向滤纸板的每孔加入 200 µl&#160;3 N NaOH，确保滤纸完全吸收液体。
	<ol>
		<li>可选：在冷冻前，将培养基转移至新的 24 孔板。用 PBS 洗涤一次后，用 0.1 N HCl 裂解剩余细胞，并通过 BCA 法测定蛋白含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育结束后，立即用液氮速冻实验板。操作时需确保每孔完全冻结后再进行下一步。</li>
	<li>向实验板的每孔加入 100 µl&#160;70% 高氯酸。立即盖上滤纸板，将两板置于轨道摇床上，在室温下以 80 rpm 摇动 2 小时。</li>
	<li>孵育结束后，处理样品：
	<ol>
		<li>为测定 CO2 组分，将滤纸方块转移至含有 4 ml&#160;液体闪烁液的闪烁瓶中，检测14C 信号。</li>
		<li>为测定酸溶性物质，取 400 µl&#160;培养基转移至 1.5 ml&#160;微量离心管中。最大转速离心 10 分钟。取 100 µl&#160;上清液加入 500 µl&#160;2:1 氯仿-甲醇（v/v）中，短暂涡旋混匀。
		<ol>
			<li>向混合物中加入 250 µl&#160;水，再次涡旋混匀。在 3,000 × g 离心 10 分钟。取 200 µl&#160;上层相转移至含 4 ml&#160;液体闪烁液的闪烁瓶中，检测14C 信号。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脂质生成检测
<ol>
	<li>开始实验前一晚，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次。将肝细胞更换为含 100 nM 胰岛素的无血清培养基。于 37 °C 培养过夜。 
	注意：由于胎牛血清中含有未知浓度的代谢激素（例如胰岛素、胰高血糖素），需对细胞进行无血清饥饿处理，以消除这些激素对实验可能产生的干扰。细胞在无血清培养基中可保持活性超过&#62;24 小时。本实验中使用胰岛素以刺激脂质生成。</li>
	<li>配制脂质生成培养基：在无血清培养基中加入 100 nM 胰岛素、10 µM 冷乙酸盐以及每孔 0.5 µCi 3H-乙酸盐。将细胞更换为此培养基，并于 37 °C 培养 2 小时。可根据需要加入待测化合物。</li>
	<li>培养结束后，用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入 120 µl&#160;0.1 N HCl 刮取细胞进行裂解。保留 10 µl&#160;用于蛋白定量（通过 BCA 法测定），并将 100 µl&#160;转移至 1.5 ml&#160;微量离心管中。</li>
	<li>加入 500 µl&#160;2:1 氯仿-甲醇（v/v）进行脂质提取。短暂涡旋混匀，室温孵育 5 分钟。再加入 250 µl&#160;水，再次涡旋混匀，室温继续孵育 5 分钟。样品于室温以 3,000 × g 离心 10 分钟。小心吸取下层有机相，转移至含有 4 ml&#160;液体闪烁液的闪烁瓶中，测定 3H 放射活性。</li>
</ol>

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<li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li>
<li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169(2007).</li>
</ol>

作者表示他们没有利益冲突。

从处死到开始灌注的时间应少于3分钟，以确保肝脏获得理想的灌注效果和胶原酶消化效果。一旦开始使用灌注液进行灌注，肝脏颜色应立即由红色变为苍白。在低钙消化液（LDM）中孵育约10分钟后，肝脏会呈现肿胀且呈粉红色。如果灌注不充分，肝脏可能不会出现这些变化，通常会导致肝细胞收获量降低。
洗涤步骤完成后，分离的肝细胞可在冰上以悬浮状态保存数小时，然后再进行接种。接种后，培养的肝细胞需要数小时才能贴壁并伸展。在贴壁培养基中孵育2小时后，肝细胞仍保持较小且呈圆形。经过过夜孵育后，肝细胞将呈现更具特征性的六边形形态，其中许多细胞为双核。如果细胞制备状态不佳，则会表现出大量颗粒化现象以及偶发的膜泡化，这是细胞死亡的征象。为最大程度维持培养细胞的活力，应每24小时更换一次培养基，并注意尽量减少细胞暴露于开放空气中的时间。
棕榈酸钠在室温下不溶于水，但在70 °C孵育后应完全溶解。恢复至室温会导致脂质迅速固化，因此必须快速操作。一旦棕榈酸钠溶解于预孵育培养基中，必须将培养基保持在37 °C，以维持脂质的溶解状态。
<p class="jov...

非酒精性脂肪性肝病是西方化社会中肝病的主要病因之一1,2肝脏内脂质蓄积通过尚不明确的机制与细胞死亡、纤维化及肝功能衰竭相关3-6在脂肪肝疾病中，肝细胞介导的β-脂肪酸氧化和 从头合成 脂质生成是净脂质积累的重要决定因素7,8因此，本文将重点介绍肝细胞的分离，随后进行β-脂肪酸氧化的定量分析 从头合成 脂质生成
已开发出多种方法用于研究肝细胞脂质代谢。尽管可以测定脂肪代谢 体内 使用稳定同位素9,10这些方法成本较高，且需要使用大量动物。此外，由于其性质所限，对外源性化学物质效应的研究能力也受到限制 体内 实验。相比之下，从小鼠肝脏中分离原代肝细胞为研究提供了一条经济可行的途径11此外，在培养的肝细胞中进行研究可使研究人员在规避活体实验困难的同时，研究不同化学物质对脂质代谢的影响。 体内 实验。最后，由于分离的肝细胞来源于单个动物的肝脏，因此可避免因遗传差异带来的干扰。
本文中，我们分离并培养肝细胞，并利用放射性标记的棕榈酸测定β-脂肪酸氧化和从头脂质生成。de novo 脂质生成的测定方法如下所述，该方案简明、有效且可重复。

<table><tbody><tr><td>肝脏灌注培养基</td><td>Life Technologies</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>肝脏消化培养基</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分</td><td>MP Biomedicals</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养皿</td><td>Corning Falcon</td><td>353047&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S3 管路&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>雄性鲁尔锁接头转200卡套连接器</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G × 3/4&quot; 导管</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand Silk 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD 循环水浴箱</td><td>Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C/L 蠕动泵</td><td>MasterFlex</td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>微型钳</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>在高压灭菌器中预先灭菌</td></tr><tr><td>5&amp;rdquo; 直型钝头手术剪</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>在高压灭菌器中预先灭菌</td></tr><tr><td>24 mm 刀片直型尖头显微解剖剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>在高压灭菌器中预先灭菌</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 0.8 mm 尖端显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>在高压灭菌器中预先灭菌</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 0.8 mm 尖端全弯显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>在高压灭菌器中预先灭菌</td></tr><tr><td>60 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000、200、20 &amp;mu;l 移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

肝脏中的脂质代谢十分复杂。除了通过脂蛋白进行脂质的摄取和输出外，肝细胞还可通过脂肪酸氧化来分解脂质，或通过从头脂质生成（de novo lipogenesis）合成新的脂质。这些代谢通路的净效应受多种因素调控，在某些疾病状态下可导致脂肪肝病的发生。肝脏内过量的脂质积聚与全身性胰岛素抵抗及冠心病密切相关。研究肝细胞脂质代谢的工具对于理解肝脏脂质代谢在特定代谢紊乱中的作用具有重要意义。
在肝脏中，肝细胞通过β-脂肪酸氧化调控脂肪酸的分解与合成 从头合成 脂质生成。对这些通路中的代谢进行定量分析有助于深入了解肝脏对脂质的处理过程。与 体外 定量分析，使用原代肝细胞，进行测量 体内 在技术上具有挑战性且资源消耗较大。因此，定量β-脂肪酸氧化和 从头合成 在培养的小鼠肝细胞中研究脂质生成是评估肝细胞脂质代谢的简便方法。 
本文介绍了一种分离原代小鼠肝细胞的方法，并展示了利用放射性标记底物定量β-脂肪酸氧化和从头脂肪生成的方法。

肝细胞分离通常可获得 1 - 3 x 107 个总细胞。经过过夜培养后，细胞呈六边形，其中许多为双核细胞（图2）。健康的细胞应无颗粒状物或膜泡，这些结构是细胞死亡的标志。
通常，每种测试化合物的脂肪酸氧化实验需进行三到四个重复。CO2 样品的计数值大约为酸可溶性物质计数值的五分之一。我们通常将 CO2 与酸可溶性物质的比值作为完全氧化程度的衡量指标（即通过三羧酸循环氧化的量）。能够促进细胞呼吸的物质，例如羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP），会使该比值向 CO2 方向偏移，表明三羧酸循环（TCA循环）的氧化作用增强。呼吸链抑制剂则会整体降低氧化水平（图3）。在首次开展该实验时，最好设置无细胞对照，以验证实验操作所产生的活性确实来源于细胞特异性反应。
脂肪生成检测通常与零时间点对照（在收获前立即用底物处理的细胞）进行比较。该检测在至少四小时的孵育时间内应呈现与时间的...

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。

肝脏中的脂质代谢十分复杂。除了通过脂蛋白进行脂质的摄取与输出外，肝细胞还可通过脂肪酸……氧化脂质

本实验的总体目标是评估原代小鼠肝细胞中的脂肪酸代谢。首先用消化培养基灌注小鼠肝脏并将其取出，随后分离肝细胞，以此实现该目标。第二步是在胶原包被的培养板上培养肝细胞。接下来，将肝细胞进行待检测的实验干预处理。最后一步是在存在放射性标记底物的情况下孵育细胞。最终，通过液体闪烁分析来显示各种药理学或遗传学干预对原代肝细胞中脂肪酸氧化或脂质生成的影响。该方法有助于解答代谢与糖尿病研究领域中的若干关键问题，包括特定的药理学和遗传学干预如何影响肝细胞生物学特性。对该方法进行可视化演示至关重要，原因有二：一是影响肝细胞活性的特定灌注条件较难获得，二是需要对释放的二氧化碳进行定量分析。气体的性质并不直观。本实验操作将由我实验室的研究生 Tom Akey 进行演示。将无菌管的一端放入预热的肝脏灌注培养基中，另一端放入废液容器中，以完成蠕动泵的安装。运行泵直至整段管路充满培养基。在处死目标小鼠后，用70%乙醇充分喷洒小鼠腹部。然后使用钝头剪刀沿腹部中线切开皮肤，切口长度与腹部相当，并将皮肤向两侧翻开。在腹膜上做一类似切口以暴露内脏。使用钝器轻柔地移开肠管。为暴露腹部血管系统，找到下腔静脉腹段，在肾静脉远端的血管下方穿过缝线，并在缝线远端操作。将针头和导管插入下腔静脉，并推进至结扎线远端。保持针头位置不变，用缝线在导管周围打结以固定其位置，然后小心移除针头。若操作正确，血液将通过导管流入移液管。用灌注液填充导管的剩余部分，并确保其中无气泡存在。然后小心地将管路连接至导管。接着，使用尖头剪刀谨慎刺穿膈膜，并做一侧向切口以暴露胸膜腔。注意避开胆囊和胸膜血管，在肝静脉近端处的胸腔下腔静脉上放置一个 bulldog 夹。然后剪断门静脉，并以每分钟 3 至 4 毫升的速度启动泵。使用约 20 毫升灌注液，以肝脏灌注培养基对肝脏灌注 5 分钟。在此期间，观察肝脏颜色由红色迅速变为灰褐色。若肝脏部分区域仍呈红色，则表明灌注效果不佳，成功分离的可能性将显著降低。完成五分钟灌注后，停止泵流，将管路转移至肝脏消化液中。重新启动泵，以每分钟3至4毫升的速度继续灌注肝脏10到15分钟，直至灌注液耗尽。灌注结束时，停止泵的运行。肝脏应呈粉红色，且看起来略有肿大。此时，应通过仔细解剖切除肝脏。将其转移至一个10厘米的组织培养皿中，并移除胆囊。接下来，向肝脏中加入10毫升铺板培养基，开始用手术刀轻轻刮取肝脏。为分离肝细胞，使用孔径100微米的细胞滤网过滤悬液，并将其转移至50毫升锥形管中。用额外的10毫升铺板培养基冲洗培养板，并将液体吸入50毫升锥形管中。然后在 4 摄氏度下以 350 × g 离心 5 分钟收集细胞，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 毫升铺板培养基中。接着，轻轻加入 10 毫升涂覆有聚乙烯吡咯烷酮的 90% 胶体二氧化硅，混匀后再次按前述方法离心收集细胞。离心后，吸除混合物顶部漂浮的死细胞层。然后用20毫升铺板培养基将活细胞沉淀洗涤两次。将最终的细胞沉淀重悬于10毫升铺板培养基中，使用血细胞计数板计数细胞，并将每孔90,000个细胞接种至胶原蛋白包被的24孔培养板中，在开始实验前，于37°C和5% CO₂条件下孵育2小时，或孵育16至20小时。用预热的PBS洗涤细胞两次，并将细胞更换至无血清的饥饿培养基中，培养基中加入20纳米的胰高血糖素。在检测当天早晨之前，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。配制预孵育培养基，然后更换为无血清饥饿培养基。将细胞在此混合培养基中于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。在孵育结束前约15分钟，通过氮气蒸发使每个孔中的0.5微居里C14棕榈酸酯干燥。将C14棕榈酸酯用0.1 N氢氧化钠溶液重悬，用量为每微居里12.5 µL，于70 °C孵育10分钟。然后加入三倍体积的预热孵育培养基，通过移液上下吹打混匀。通过轻轻摇动培养板，向每个孔中加入 25 微升稀释的 C 14 棕榈酸混合物，并在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。此板即为检测板。在孵育期间，取一个无菌的 24 孔板，移除盖子，在每个孔底部放入一块 2 厘米 × 2 厘米的滤纸。然后使用一个大型矩形物体（如移液器吸头盒）将一块 4 英寸 × 7 英寸的帕拉膜覆盖在板上。用多孔板上的孔摩擦对位膜，使对位膜在孔口处穿孔，并在板的其余部分形成密封。然后移除穿孔的对位膜圆片。现在，在孵育结束前10分钟覆盖各孔，向滤纸板的每个孔中加入200 µL的三当量氢氧化钠，确保滤纸完全吸收所有液体。孵育结束后，将检测板在液氮中迅速冷冻。接着，向检测板的每个孔中加入100 µL 70%高氯酸。立即用滤纸板覆盖，并将板置于轨道摇床上。 将培养板在室温下以80 RPM的转速振荡两小时。然后通过将滤纸片转移至含有4毫升液体闪烁液的闪烁瓶中，测量二氧化碳的含量，并使用闪烁计数器检测C 14信号以测定酸可溶性物质。取400微升培养基转移至1.5毫升微量离心管中，在最大转速下离心10分钟，然后将100微升上清液加入500微升氯仿与甲醇按2:1比例配制的混合液中。短暂涡旋混合物，然后向混合物中加入250微升水并再次涡旋。再次以1000 × g离心样品10分钟。随后将上层相的200微升转移至含有4毫升液体闪烁液的闪烁瓶中，并在细胞血清饥饿处理后检测C 14信号。将细胞更换至脂肪生成培养基中。加入待检测的任何目标化合物，37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育细胞2小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，然后每孔加入120微升0.1 N盐酸裂解细胞。用细胞刮刀刮取各孔以释放裂解液，随后将100微升裂解液转移至1.5毫升微量离心管中。接下来，向每根试管中加入 500 µL 氯仿与甲醇按 2:1 比例配制的混合液。短暂涡旋振荡，然后在室温下孵育 5 分钟。孵育结束后，加入 250 µL 水，涡旋振荡，再将样品在室温下额外孵育 5 分钟。然后以3000 ×g离心样品10分钟。小心将分离后液体的下层转移至含有4毫升液体闪烁液的闪烁瓶中，并使用闪烁计数器测定氚的放射活性。该步骤通常可从每只小鼠分离得到1000万至3000万个肝细胞。经过过夜培养后，健康的细胞呈六边形，其中许多细胞含有细胞核。不健康的细胞培养物通常含有颗粒物或出芽泡，这些是细胞死亡的标志。此处展示了一项脂肪酸氧化实验的结果，通过比较添加F-C-C-P-A细胞呼吸促进剂和呼吸抑制剂寡霉素与溶剂对照组，以测定完全氧化水平。计算了二氧化碳与酸溶性物质的比值。促进细胞呼吸的物质（如FCCP）会使得该比值向二氧化碳方向偏移，表明三羧酸（TC.A）循环中的氧化作用增强。当检测时，呼吸链的抑制剂会整体降低氧化水平。对于脂质活性化合物而言，能够增强脂肪酸氧化的物质（如FCCP）或减少ATP合成的物质（如寡霉素），与溶剂对照组相比，会降低培养的肝细胞中的脂质活性。在进行该操作时，重要的是确保在动物处死后立即并充分地完成灌流过程。此外，在进行脂肪酸氧化检测时，培养基的完全冻结对于二氧化碳气体的可重复测量至关重要。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离原代肝细胞，并利用这些细胞在体外分析脂肪酸氧化和脂质生成。

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生物学

在小鼠原代肝细胞测定脂肪酸氧化和脂肪生成的

此处优化了生成方法 体内 和 体外 描述了肝脂肪变性模型的建立方法，以及对脂肪变性表型和相关生理参数的分析。...

优化分析 体内 和 体外 肝脂肪变性

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评估小鼠全身脂质处理能力

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小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

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