Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Mausbecher für Zellen in großer Zahl zu isolieren und zu reinigen, um die Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. Dies wird durch die Perfusion von Mauslebern mit einer H-B-S-S-E-G-T-A-Lösung und einem Kollagen, einer Lösung zur schonenden Verdauung des Lebergewebes, erreicht. Anschließend werden Leberzellen durch Dichte, Zentrifugation und selektive Adhäsion gereinigt, um eine Kultur aus gereinigtem Becher für Zellen zu erhalten.

Dann wird eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt, um die Reinheit und die sauren F-Eigenschaften des Bechers für Zellen zu bestätigen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die Toxizität von funktionalisierten Kohlenstoffnanoröhren in Bechern für Zellen gemessen werden kann. Basierend auf dem modifizierten L-D-H-S-A, der dies unterstützt, kann dieses Modell auf die Toxizitätsprüfung von Nanopartikeln angewendet werden.

Die Methode, die wir Ihnen heute zeigen möchten, kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Nanotoxikologie zu beantworten, wie z. B. die Bewertung der Toxizität kürzlich entwickelter Wirkstoffträger, was sehr wichtig ist, da die meisten der verwendeten immortalisierten Zelllinien signifikant andere Eigenschaften aufweisen als Gewebe, aus denen sie stammen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Wenn die Methode erfolgreich durchgeführt wird, führt sie zu einer hohen Ausbeute und Reinheit der ke-Zellen, die dann als Modell verwendet werden können, um eine Reihe von Nanopartikeln auf diese Toxizität zu untersuchen.

Nach der frischen Zubereitung aller Reagenzien, die in der Tabelle der Materialien und Reagenzien mit dem begleitenden Textprotokoll aufgeführt sind, erwärmen Sie die E-G-T-A-H-B-S-S-S-Lösung und die Kollagenaselösung 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius und verwenden Sie 70%iges Ethanol, um den flexiblen Schlauch der Pumpe zu spülen. Gießen Sie dann 40 Milliliter E-G-T-A-H-B-S-S-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen, das in das Wasserbad eingetaucht ist, und spülen Sie den flexiblen Schlauch der Pumpe mit dem vorwärmten E-G-T-A-H-B-S-S aus. Nach dem Einschläfern einer Zöliakie-Maus gemäß dem Textprotokoll rasieren Sie die Bauchhaare und verwenden Sie 70% Ethanol, um die Bauchoberfläche zu desinfizieren.

Bestätigen Sie die Anästhesie durch Einklemmen der Zehen. Schneiden Sie durch die Bauchhöhle und legen Sie die Pfortader und die untere Hohlvene frei, indem Sie den Darm seitlich nach links vom Bauch bewegen. Starten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von ein bis drei Millilitern pro Minute mit E-G-T-A-H-B-S-S-Lösung und kanülieren Sie mit einer 23-Gauge-Schmetterlingsnadel die Pfortader, klemmen Sie den kanülierten Abschnitt der Pfortader ein und drehen Sie dann die Sinuszange an der Oberfläche des geöffneten Mausbauchs um.

Die Leber sollte innerhalb der ersten 30 Sekunden der Perfusion blass werden, den unteren Teil der unteren Hohlvene schnell einschneiden, um einen Überdruck in der Leber zu vermeiden, und die Flussrate in der ersten Minute der Perfusion allmählich auf sieben Milliliter pro Minute erhöhen. Wenn weniger als fünf Milliliter E-G-T-A-H-B-S-S-S-Lösung im Zentrifugenröhrchen verbleiben. Fügen Sie 40 bis 50 Milliliter Kollagen einer Lösung hinzu und erhöhen Sie dann die Durchflussrate schrittweise auf 10 Milliliter pro Minute über 30 Sekunden.

Lassen Sie die Leber anschwellen, indem Sie mit einer Pinzette in 10- bis 32. Intervallen regelmäßig Druck auf die untere Hohlvene ausüben. Dies verbessert die Zelldissoziation und verkürzt die Perfusionszeit mit Kollagenase. Wenn weniger als 10 Milliliter Kollagenaselösung im Zentrifugenröhrchen verbleiben, geben Sie weitere 40 bis 50 Milliliter vorwarme Kollagenaselösung in das Röhrchen.

Sobald 70 bis 80 Milliliter durchblutet sind, üben Sie mit einer Pinzette leichten Druck auf die Oberfläche aus. Eine Vertiefungsmarkierung zeigt an, dass Leberzellen dissoziiert sind. Entfernen Sie die Leber in einem Stück aus der Bauchhöhle und legen Sie sie zur Zellisolierung in ein Zentrifugenröhrchen mit 20 bis 30 Millilitern Becher. Mittel.

Halten Sie Leberzellen bis zu drei Stunden lang auf Eis und legen Sie bis zu drei Lebern für die Reinigung zusammen, um den Becher für die Zellen zu reinigen. Legen Sie eine durchblutete Leber in eine Petrischale mit 15 Millilitern Becher für die Zellisolierung, Medium mit einer Schere oder Pinzette. Reißen Sie die glitzernde Kapsel auf und geben Sie alle Leberzellen in das Medium ab.

Filtrieren Sie die Lösung durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb in ein Zentrifugenröhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 GS bei vier Grad Celsius für zwei Minuten. Parenchymzellen befinden sich im Pellet und nicht-parenchymale Zellen im Überstand.

Den Überstand in einem sauberen Zentrifugenröhrchen auffangen und zwei Minuten lang bei 50 g zentrifugieren. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt vier Überweisungen und Drehungen. Nächste Zentrifuge.

Das Supernat bei 1.350 GS für 15 Minuten. Um die nicht-parenchymalen Zellen zu pelletieren, verwerfen Sie das Supernat und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Becher für Zellisolationsmedium, fügen Sie die nicht-parenchymale Zelllösung zu dem diskontinuierlichen 25 50%-isotonischen Gradienten hinzu, der zuvor gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde, und zentrifugieren Sie bei 850 GS für 15 Minuten ohne Beschleunigung oder Pause. Mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette werden etwa 12 Milliliter des angereicherten Bechers für die Zellfraktion aspiriert, die innerhalb der 25%SIP-Fraktion in der Nähe der 25 bis 50%SIP-Grenzfläche trüb erscheint.

Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen mit 35 bis 40 Millilitern Becher für die Zellisolierung, medium und mischen Sie es vorsichtig, zentrifugieren Sie dann bei 1.350 GS und vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren, entsorgen Sie das Super-Named und verwenden Sie fünf bis 10 Milliliter vorwarmes Medium, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu resuspendieren. Zählen Sie die Zellen und verwenden Sie die Trianblau-Färbung, um die Viabilitätsplatte zu messen. Die gereinigten nicht-parenchymalen Zellen werden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung gebildet.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie dann vorsichtig das Medium. Verwenden Sie vorwärmtes HBSS, um die Zellen zu waschen, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter pro Well frischen Vorwärmbecher für Zellkulturmedium.

Bringen Sie die Zellen für mindestens vier Stunden auf 37 Grad Celsius zurück, damit die Zellen vor der Behandlung mit Nanopartikeln haften können. Nach der Charakterisierung der Reinheit und phagozytären Aktivität des C für Zellen und der Inkubation mit funktionalisierten Kohlenstoffnanoröhren oder FCTs, wie im Textprotokoll beschrieben, wird der Überstand verworfen und 200 Mikroliter Lysepuffer pro Vertiefung hinzugefügt. Inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius, pipettieren Sie kräftig und sammeln Sie den liegenden Becher für die Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei 20.000 GS, um die fcn ts herauszuziehen, die von den Zellen auf den Zelltrümmern aufgenommen wurden. Sammeln Sie den Überstand in Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius. Alternativ können Sie 50 Mikroliter in eine 96-Well-Platte umfüllen und ein gleiches Volumen Substratmischlösung aus dem Laktatdehydrogenase-Kit hinzufügen.

Fügen Sie Triplikate von Blindvertiefungen hinzu, die 50 Mikroliter Lysepuffer und 50 Mikroliter Substratmischlösung enthalten. Decken Sie dann die Platte ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie 50 Mikroliter Stopplösung hinzufügen. Zum Schluss lesen Sie die Absorption bei 490 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader ab und verwenden Sie die folgende Formel, um die prozentuale Zellviabilität zu berechnen.

Diese Abbildung zeigt, dass die Anzahl der gereinigten nicht-parenchymalen Zellen zwischen acht und 14 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Maus und Trian liegt. Die Blaufärbung zeigte eine Zellviabilität von etwa 95 %. Der Adhärentbecher für Zellen nahm innerhalb von 30 Minuten nach der Inkubation eine runde Form an, und nach vier Stunden breiteten sich die Zellen aus und es begannen sich Cluster zu bilden, wie hier zu sehen.

Die Zellen wurden mit F vier 80 Antikörpern gefärbt, um die Zellreinheit zu demonstrieren, die mittels Durchflusszytometrie über 95 % gemessen wurde. Darüber hinaus zeigte eine niedrige zytometrische Analyse nach 12 Stunden in Kultur, dass 85 % der Zellen in der Lage waren, eine saure PHA-Aktivität zu entwickeln, da sie in der Lage waren, fluoreszierende Kügelchen von einem Mikrometer aufzunehmen. Diese Zahl sank jedoch nach 72 Stunden in Kultur, als nur 40% der hier gezeigten Zellen phagozytisch waren.

Becher für Zellen, die 24 und 72 Stunden lang mit funktionalisierten Kohlenstoffnanoröhren inkubiert wurden, wiesen im Vergleich zu naiven Zellen ähnliche Morphologien auf. Im Gegensatz dazu zeigte der Becher für Zellen, die mit 10 % DMSO inkubiert wurden und als Positivkontrolle verwendet wurden, eine nekrotische Morphologie. Nach der Analyse des modifizierten LDH-Assay-Bechers für Zellen, die 24 und 72 Stunden lang mit 10 % DMSO behandelt wurden, zeigte sich eine hohe Toxizität. Im Vergleich dazu induzierte fcts eine leichte, aber signifikante Verringerung der Zellviabilität erst, wenn die Zellen 72 Stunden lang 50 Mikrogramm pro Milliliter ausgesetzt waren. Nach dieser Methode können andere zellbasierte SC und alle Arten von Nanopartikeln mit isolierten ke-Zellen getestet werden.

Dies ermöglicht es, zuverlässige Daten zu sammeln und gleichzeitig den Einsatz von Tieren zu minimieren. Wir hoffen, dass diese Technik dazu beitragen kann, Forschern auf dem Gebiet der Nanotech-Psychologie den Weg zu ebnen, um die Sicherheit der vielen vielversprechenden Nanoträger zu überprüfen, die zunehmend entwickelt werden.