Name: In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie das DRG/Krebszell-Modell zur Untersuchung neuronaler Tumor-Mikroumgebungen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Krebszell-Neuron-Interaktionen und unterstützt die Entwicklung gezielter Therapien.

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Edith Suss-Toby wird für ihre Hilfe bei der Zeitraffermikroskopie und Bildanalyse gedankt. Nofar Rada wird für die künstlerische Arbeit gedankt.

nach der Vereinigung für die Bewertung und Zulassung von Labor Animal Care Spezifikationen Vier- bis Sechs-Wochen alte weibliche C57BL / CJ-Mäuse (Harlan, Jerusalem, Israel) wurden in dem Experiment verwendet. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee und das Ministerium für Landwirtschaft Vorschriften erfolgen. 1. Ernten der Spinal Cord <ol><li> Euthanize der Maus eine CO 2 Kammer mit. Vermeiden Sie Zervikaldislokation wie es Schäden an den Ganglion Wurzeln aufgrund von Scherkräften verursachen könnten. Von hier aus führen alle Schritte unter sterilen Bedingungen. </li><li> Soak Tier nach unten mit 70% Ethanol. Dieser Schritt ist wichtig für das Sterilisieren sowie für das Haar von Ziehen durch die inneren Organe zu verhindern. </li><li> Lassen Sie die Maus aus Ethanol, um zu trocknen. Vermeiden Sie den Kontakt von Ethanol mit den inneren Organen aufgrund Neurotoxizität. </li><li> Nach der Maus Trocknen positionieren sie Stifte in Bauchlage mit(Bedruckte Seite nach unten). Setzen Sie die Stifte auf beiden hinteren Gliedmaßen und forelimb. </li><li> Mit einer Pinzette, stellen einen Mittellinienschnitt kraniokaudal vom hinteren Hals zur Lendenwirbelsäule erstreckt. Dann heben Sie bilateral Pinzette dermale Klappen mit und des subkutanen Gewebes aus. </li><li> Ertasten Maus Schädel, bis die kraniozervikalen Kreuzung erreichen. Mit einer Schere senkrecht zum Tier, schneiden durch die Halsmuskulatur und der Wirbelsäule bei kraniozervikalen Übergang (der 7. Halswirbel), schwere Pinzette. Präparieren Sie die Wirbelsäule nach kaudal und die Wirbelsäule mit schweren Zange auszuschneiden, bis die Lenden- Niveau erreicht (Hinterextremitäten Ebene). </li><li> Führen Sie eine vollständige Schwanz transection an der Lendenwirbelsäule Ebene (der 5. Lendenwirbel) mit schweren Zange. </li><li> Rollen Sie mit der Maus über das (bedruckte Seite nach oben). Es besteht keine Notwendigkeit, den Einschnitt abzudecken, da die DRG vom unteren Wirbelniveaus extrahiert wird und nicht den Gebärmutterhals. </li><li> Reduzieren Sie auf der Mittellinie vom Hals bis zum Bauch, ziehen sich dieHaut seitlich und dann das Peritoneum geschnitten zu öffnen. </li><li> Entfernen Sie die inneren Organe im Inneren des Peritoneum (Leber, Milz, Bauchspeicheldrüse, Magen und Darm) en bloc. Dann entfernen Sie die retroperitonealen Organe (dh, Nieren und Bauchspeicheldrüse). Kranial, öffnen Sie die Brustwand. </li><li> Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Sie die Rippen, so dass 5 mm von Rippen bilateral weg von der Wirbelsäule. An diesem Punkt wird die Wirbelsäule von dem Rest des Körpers getrennt sind. </li><li> Waschen Sie die Wirbelsäule aus Blut mit kaltem (4 ° C) frisch phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zweimal. </li></ol> 2. Isolierung des Dorsalwurzelganglien (DRG) <ol><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit 4-fache Vergrößerung. </li><li> Positionieren Sie die Wirbelsäule auf einer nicht-haft nicht absorbierenden Plattform (Telfa / Nylon). Positionieren Sie die Wirbelsäule Gesicht in der gleichen kraniokaudale Ausrichtung nach oben. </li><li> Entfernen Sie alle Wirbelsäulenmuskulatur und Bindegewebe. Verwenden Sie die Rippen als Orientierungspunkt für die Nerven, wie sielassen Sie die Wirbelsäule. Die Rippen auch die Nerven von den chirurgischen Instrumenten zu schützen. Die DRG sind an den Hals-, Brust- und Lendenwirbelsäule Standorten der Wirbel entfernt. </li><li> das Rückenmark und DRG Wurzeln durch sanfte seitliche Einfahren des Wirbelkörpers Als nächstes schneiden mit einer Schere die Wirbelkörper in der Mittellinie und aussetzen. </li><li> Im ICR, folgen Sie dem peripheren Nerven medial entlang der Rippe lateral der DRG. </li><li> Identifizieren Sie die DRG. Es sieht aus wie das Eigelb von &#39;Spiegelei&#39; auf die Nerven liegen. </li><li> Schneiden Sie den Intercostalnerven distal der DRG verlassen 2-3 mm von Nerven distal der Ganglien, um für den Rückzug verwendet werden. Dieses &quot;Schwanz&quot; wird nach der Ernte entfernt werden. </li><li> Fassen Sie den Nerv einer Pinzette. der DRG Körper Kneifen selbst wird neuronalen Zellschäden verursachen und sollten vermieden werden. </li><li> Nähern Sie sich dem DRG proximal entlang ihrer Befestigung an das Rückenmark über seinen vorderen und hinteren Wurzeln. </li><li> Bewerben sanfte Rückzug auf die DRG durch die ef ziehendene Nerv (Intercostalnerven Stumpf) seitlich, und schneiden Sie die vorderen und hinteren Wurzeln in der Nähe der DRG. </li><li> Halten Sie die DRG in einer 35 mm Petrischale gefüllt mit frischem, eiskaltem DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 1% Natriumpyruvat. </li></ol> 3. Einpflanzung in der Petrischale <ol><li> Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis unter Verwendung von vorgekühlten Pipettenspitzen ECM Erstarrung zu verhindern. </li><li> Unter einem Stereomikroskop bei 2-4x Vergrößerung, legen Sie eine 35 mm Glasboden Petrischale auf einem Papier Raster. WICHTIG: Arbeiten auf Eis, um das ECM in flüssigem Zustand zu halten. Erstellen Sie einen Durchmesser von 1 mm Spot (ca. 20 &amp; mgr; l) von Wachstumsfaktor-verarmten ECM in der Mitte des Gitters. </li><li> Unter direkte Visualisierung, legen Sie die DRG in der Mitte des ECM-Stelle nahe dem Boden der Schale. Hinweis: Die Krebs in diesem Protokoll verwendeten Zellen sind Maus-Pankreas-Krebszellen (KPC) established von frisch isolierten Tumorproben von Mäusen Kpc wie an anderer Stelle 19 beschrieben. </li><li> Ernte 40.000 Krebszellen aus konfluenten Kulturen, waschen Sie sie einmal mit PBS und Resuspendieren sie in 40 ul ECM auf Eis. </li><li> Unter direkten Visualisierung des Gitters ein Stereomikroskop Maßnahme 500 &amp; mgr; m in jeder Richtung von der DRG mit. An diesem Punkt Samen langsam 10.000 Zellen / 10 ul ECM. Verwenden Sie ein 2-10 ul vorgekühlten Spitze der Zellen nahe der Schalenboden zu injizieren, die Vermeidung ihrer Ausbreitung in der Matrix oder Ablösung der Matrix. (Abbildung 1). </li><li> Lassen Sie das Gericht in einem Laminar-Flow-Haube für 10-15 min zu verfestigen. Vermeiden Sie ECM Trocknung. </li><li> Langsam DMEM, hergestellt hinzufügen, wie bereits erwähnt, gegen die Seitenwand der Platte. Fügen Sie genug Medium, welches das ECM (etwa 2 ml) zu decken. </li><li> Setzen Sie die Schale wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium am nächsten Tag. </li><li> Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Datenerfassung, Zeitraffer-Videomikroskopie <ol><li> Am 7. Tag nach der Implantation, nehmen Sie die Schale für Zeitraffer-Mikroskopie. Beachten Sie, dass bestimmte Zellen erforderlich machen könnten Erwerb früher durch schnellere Migration. </li><li> Während der Live - Bildgebung, die Schale in einer geschlossenen Umgebung bei einer mittleren Temperatur von 37 ± 0,1 ° C und 5% CO 2. </li><li> Notieren Sie die Zellen, die durch eine ladungsgekoppelte Vorrichtung Kamera auf das Mikroskop gelegt werden. </li><li> Nehmen Sie digitalisierte Bilder alle 10 Minuten bis zu 72 Stunden Zellbewegung von drei auf sechs verschiedenen Zellen zu folgen. </li><li> Ersetzen Medium nach 24 Stunden. </li><li> Führen Sie die Datenerfassung und einfache Analyse unter Verwendung des Mikroskop-Software. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Für fortgeschrittene Anwendungen (dh Zellverfolgung in 2D oder 3D) verwenden spezielle Software (wie Imaris 4D). Hinweis: Diese Software bestimmt die xy - Koordinaten einer Zelle anzu jeder Zeit, zusammen mit der Entfernung vom Ursprung, und die Geschwindigkeit der Bewegung gegeben. </li><li> Berechne die mittlere Geschwindigkeit durch die Entfernung zwischen aufeinanderfolgenden Positionen in 10 min-Intervallen zu messen. Berechnen der Vorwärts Migration Index (FMI), die die Entfernung der Zelle von der Vorderseite Neuriten und beschreibt die unidirektionale Bewegung der Zellen in Richtung des DRG. </li></ol>

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</ol>

Diese Forschung wurde durch den Barbara S. Goodman Endowed Research Career Development Award (2011-601-BGPC) des ICRF und einen Zuschuss der US-Israel Binational Science Foundation unterstützt. Weitere finanzielle Angaben der Autoren sind nicht zu machen.

Dieser Artikel stellt ein in vitro - Modell, das die Krebsmikroumgebung in der neuronalen Nische rekapituliert, die DRG - Modell. Das Video zeigt alle Schritte von der Anerkennung anatomische Orientierungspunkte wie die DRG in der Maus beginnt, seine Gewinnung und schließlich seine Kultivierung in ECM. Co-Kultivierung des DRG neben mit Krebszellen wird ebenfalls vorgestellt. Es gibt keine anderen Modelle für in - vitro - Forschung perineuralen Invasion in der Literatur beschrieben machen diese...

Solide Tumoren verbreiten auf drei Arten: direkte Invasion, lymphatische Ausbreitung und hematogenic Verbreitung. Allerdings gibt es ein viertes Mittel der Ausbreitung von Krebs, die häufig außer Acht gelassen wird, die Verbreitung entlang der Nerven. Cancerous neuronale Invasion (CNI) ist ein bekannter Weg der Ausbreitung von Krebs, insbesondere bei Krebserkrankungen des Kopfes und des Halses, 1 Prostata 2, 3 und Bauchspeicheldrüse. 4-8 CNI in mehr als 80% der Personen mit Adenokarzinom des Pankreas auftritt, führt zu retroperitonealen Tumor Zöliakie Ganglion Nerven verbreiten durch. Diese neurotropen Krebszellen haben eine einzigartige Fähigkeit , unidirektional entlang der Nerven gegenüber dem zentralen Nervensystem (CNS) zu migrieren. 9 Dieser Befund legt nahe , dass die perineural Mikroumgebung kann durch Krebszellen ausgenutzt werden, vorausgesetzt , Faktoren , die malignes Wachstum. Einer der wenigen in - vitro - Modelle für CNI - Forschung ist die Dorsalwurzelganglien (DRG) / Krebszellmodell. Dieser model wird für die Untersuchung der parakrinen Interaktion zwischen neuronalen Stroma und Krebszellen. 10-18 In diesem Modell, Maus oder menschlichen Krebszelllinien gezüchtet in der extrazellulären Matrix (ECM) , benachbart zu Zubereitungen von frisch dissoziierten DRG kultiviert häufig verwendet. Dieser Video-Artikel zeigt die Anwendung von in vitro CNI in duktalen Adenokarzinom des Pankreas.

<table><tbody><tr><td>Ausstattung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Leica</td><td>M205</td><td></td></tr><tr><td>Zeitraffer-System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z309036</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischale, Glasboden</td><td>de groot</td><td>60-627860</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen&nbsp; </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Materialien:</td>70% <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold PBS</td><td>Biologische Industrie</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biologische Industrie</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Rhenium</td><td>10108165</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Biologische Industrie</td><td>01-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor-abgereichertes Matrigel</td><td>Trevigen</td><td>3433-005-01</td><td></td></tr></tbody></table>

in - vitro - modellierung von cancerous neural invasion: the dorsalwurzelganglion modell

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Eine Möglichkeit, wie sich solide Tumore verbreiten, ist durch neuronale Invasion. Dieser Weg ist bei Krebserkrankungen des Kopfes und Halses, der Prostata und der Bauchspeicheldrüse gut bekannt. Diese neurotropen Krebszellen haben die einzigartige Fähigkeit, unidirektional entlang der Nerven in Richtung des Zentralnervensystems (ZNS) zu wandern. Das Modell der dorsalen Wurzelganglien (DRG)/Krebszellen ist ein dreidimensionales (3D) In-vitro-Modell, das häufig zur Untersuchung der Interaktion zwischen neuralem Stroma und Krebszellen verwendet wird. In diesem Modell werden mausische oder humane Krebszelllinien in der EZM neben Präparaten aus frisch dissoziiertem kultiviertem DRG gezüchtet. In diesem Artikel werden das DRG-Isolationsprotokoll von Mäusen und die Implantation in Petrischalen zur Co-Kultivierung mit Bauchspeicheldrüsenkrebszellen demonstriert. Fünf Tage nach der Implantation nahmen die Krebszellen Kontakt mit den DRG-Neuriten auf. Später bildeten diese Zellen Brückenköpfe, um eine ausgedehntere polarisierte, neurotrope Wanderung von Krebszellen zu ermöglichen.

<html> Mit Video-Mikroskopie kann die DRG sprießen Neuriten 5-7 Tage nach der Implantation zu erkennen, während die Krebszellen aus ihren Kolonien in Richtung der DRG Migration weg. Vom 7. Tag nach der Implantation kommen die Krebszellen in Kontakt mit den Neuriten (Abbildung 2). Der Vorwärts - Migration Index der Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in das verwendete Protokoll ist 3-4 - fach höher als die...

Dieser Videoartikel zeigt die Verwendung des Modells der dorsalen Wurzelganglien (DRG)/Krebszellen beim duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Das übergeordnete Ziel dieses Modells besteht darin, das krebshafte neuronale Mikromilieu nachzubilden. Dies ermöglicht die Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Neuronen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Tumormikromilieus zu beantworten, beispielsweise die Interaktion zwischen Tumorzellen und Neuronen sowie deren gegenseitige Beeinflussung.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zuverlässig und einfach durchzuführen ist und sowohl zelluläre als auch zerebrale Faktoren in der neuronalen Nische berücksichtigt. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur therapeutischen Entwicklung und pharmakologischen Zielgerichtetheit wesentlicher Faktoren im Prozess der neuronalen Umgestaltung und Invasion während der Krebsentwicklung. Nach der Tötung des Tieres in einer CO2-Kammer sollte das Fell mit 70 %igem Ethanol benetzt und zum Trocknen abgestanden werden.Fixieren Sie die Maus in Bauchlage und führen Sie anschließend einen medianen Schnitt kraniokaudal vom hinteren Nacken bis zur Lendenwirbelsäule durch. Heben Sie dann mit einer Pinzette bilateral die Hautlappen an, um das subkutane Gewebe freizulegen. Tasten Sie den Schädel der

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In diesem Video beschreiben wir die Methode zur Co-Kultur von dorsalen Wurzelganglien und Krebszellen auf der chorioallantoischen Membran oder CAM von Küken, um die perineurale Invasion zu untersuchen.

Chorioallantoische Membran des Kükens oder CAM-Tumormodell: Eine In-Ovo-Methode zur Simulation der perineuralen Invasion von Tumorzellen

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Entwicklung eines in vitro perineuralen Krebszellinvasionsmodells durch Co-Kultivierung von Maus-Spinalganglion und neurotropen Krebszellen. Das Modell kann zur Durchführung von Krebstests verwendet werden, die schnelle und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Etablierung eines dreidimensionalen Co-Kulturmodells von murinen Spinalganglien und Krebszellen: Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der perineuralen Invasion von Krebszellen

In diesem Video demonstrieren wir eine in vitro Methode zur Co-Kultivierung von DRG- und Krebszellen, um Neurotropismus und neuronale Invasion zu untersuchen.

Modellierung der krebsartigen neuronalen Invasion in vitro: Eine Methode zur Co-Kultur von Spinalganglien und Krebszellen

In diesem Video entwickeln wir ein in vivo Mausmodell für die perineurale Invasion, indem wir Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in den Ischiasnerv injizieren. Dieses Modell hilft, das Ausmaß der Invasion zu quantifizieren und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Nerven zu untersuchen.

Maus-Perineurales Invasionsmodell: Generierung eines In-vivo-Modells zur Simulation einer perineuralen Invasion im Ischiasnerv der Maus

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Entwicklung von dorsalen Wurzelganglien oder DRG-Explantatkulturen und DRG-dissoziierten Zellmodellen unter Verwendung von isoliertem Maus-DRG-Gewebe. Diese Modelle helfen dabei, verschiedene Mechanismen der Neuron-Glia-Interaktionen in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen.

Generierung von Explantat und dissoziierter Zellkultur aus dem Spinalganglion

Die perineurale Invasion (PNI) ist ein häufiges Merkmal des Plattenepithelkarzinoms im Kopf- und Halsbereich (HNSCC) und führt zu niedrigeren Überlebensraten. Seine Mechanismen sind nur unzureichend verstanden. Unter Verwendung von Neuriten, die aus murinen Spinalganglien erzeugt werden, die auf eine halbfeste Matrix beschränkt sind, können die Signalwege untersucht werden, die an der PNI von HNSCC-Zelllinien beteiligt sind.

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Wir beschreiben eine in Vivo Mausmodell Perineural Invasion durch Einspritzen von Phänomen pankreatischen Krebszellen in den Ischiasnerv. Das Modell ermöglicht eine Quantifizierung des Ausmaßes der Nerv Invasion und Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der Perineural Invasion unterstützt.

Eine In Vivo murinen Ischiasnerv Modell Perineural Invasion

Perineurale Invasion ist ein aggressiver Phänotyp für Kopf- und Halsplattenkarzinome und andere Tumoren. Das Küken-Chorioallanto-Membranmodell wurde zur Untersuchung von Angiogenese, Krebsinvasion und Metastasierung verwendet. Hier zeigen wir, wie dieses Modell genutzt werden kann, um die perineurale Invasion in vivo zu bewerten.

Das Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Modell zur Beurteilung der perineuralen Invasion bei Kopf- und Halskrebs

Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Entnahme und Kultivierung von explantierten Spinalganglien (DRG) von adulten Sprague Dawley-Ratten in einem Multikompartiment-Gerät (MC).

Ernte, Einbettung und Kultivierung von dorsalen Wurzelganglien in Geräten mit mehreren Kompartimenten zur Untersuchung peripherer neuronaler Merkmale

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung ganzer und dissoziierter Kulturen von dorsalen Wurzelganglien (DRG) der Maus und deren Verwendung zur Beurteilung von Tumor-Nerven-Interaktionen.

Etablierung von In-vitro-Modellen der Kultur der Spinalganglien: Komplementäre Ansätze zur Untersuchung der Krebs-Nerven-Wechselwirkung

Erfahren Sie das DRG/Krebszell-Modell zur Untersuchung neuronaler Tumor-Mikroumgebungen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Krebszell-Neuron-Interaktionen und unterstützt die Entwicklung gezielter Therapien.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

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