Name: Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie die selektive Depletion von Mikroglia aus primären Kleinhirn-Körnerzellkulturen mittels L-Leucin-Methylester. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Funktionen ohne mikroglialen Einfluss.

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Diese Forschung wurde durch ein Aims2Cure, UK und ein UCL Impact Award Ph.D. Stipendium für JMP und ein MRC Capacity Building Ph.D. Stipendium in Demenz für JMP unterstützt.

Alle hierin beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 durchgeführt. 1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Bereiten Sie zwei Edelstahl Labor Präparierscheren und zwei Edelstahl-Laborzangen. Autoklaven alle Instrumente und in eine Kultur Haube O / N unter ultraviolettem Licht (UV) Licht für die Sterilisation. </li><li> Bilden 500 ml Minimum Essential Medium (MEM) Kulturmedium (10% Fötales Rinderserum [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 6 &amp; mgr; g / ml Ampicillin) und Filter zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C für Monate. </li><li> Bereiten Sie 24 Well-Kulturplatten mit 14 mm, die Nummer 1 Dicke Deckgläser. Autoklaven werden die Deckgläser und Mantel in 100 mg / l Poly-D-Lysin (PDL), wie vorstehend beschrieben 3. UV-Licht sterilisiert O / N. </li></ol> 2. Herstellung von CGC Kulturlösungen <ol><li> Vorbereiten &quot;Lösung A&quot; (100 ml) in autoklavierten, UV-Licht behandelt, steriles dH &amp; sub2; O, enthaltend 250 mg Glukose, 300 mg Rinderserumalbumin [BSA], 955 mg phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] (Ca 2+ und Mg + free), und 1 ml 3,8% MgSO 4 · 7 H 2 O. </li><li> Vorbereiten &quot;Lösung B&quot; (10 ml), die 1 ml 5 mg / ml Trypsin in 9 ml Lösung A verdünnt </li><li> Vorbereiten &quot;Lösung C&quot; (10 ml), enthaltend 1.000 Einheiten DNase, 0,5 mg Sojabohnentrypsininhibitor, 100 &amp; mgr; l 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, 10 ml mit Lösung A. verdünnt </li><li> Vorbereiten &quot;Lösung D&quot; (20 ml), die 3,2 ml der Lösung C auf 20 ml mit Lösung A. verdünnt </li><li> Vorbereitung Balanced Salt Solution (EBSS) Lösung BSA / Earles enthaltende EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, und4% BSA, pH 7,4, wie zuvor beschrieben, 3. </li><li> Bereiten LME durch Zugabe von reinem LME in 5 ml MEM Kulturmedium, um eine Endkonzentration von 150 mM LME zu geben, zurück die Lösung auf pH 7,4 mit einem pH-Meter Tisch Modell und Filter-sterilisiert unter Verwendung eines 28 mm Polyethersulfon (PES) 0,2 um Spritzen Filter. </li></ol> 3. Kultivierung der BVKA <ol><li> Sammeln cerebella 4-7 Tage alten Rattenjungen, wie zuvor beschrieben 3. Platzieren Sie sofort in Petrischale mit 5 ml Lösung A auf Eis. </li><li> Gießen Sie überschüssige Lösung von Kleinhirne und Ort Gewebe in der Petrischale Deckel. </li><li> Zerhacken Gewebe fein mit einer gut geflammt Rasierklinge in mindestens drei verschiedenen Richtungen. </li><li> Gehackte Gewebe zu Lösung B (rinse Petrischale mit Lösung begrenzte Gewebe sicherzustellen geht verloren) und im Wasserbad bei 37 ° C für 5 min. Vorsichtig schütteln alle paar min. </li><li> In Lösung D (20 ml) zu dem Rohr, um das Trypsin, schütteln und Cent zu neutralisierenrifuge bei 65 × g für 5 min. </li><li> Überstand abgießen. </li><li> Resuspendieren in 4 ml Lösung C Man reibt gut (ca. 10 mal) mit je drei geflammten Glaspipetten mit abnehmendem Durchmesser, bis die Suspension so homogen wie möglich ist. </li><li> Langsam und vorsichtig ein paar Tropfen dieses Homogenats auf dem BSA / EBSS. Wenn es beginnt, durch die BSA / EBSS Spüle, verreiben mehr und / oder fügen Sie ein wenig mehr Lösung C. Das Homogenat sollten in einer Schicht auf der Oberseite des BSA / EBSS sitzen. Nicht schütteln. Spin bei 100 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet (weich) in 1 ml MEM-Medium. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei 800.000 Zellen / Deckglas in 500 &amp; mgr; l MEM-Medium. In einem Brutschrank bei 37 ° C unter 6% CO 2. </li><li> Ändern Sie den folgenden Tag (24 bis 36 Stunden nach der prep) des Mediums. Stellen eine Lösung von MEM-Medium mit 10 &amp; mgr; M des Zellzyklus-Inhibitors arabinofuranosyl Cytidin (AraC). <ol><li> Für jedenDeckglas, behalten 250 ul des alten Mediums in einem frischen 24-Well-Platte, saugen Sie den Rest, fügen Sie 250 ul normalen MEM-Medium und saugen Sie diese, um die Zellen zu waschen, dann die 250 ul alte Medium zurück in den Zellen und füllen mit 250 ul AraC enthaltenden Medium. Hinweis: Zellen kann von 6 Tagen in vitro (DIV) verwendet werden. </li></ol></li></ol> 4. Wahlweise zum Abbau der Mikroglia (Durchgeführt bei 6 DIV) <ol><li> Hinzuzufügen reinen LME bis 5 ml eines separaten Aliquot MEM-Medium auf eine Endkonzentration von 150 mM LME ergeben. </li><li> Rückkehr der Lösung auf pH 7,4 und mit einem Filter sterilisiert 28 mm Polyethersulfon (PES), 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter filtriert. </li><li> Verdünnte Lösung auf eine Konzentration von 50 mM (2 x LME) in MEM-Medium und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 10 min mit dem normalen MEM Medium für Kontrollkulturen. </li><li> Entfernen Sie die Hälfte (250 ul) der MEM-Medium von CGC Kulturen und bei 37 ° C zu halten. </li><li> Treat-Zellenmit MEM-Medium, das 2 x LME (250 ul), das heißt 1: 1 verdünnt hat ein schönes Konzentration von 25 mM oder mit vorgewärmter MEM-Medium ohne LME (250 ul) für Kontrollkulturen. </li><li> Zellen bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6% CO 2 für 1 Stunde. </li><li> Wash Zellen zweimal in frischem vorgewärmten MEM-Medium zu LME haltigen Medien zu entfernen, und ersetzen Sie dann den gehaltenen Kulturmedium und ein gleiches Volumen an frischem vorgewärmten MEM-Medium in die entsprechenden Wells. </li><li> Zurück Kulturen in den Inkubator (mit 6% CO 2 bei 37 ° C befeuchtet) ruhen lassen für 24 h vor der weiteren Behandlung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die wichtigsten Schritte, um die erfolgreiche selektive Elimination von Mikroglia CGC sichern und / oder Mischkulturen sind: 1) die Aufrechterhaltung einer sterilen und gesunde CGC Kultur; 2) Sterilfiltrieren der LME haltigen Medium und Rückführen der Lösung auf pH 7,4; 3) halten die beibehalten CGC Medien und LME haltigen Medien bei 37 ° C, um Hitzeschock zu vermeiden; und 4) schnell arbeiten, um die Zeit-Zellen werden außerhalb des Inkubators gehalten zu reduzieren. Wir haben ...

Das menschliche Gehirn enthält schätzungsweise 85 Milliarden Neuronen und eine weitere 85 Milliarden nicht-neuronalen Zellen, sowie Glia 1. Daher der griechischen Etymologie &quot;Glia&quot; übersetzt in englisch als - zum größten Teil von den letzten 100 Jahren haben Neurowissenschaftler überwiegend auf der neuronalen Zellpopulation konzentriert, zu glauben, Gliazellen auf wenig mehr als passive Stützzellen, die strukturelle Unterstützung für den Neuronen vorgesehen sein &quot;Leim&quot;. In jüngster Zeit wurde es jedoch zunehmend offensichtlich geworden, dass neuronale-glial Wechselwirkungen können weitaus Grund grundlegende Aspekte der Neurobiologie, Neurophysiologie und der Entstehung und Progression von vielen neurodegenerativen Krankheiten. Kleinhirn-Körnerzellen (BVKA), die am häufigsten vorkommende homogene neuronalen Population im menschlichen Gehirn, dominieren das Kleinhirn und machen mehr als 90% der Zellbestandteile. Folglich wurden diese Zellen ausgiebig in vitro als Modellsystem für T verwendeter studieren der neuronalen Entwicklung, Funktion und Pathologie 2-6. Allerdings enthalten CGC Kulturen noch Mikroglia und anderen Glia in wohl signifikante Anteile. Als Ergebnis CGC Daten mutmaßlich Anzeige direkten neuronalen Reaktionen auf verschiedene Zellen Behandlungen können in der Tat ergeben - teilweise oder insgesamt - aus dem indirekten sekundäre Antwort benachbarter Glia in der Kultur. Um dies zu beurteilen, haben wir selektiv abgespalten Mikroglia von CGC neuronalen Kulturen mit Hilfe von L-Leucinmethylester (LME). LME ist ein lysomotropic Mittel ursprünglich benutzt, um selektiv Makrophagen 7 zerstört und seit verwendet worden, um auch selektiv abzureichern Mikroglia aus neuralen, Astrozyten und gemischten Gliakulturen 8.9.10. LME wird von Makrophagen und Mikroglia verinnerlicht, bei dem es lysosomalen Unterbrechung und anschließender Apoptose 13,14 bewirkt. Makrophagen und Mikrogliazellen sind charakteristischerweise reich an Lysosomen, wodurch sie particula seinrly anfällig bei Exposition gegenüber LME Behandlung. Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke und dennoch einfache und einfache Möglichkeit, den Beitrag der Mikroglia in Experimenten unter Verwendung von CGC und andere neuronale / Gliazellen Kultursystemen zu ermitteln.

<table><tbody><tr><td>Pinzette&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Das gebogene Ende erleichtert die Entfernung des Kleinhirns&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>Gerade, scharfe Spitze erleichtert das Präparieren von Nagetieren P4-7&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Leucinmethylesterhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>EBSS-Lösung&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Deckgläser 1 Tag vor Gebrauch&nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-ED1 Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

selektive depletion von mikroglia von kleinhirn-körnerzellkulturen mit l-leucin-methylester

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Mikroglia, die residenten immunkompetenten Zellen des ZNS, spielen eine vielfältige Rolle bei der Modulation und Kontrolle der neuronalen Funktion sowie bei der Vermittlung der angeborenen Immunität. Primäre Zellkulturmodelle von Nagetieren haben unser Verständnis der neuronal-glialen Interaktionen erheblich verbessert, aber erst in jüngster Zeit wurden Methoden zur gezielten Eliminierung von Mikroglia aus Mischkulturen eingesetzt. Eine solche Technik – die hier beschrieben wird – ist die Verwendung von L-Leucinmethylester, einem lysomotropen Mittel, das von Makrophagen und Mikroglia internalisiert wird, wobei es eine lysosomale Störung und anschließende Apoptose verursacht13,14. Experimente mit L-Leucinmethylester haben die Möglichkeit, den Beitrag von Mikroglia zur umgebenden zellulären Umgebung unter verschiedenen Kulturbedingungen zu identifizieren. Anhand eines in unserem Labor optimierten Protokolls beschreiben wir, wie Mikroglia aus P5-Kleinhirn-Körnerzellkulturen von Nagetieren eliminiert werden können. Dieser Ansatz ermöglicht es, den relativen Einfluss von Mikroglia auf experimentelle Daten zu bewerten und zu bestimmen, ob Mikroglia eine neuroprotektive oder neurotoxische Rolle in Kulturmodellen für neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer oder Parkinson spielen.

Die Fähigkeit dieser Technik selektiv zu eliminieren Mikroglia CGC und / oder Mischkulturen beruht auf der nachfolgenden Fähigkeit des Untersuchers genau zu identifizieren und zu differenzieren Mikroglia aus ihrer umgebenden Zellen. Dies kann mit einer Mikroglia-spezifischen Zellmacher, wie isolectin-B4 erreicht werden, wie in 1 dargestellt. Wie in Figur 2 gezeigt, wurden keine beobachtbaren Änderungen in Astrozyten und neuronalen Dichte und Morphologie in Bezug auf jede Hauptbehandlung...

Mikroglia können Neuronen und andere Gliazellen in Kultur durch verschiedene nicht-zellautonome Mechanismen beeinflussen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Mikroglia selektiv aus primären neuronalen Kulturen zu depletieren. Diese Methode hat das Potenzial, die Rolle von mikroglial-neuronalen Interaktionen aufzuklären, mit Auswirkungen auf neurodegenerative Erkrankungen, bei denen Neuroinflammation ein charakteristisches Merkmal ist.

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mikrogliazellen selektiv aus Körnerzellenkulturen zu entfernen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population von Körnerzellen kultiviert und bei 37 Grad Celsius mit 6 % Kohlendioxid in einem Inkubator gelagert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Lösung von LME in MEM-Medium herzustellen, um eine Endkonzentration von 150 Millimolar LME zu erhalten.Die zweite Hälfte des MEM-Mediums aus den CGC-Kulturen wird entfernt und im Inkubator aufbewahrt, und die CGC-Kulturen werden anschließend durch ein gleiches Volumen von LME, das MEM-Medium enthält, ersetzt und für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 6 % Kohlendioxid in den Inkubator gestellt. Der letzte Schritt besteht darin, die CGC-Kulturen zweimal mit frischem vorgewärmtem MEM-Medium zu waschen.Ersetzen Sie das zurückgehaltene Kulturmedium durch ein gleiches Volumen frischen Mediums und kehren Sie die Zellen anschließend für 24 Stunden in den Inkubator zurück, bevor weitere Behandlungen durchgeführt werden. Abschließend wird mithilfe der Immunchemie und der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt, dass Mikrogliazellen spezifisch aus den Zerebellarkörnerzellkulturen entfernt wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise welche Wirkungen Mikroglia unter verschiedenen Bedingungen auf Neuronen haben und welche Bedeutung diese Effekte für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit und der Parkinson-Krankheit besitzen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da die Arbeit mit Primärkulturen Genauigkeit und Schnelligkeit erfordert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Kleinhirne von vier bis sieben Tage alten Rattenwürfen sammeln. Legen Sie diese unverzüglich in eine Petrischale, die fünf Milliliter Lösung A auf Eis enthält.Entfernen Sie anschließend überschüssige Lösung von den Kleinhirnen und legen Sie das Gewebe in den Deckel der Petrischale. Danach zerkleinern Sie das Gewebe fein mit einer scharfen Rasierklinge in mindestens drei verschiedenen Richtungen. Fügen Sie das zerkleinerte Gewebe anschließend zur Lösung B hinzu. Geben Sie es für fünf Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es alle paar Minuten leicht.Anschießend 20 Milliliter Lösung D zum Röhrchen hinzufügen, um die Trypsin-Behandlung zu neutralisieren, und zehn Minuten bei 60 × g zentrifugieren. Danach das überschüssige Überstand-Supernatant abgießen. Den Pellet in vier Milliliter Lösung CT tri resuspendieren und die Probe jeweils zehnmal mit jedem der drei ausgeglühten Glaspipetten abwechselnd abnehmender Durchmesser umsetzen, bis die Suspension so homogen wie möglich ist.Fügen Sie anschließend langsam und vorsichtig einige Tropfen dieses Homogenats auf die B-S-A-E-B-S-S, falls es beginnt, durch die B-S-A-E-B-S-S-T-Trilösung zu sinken; geben Sie etwas mehr Lösung C hinzu. Das Homogenat sollte als Schicht auf der B-S-A-E-B-S-S liegen bleiben. Zentrifugieren Sie es fünf Minuten bei 100 G und schütteln Sie nicht. Entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet.In einem Milliliter MEM-Medium zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers und säen Sie sie mit einer Dichte von 800.000 Zellen pro Deckglas aus. Danach fügen Sie 500 Mikroliter MEM-Medium hinzu und stellen Sie sie in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 6 % Kohlendioxid. Bereiten Sie anschließend eine Lösung aus MEM-Medium vor, die 10 Mikromolar des Zellzyklusinhibitors RC enthält. Für jedes Deckglas bewahren Sie 250 Mikroliter des alten Mediums in einer neuen 24-Loch-Platte auf und aspirieren den Rest.Gebe 250 µL normales MEM-Medium hinzu, um die Zellen zu waschen. Danach 250 µL altes Medium zurück zu den Zellen geben und mit 250 µL RSE-haltigem Medium auffüllen. In diesem Verfahren wird reines LME zu fünf Millilitern MEM-Medium hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 150 mmol/L LME zu erreichen.Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer sauerstoffbasierten Lösung auf 7,4 ein. Anschließend filtrieren Sie sie steril durch einen 28 Millimeter großen PES-Spritzenfilter mit 0,2 Mikrometer Porengröße. Verdünnen Sie danach die LME-Lösung auf eine Konzentration von 50 Millimolar in MEM-Medium.Danach 10 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius stellen, zusammen mit normalem MEM-Medium für Kontrollkulturen. Nach 10 Minuten 250 Mikroliter des MEM-Mediums aus jeder CGC-Kultur entnehmen. Anschließend das Medium bei 37 Grad Celsius aufbewahren.Als Nächstes behandeln Sie die Zellen mit MEM-Medium, das zweifache LME enthält, oder mit vorgewärmtem MEM-Medium ohne LME. Für die Kontrollkulturen inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 6 % Kohlendioxid. Anschließend waschen Sie die Zellen zweimal mit frischem, vorgewärmtem MEM-Medium, um das LME-haltige Medium zu entfernen. Danach ersetzen Sie das zurückgehaltene Kulturmedium durch eine gleiche Menge frisches, vorgewärmtes MEM-Medium.Zuletzt inkubieren Sie die Kulturen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer mit 6 % Kohlendioxid befeuchteten Atmosphäre, bevor weitere Behandlungen erfolgen. Diese Abbildung zeigt repräsentative Bilder aus den Experimenten an CGC-Kulturen nach der Behandlung mit 25 bis 75 Millimolar LME für eine Stunde, gefolgt von einer Waschung. Die Immunchemie wurde mit DPI zur Quantifizierung der Gesamtzellzahl und der Zellen mit apoptotischer Morphologie sowie mit ISO-Lektin B4 zur Identifizierung und Quantifizierung von Mikrogliazellen durchgeführt. Dieses Diagramm zeigt die Quantifizierung der Zellen mit apoptotischer Morphologie. Dargestellt sind hier die repräsentativen Bilder aus den Experimenten an CGC-Kulturen nach einer einstündigen Behandlung mit 25 Millimolar LME.Die Immunchemie wurde mit DAPI-Anti-Beta-3-Tubulin zur Identifizierung von Veränderungen in der neuronalen Dichte und mit Anti-GFAP zur Identifizierung von Veränderungen in der astrogliären Dichte und Morphologie durchgeführt. Die Negativkontrollbilder stellen CGC-Kulturen dar, bei denen die primären Antikörper weggelassen wurden. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

selective-depletion-microglia-from-cerebellar-granule-cell-cultures

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Video demonstriert eine Technik zur Isolierung von Mikroglia aus der Rinde eines erwachsenen Mäusegehirns. Zunächst wird der Kortex segmentiert und homogenisiert, um Neuronen und andere Gliazellen zu entfernen und die Mikroglia zu erhalten. Anschließend wird die Zellsuspension magnetischen Anti-Myelin-Mikrokügelchen und einem Magnetfeld ausgesetzt, wodurch Mikroglia und myeloische Zellen effektiv von Myelin-Trümmern und myelinhaltigen Zellen getrennt werden.

Isolierung von Mikroglia aus der Hirnrinde eines adulten Mausgehirns

Dieses Video demonstriert die Technik zur Isolierung und Kultivierung von primären Kleinhirn-Körnerneuronen der Maus. Die Zellen werden mit einem Antimetaboliten behandelt, um proliferierende Gliazellen zu eliminieren und eine Reinkultur von Kleinhirn-Körnerneuronen zu erzeugen.

Isolierung und Kultivierung von primären zerebellären Körnerneuronen der Maus

Dieses Video zeigt eine Technik zur selektiven Entnahme von Mikroglia aus einer primären neuronalen Rattenkultur. Kleinhirngranulaneuronen werden mit einem Antimetaboliten behandelt, um proliferierende Gliazellen zu eliminieren. Zusätzlich werden sie mit Lysosomen-Targeting-Wirkstoffen behandelt, um Mikroglia aus der Kultur zu entfernen.

Selektive Entnahme von Mikroglia aus einer Kleinhirn-Neuronenkultur der Ratte

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Extraktion von Mikrogliazellen aus demyelinisierenden Läsionen in Mäusegehirnen mittels magnetischer Zellsortierung. Das Protokoll umfasst das Präparieren des läsionierten Hirngewebes, das Mikrogliazellen enthält, die Behandlung des Gewebes mit spezifischen Enzymen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und die Verwendung von Mikrogliarezeptor-spezifischen magnetischen Kügelchen zur Isolierung der Mikrogliazellen.

Isolierung von Mikroglia aus demyelinisierenden Läsionen des Mausgehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Dieses Video zeigt die Generierung eines neuronalen Verletzungsmodells unter Verwendung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in primären Kleinhirn-Körnerneuronen der Maus. Es beschreibt den Prozess der Induktion von oxidativem Stress durch Zugabe hoher Konzentrationen von Wasserstoffperoxid. Die ROS-Exposition führt zu DNA-Strangbrüchen und genomischer Instabilität. Darüber hinaus beeinträchtigt die Oxidation zellulärer Proteine deren Funktionen, während die Lipidperoxidation die Integrität...

Modellierung des durch reaktive Sauerstoffspezies induzierten neuronalen Todes in zerebellären Körnerneuronen der Maus

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Lernen Sie die selektive Depletion von Mikroglia aus primären Kleinhirn-Körnerzellkulturen mittels L-Leucin-Methylester. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Funktionen ohne mikroglialen Einfluss.

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

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