Name: Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Erfahren Sie die subretinale Injektionstechnik für Gentherapie im retinalen Pigmentepithel von Mäusen. Diese Methode ermöglicht effektiven Gentransfer mit viralen Vektoren für ophthalmologische Forschung.

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Diese Studie wurde von der Seoul National University Research Grant (800-20140542) unterstützt, der Pioneer Research Program der NRF / MEST (2012-0009544) und die Bio-Signalanalyse-Technologie-Innovations-Programm der NRF / MEST (2009-0090895), und die Gewährung von NRF / MEST (2015M3A9E6028949).

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und die Richtlinien und Vorschriften von der Seoul National University Institutional Animal Care und Verwenden Committee und Seoul National dargelegt Universitätsklinikum Biosafety Committee. 1. Vorbereiten Injection Kit und Virale Vektoren <ol><li> Bereiten Sie die Mikroliter-Spritze mit einer 33 G stumpfen Nadel sterilisiert mit Ethylenoxid-Gas ausgestattet. Verdünnt den viralen Vektoren in PBS zur adäquaten Titer im Mikroröhre (dh 1 × 10 6 TU / ul). Spülen Sie die Spritze mehrmals mit viralen Vektoren, jede toten Raum in der Spritze zu entfernen. </li></ol> 2. Subretinale Injektion von viralen Vektoren <ol><li> Betäuben den erwachsenen Mäusen (dh, 6-8 Wochen alt) mit einer intraperitonealen Injektion der Mischung aus tiletamine und Zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin-Hydrochlorid (0,7 mg / kg Körpergewicht) oder eine alternative geeignete Anästhesie Regimes. </li><li> Erweitern sich die Schüler mit einem Auge Tropfen Phenylephrin 0,5% und 0,5% Tropicamid. </li><li> Bereiten Sie den Mikroliterspritze durch das Laden mit 1,5 bis 2 &amp; mgr; l von viralen Vektoren. </li><li> Öffnen Sie das Augenlid und stehen den Blick auf den Äquator zum bequemen Injektion freizulegen und sich auf unter dem Operationsmikroskop. Aufrechterhaltung der vorstehende Augenposition bis Beendigung der Injektion oder Verschiebung der Nadel während der Injektion ein. Um den Augapfel fest zu halten, legen Sie die Finger außerhalb des Augenhöhlenrand. </li><li> Einen Tropfen Augen viskoelastische Lösung, um die Hornhautoberfläche. </li><li> Setzen Sie einen kleinen runden Deckglas auf der Oberseite der Hornhaut, um die Netzhaut zu visualisieren. </li><li> Stechen ein kleines Loch an leichten hinter dem Limbus mit einer sterilen Nadel 30 G 1/2 für die weitere subretinale Injektion. Machen Sie das Loch unterlegen for das rechte Auge und überlegen für das linke Auge für die Bequemlichkeit. HINWEIS: Wenn das Loch an zeitliche oder Nasen gemacht, ist es schwer, durch das Augenlid nach der Injektion bedeckt sein. Punktion sollte etwas hinter dem Limbus, die Limbusgefäßen, die entlang des Limbus ausgeführt und kann leicht erkannt werden, zu vermeiden. Seien Sie vorsichtig, schlagen Sie das Objektiv mit Nadel und gleichzeitig die Punktion zu vermeiden. Nicht die gesamte Kegel der Nadel legen nicht auf Linsenpunktion zu vermeiden. </li><li> Legen Sie die 33 G stumpfen Nadel der Mikroliterspritze durch die Pre-Stichloch und nähern sich die Nadel in den subretinalen Raum bis zu dem Punkt, wenn mild Widerstand zu spüren ist. HINWEIS: Bei den subretinalen Injektion, der beste Ansatz Winkel der Nadel ist etwa 45 Grad gegen Iris Ebene und die stumpfe Nadel sollte nach hinten in Richtung peripapillären Bereich geschoben werden. Gepunktete Quadrat angezeigt die vorgeschlagene Nadel Weg über den Glaskörperraum für den subretinalen injection in 1. HINWEIS: Es wird kein Widerstand fühlte, als Piercing (oder Weitergabe) die Netzhautschichten, wie sie sind sehr weich. Somit wird das erste Gefühl einer leichten Widerstand zeigt an, dass die Nadel die RPE-Schicht bereits berührt wurde und die Einführung der Nadel gestoppt werden sollte. Achten Sie darauf, Skleragewebe mit Überdruck durchdringen, weil die Nadel in das Potenzial subretinalen Raum platziert werden. Wenn die Nadel in die Lederhautgewebe durch übermäßige Macht, tritt sie in den äußeren Augen orbitalen Bereiche ohne Widerstand. (Dieser Schritt ist kritisch) </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Subretinale Injection. H &amp; E gefärbten Querschnitt der Maus Auge Darstellung der Strukturen mit einer Nadel Weg für den subretinalen Injektion markiert (eine gepunktete Quadrat). Vergrößerung: 40x, Maßstabsbalken:<html> 500 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="9"><li> Injizieren Sie den viralen Vektoren (dh 1 x 10 6 TU / ul) vorsichtig in den subretinalen Raum ohne Zittern um unerwünschte Gewebeschäden zu vermeiden und vorsichtig ziehen Sie die Nadel. Halten Sie den Augapfel fest während der Injektion, wie in 2.4 beschrieben. </li><li> Beachten Sie die Bildung von subretinalen Bläschen nach Injektion unter Operationsmikroskop, um sicherzustellen, gibt es keine Netzhautblutungen. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> Abbildung 2. Subretinale Belb Formation ohne Netzhautblutungen. Mikroskopische Ansicht des subretinalen belb nach dem subretinalen Injektion unter Operationsmikroskop zeigt erfolgreiche bleb Bildung ohne Netzhautblutungen.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="11"><li> Schließen Sie vorsichtig das Augenlid auf die Injektionsstelle für selbstdicht decken. Bringen Sie die Maus mit nach Hause Käfig und am Leben zu erhalten, bis die Auswertung. Hinweis: Nach dem die Forscher erhalten den Verfahren verwendet werden, können sie die wiederholbare Ergebnisse mit Schnellverfahren durch Überspringen Sie diese Schritte erhalten (2,5, 6 und 10) </li></ol> 3. Bewertung der Wirksamkeit von Gentransfer in Retinapigmentepithel <ol start="1"><li> Opfern die Mäuse in der CO 2 Kammer. Entkernen die Augen mit einer Schere. </li><li> Fixieren die Augen in der 4% Paraformaldehyd-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde bis einige Tage. </li><li> Besorgen Sie sich die Hornhaut mit feinen Pinzetten und Punktion der Hornhaut mit Mikro-Schere. Entfernen Sie die Hornhaut nach scissoring entlang des Limbus. Nehmen Sie den Objektiv mit einer Pinzette. </li><li> Schneiden Sie die Ziliarkörper mit micro-Schere ermöglicht Netzhautablösung. Ziehen Sie die gesamte Netzhaut von der RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex. Schneiden Sie den RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex radial von der Peripherie zum Zentrum in der Nähe des Sehnervs mehrmals, um 4 bis 8 Blätter für flache Montage machen. </li><li> Klappen Sie den RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex zu RPE Seite nach unten zu machen, und schneiden Sie die verbleibenden Gewebe an der skleralen Seite einschließlich der Muskeln, Bindehaut und Sehnerv. Dieser Schritt ist wichtig, um eine flache RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex zu machen, weil der verbleibende Gewebe macht die komplexe uneben. </li><li> Inkubieren Sie die Anlage mit primären und sekundären Antikörpers für Ihre spezielle Forschungszwecke (optional, siehe die Referenzen für detaillierte Methoden). Flach montieren RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplexe auf dem Objektträger und absorbieren die PBS mit einem saugfähigen Schwamm. </li><li> In 30 ul Montagelösung und legen Sie das Deckglas. Beachten Sie die Probe für die Wirksamkeit von Vektor-Lieferung unter Fluoreszenzmikroskop. Bewahren Sie die Proben inder Kühlschrank zur weiteren Beobachtung. </li></ol>

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<li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Video-Artikel beschrieben wir die Limbus-Ansatz subretinalen Injektionstechnik im Detail mit den repräsentativen Ergebnissen der RPE / Aderhaut / Lederhaut Flachmontage. Dies ist eine einfache und bequeme Technik zum subretinalen Injektion von viralen Vektoren in RPE. Direkte Visualisierung bleb Bildung während der Injektion ist ein wichtiger Schritt für die pünktliche Lieferung für die Anfänger. Es gibt einige subretinalen Injektionstechniken in Blatt eingeführt of Visualized Experiments 8-10. Subr...

In der Augenheilkunde hat die Gentherapie als Behandlungsmethode in monogenen geerbt Retinopathien entstanden. Es vererbt Retinopathien mit Genen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Leber angeborene amurosis 1,2, Retinitis pigmentosa 3 und choroideremia 4 verbunden. Das Forschungsfeld der Gentherapie erweitert in beiden präklinischen Studien und klinischen Studien unter Verwendung von viralen Vektoren, wie Adeno-assoziierte Virus (AAV), Lentiviren (LV) und Adenovirus (Ad) 5. Verschiedene virale Vektoren haben unterschiedliche Tropismus in der Netzhaut. Für eine sichere und wirksame Gentherapie, virale Vektoren sollten sorgfältig entsprechend Zielzellen und Zielgene ausgewählt werden. Die Route der Genübertragung ist auch wichtig für eine effektive Genübertragung an Zielzellen, so sollte es sorgfältig und ausgewählt werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur intraokularen Abgabe von viralen Vektoren sind SUBRETinal Einspritzung und intravitreale Injektion 6. Letztere, intravitreale Injektion, wurde weit verbreitet für die Arzneimittelabgabe verwendet werden, um CNV in feuchten altersbedingten Makuladegeneration (AMD) und Makulaödem bei diabetischer Retinopathie 7 behandeln. Intravitreale Route bietet Exposition viraler Vektoren zu glasigen und inneren Retina, sondern die Diffusion der Vektoren äußeren Netzhaut begrenzt ist. Auf der anderen Seite stellt die subretinale Route direkte Lieferung von viralen Vektoren zum Potential Raum zwischen Retina und RPE, Induzieren einer lokalisierten Bläschen. Daher wird subretinalen Injektion momentan als ein effizienter Weg für die gezielte Photorezeptorzellen und RPE. In Bezug auf die chirurgischen Ansatz, Pars plana als einen sicheren Bereich für die intravitreale Injektion gewählt, um Netzhautschäden in menschlichen Patienten zu vermeiden. Durch einfaches Ändern dieses Konzept für Mäuse, wir könnten virale Vektoren subretinal oder intravireally via Limbus-Ansatz zu injizieren. In diesem VideoArtikel zeigen wir eine einfache und bequeme Methode der subretinalen Injektion von viralen Vektoren in Mäuse RPE. Nach Einzelpunktion bei posterior zu Limbus mit einer 30 G 1/2 Nadel wird ein 33 G stumpfen Nadel ausgestattet Mikroliterspritze in den subretinalen Raum über den Limbus Einstichstelle eingeführt. Die viralen Vektoren 1,5-2 ul Volumen auf das Potential Raum zwischen Retina und RPE Induzieren subretinalen Bläschen injiziert. Dieser Vorgang kann unter direkter Sicht mit Operationsmikroskop durchgeführt werden. Wiederholte Praxis werden reproduzierbare Ergebnisse auch ohne direkte Visualisierung der Bläschenbildung zu gewährleisten. Dies soll dazu dienen, um eine genaue und zeitsparende Experimente zur subretinalen Gentransfer in Mäusen RPE durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>PINZETTE DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm TIPS</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Schere F/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G Blunt Nadel</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Spritze, 10 Mikroliter</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>Für einfache Einhandinjektion</td></tr><tr><td>30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Nadel</td><td>BD</td><td>305107</td><td>Initialpunktion für subretinale</td></tr><tr><td>Injektion Mikroskop-Deckglas (Nr. 1 3 mm Durchmesser)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720&nbsp; (CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>Leica Operationsmikroskop</td><td>Leica</td><td>LM M80</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresecein Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Thermo scientific</td><td>TMO. LV-Ctr</td><td>Zur Verdünnung von Vektoren</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Zur Verdünnung</td></tr> von <tr><td>Vektoren Troperin (Phenylephrin 0,5% - Tropicamid 0,5%)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>Zur Dilatation</td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid Ophthalmische Lösung USP, 0,5% (steril)</td><td>Bausch& Lomb</td><td></td><td>Für topische Anästhesie</td></tr><tr><td>Healon GV OVD</td><td>Abbott Medical Optics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 (Tiletin Hypochlorid und Zolazepam Hypochlorid)</td><td>Virbac</td><td></td><td>Für die Allgemeinanästhesie</td></tr><tr><td>Rompun Injektion (Xylazin HCl)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Für die Vollnarkose</td></tr></tbody></table>

limbus-ansatz-subretinale injektion von viralen vektoren für die gentherapie bei mäusen retinapigmentepithel

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Das Auge ist ein kleines und geschlossenes Organ, was es zu einem idealen Ziel für die Gentherapie macht. In jüngster Zeit wurden verschiedene Strategien für die Gentherapie bei Retinopathien angewendet, bei denen nicht-virale und virale Genverabreichung an die Netzhaut und das retinale Pigmentepithel (RPE) verwendet werden. Die subretinale Injektion ist der beste Ansatz, um virale Vektoren direkt an RPE-Zellen zu liefern. Vor der klinischen Erprobung einer Gentherapie ist es unumgänglich, die Wirksamkeit der Therapie in Tiermodellen verschiedener Retinopathien zu validieren. So wird die subretinale Injektion bei Mäusen zu einer grundlegenden Technik für eine okuläre Gentherapie. In diesem Protokoll stellen wir die einfache und replizierbare Technik zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in experimentelle Mäuse zur Verfügung. Diese Technik ist modifiziert von der intravitrealen Injektion, die in Augenkliniken weit verbreitet ist. Die repräsentativen Ergebnisse der RPE/Aderhaut/Skleral-Komplex-Flat-Mount werden dazu beitragen, die Wirksamkeit dieser Technik zu verstehen und das Volumen und den Titer der viralen Vektoren an das Ausmaß der Gentransduktion anzupassen.

Um die Wirksamkeit der subretinalen Injektion auf virale Gen-Transduktion durch dieses Protokoll zu bewerten, haben wir im Handel erhältlich LV Vektoren mit CMV-Promotors exprimieren, sowohl GFP und RFP für den Indikator. Augen wurden nach der jeweiligen Zeitperiode nach dem Forschungszweck ausgeschält. Für die repräsentative Ergebnisse wurden die Augen 10 Wochen und 20 Wochen nach der subretinalen Injektion enukleiert. Nach vollständiger Entfernung der Netzhaut mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Wohnung Ber...

Die subretinale Injektion ist eine chirurgische Technik zur effektiven Genabgabe an das retinale Pigmentepithel im Mausauge. Hier beschreiben wir eine einfache und replizierbare Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in retinales Pigmentepithel bei Versuchsmäusen.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Zielgen in das retinale Pigmentepithel einer lebenden Maus einzubringen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Augenlid geöffnet und der Augapfel vorgeschoben wird, um den Äquator freizulegen. Die nächsten Schritte bestehen darin, ein kleines Loch hinter der Limbus zu erzeugen.Injizieren Sie die viralen Vektoren mittels einer abgestumpften Nadel in den subretinalen Raum und beobachten Sie die Bildung einer subretinalen Blase. Abschließend wird die Expression der fluoreszenten Marker, die durch das injizierte Virus in das retinale Pigmentepithel gebracht wurden, mittels Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Dies ist eine EEG- und praktische Technik zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in das retinale Pigment.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die subretinale Injektionsprobe für die Lunge schwierig ist, besonders für Anfänger. Bereiten Sie zunächst eine Mikroliterspritze mit einer stumpfen Nadel der Größe 33 vor, die mittels Ethylenoxidgas sterilisiert wurde.Bereiten Sie als Nächstes eine Verdünnung der viralen Vektoren in PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa einer Million Titereinheiten pro Mikroliter vor. Spülen Sie beim Befüllen der Spritze diese mehrmals mit der Lösung durch, um so toten Raum in der Spritze zu entfernen. Stellen Sie 1,5 bis zwei Mikroliter der Lösung bereit, um sie mit der Injektion des viralen Vektors zu verabreichen.Bereiten Sie einen adulten Maus unter Anästhesie vor, indem Sie eine intraperitoneale Injektion mit Lenta Diazepam und Slaine durchführen, und bestätigen Sie, dass das Tier durch das Fehlen von Reflexen anästhesiert ist. Sobald die Anästhesie bestätigt ist, weiten Sie die Pupillen mit einem Tropfen 0,5 % Phenylephrin und 0,5 % Ide. Öffnen Sie nun unter einem Operationsmikroskop das Augenlid und bringen Sie das Auge hervor, um den Äquator freizulegen.Halten Sie das Auge in dieser Position, indem Sie Ihre Finger außerhalb des Orbitarandes platzieren. Tragen Sie anschließend eine ophthalmische viskoelastische Lösung auf die Hornhautoberfläche auf und legen Sie einen kleinen runden Deckel über die Hornhaut. Dadurch kann die Netzhaut nun leicht hinter dem Limbus und im rechten Auge inferior bzw. im linken Auge superior betrachtet werden.Verwenden Sie eine sterile 30-Gauge-Halbnadel, um ein kleines Loch zeitlich oder nasenseitig anzulegen. Löcher sind keine gute Wahl, da sie schwer abzudecken sind. Vermeiden Sie beim Durchstechen, das limbiale Gefäß oder die Linse zu treffen, und führen Sie nicht den gesamten Nadelschaft ein, wenn subretinale Injektionen durchgeführt werden.Führen Sie die Vektor-Injektionsnadel im 45-Grad-Winkel zur Irisebene durch das Loch ein. Bewegen Sie die Nadel posterior in Richtung des peripapillären Bereichs. Folgen Sie der markierten Bahn, um die Glaskörperhöhle zu durchqueren.Nähern Sie die Nadel dem subretinalen Raum, bis ein leichter Widerstand spürbar ist, was darauf hinweist, dass die Pigmentepithelschicht (RPE) erreicht wurde. Vermeiden Sie es, das sklerale Gewebe mit übermäßigem Druck zu durchdringen, da die Nadel im potenziellen subretinalen Raum platziert werden soll. Wenn die Nadel mit zu großer Kraft in das sklerale Gewebe eindringt, gelangt sie widerstandsfrei in den außerokularen Orbitaraum. Injizieren Sie nun vorsichtig den viralen Vektor in den subretinalen Raum.Halten Sie die Nadel sehr ruhig, um Gewebeschäden zu vermeiden, was von großer Bedeutung ist. Ziehen Sie die Nadel dann genauso schonend zurück. Nun kann der Augapfel freigegeben werden.Ein subretinales Blubbern, das auf eine Vektorakkumulation hindeutet, sollte sichtbar sein. Schließen Sie schließlich vorsichtig das Augenlid, um die Injektionsstelle abzudecken. Die Selbstversiegelung der Öffnung erfolgt von alleine.Um die Genübertragung zu bewerten, opfern Sie die Mäuse durch Kohlendioxid-Asphyxie, nachdem die Tötung bestätigt wurde. Enukleieren Sie die Augen mit einer Schere. Fixieren Sie die Augen in 4 % PFA bei vier Grad Celsius für mindestens eine Stunde, vorzugsweise jedoch für mehrere Tage.Greifen Sie mit einer Pinzette die Hornhaut an und perforieren Sie sie mit einer Mikroschere. Schneiden Sie dann entlang des Limbus, um die Hornhaut zu entfernen. Entfernen Sie anschließend mit der Pinzette die Linse.Als Nächstes trimmen Sie den Ziliark&ouml;rper. Ziehen Sie danach die gesamte Netzhaut vom RPE-Chorioidea-Sklera-Komplex ab, nachdem die Netzhaut entfernt wurde. Schneiden Sie den Komplex radial von der Peripherie bis zur Mitte in der N&auml;he des Sehnervs, um vier bis acht fu&szlig;f&ouml;rmige Strukturen zu erzeugen, und gl&auml;tten Sie die Struktur f&uuml;r die Montage.Drehen Sie nun den Komplex mit der RPE-Seite nach unten und entfernen Sie alle verbleibenden Gewebe auf der Skleraseite, einschließlich Muskeln, Konjunktiva und Sehnerv. Dadurch entsteht eine flachere RPE-Sklera-Komplex-Präparation auf einem Objektträger. Entfernen Sie das überschüssige PBS mit einem saugfähigen Schwamm.Etwa 30 Mikroliter Eindeckmedium auftragen und die Probe mit einem Deckglas abdecken. Die Probe, wenn sie nicht betrachtet wird, bei vier Grad Celsius lagern. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden kommerziell erhältliche LV-Vektoren mit CMV-Promotoren, die sowohl GFP als auch RFP exprimieren, injiziert.Die Augen wurden nach 10 Wochen enukleiert und RPE-Präparate in Flachmontage wurden angefertigt. Die Signalintensitäten von GFP und RFP variierten zwischen den RPE-Zellen an der Injektionsstelle, und die Transduktion war auf den Bereich beschränkt, in dem sich das Injektionsblut gebildet hatte. Durch die Erhöhung der Vergrößerung von vierfach DX auf 400× konnte die Pathologie des I mit noch höherer Auflösung beurteilt werden.Auch wenn hier nicht gezeigt, exprimierten die transduzierten Zellen das Vektorprotein noch 36 Wochen nach der Injektion. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Nadel nach ihrer Entwicklung präzise und geschickt in den subretinalen Raum einzuführen. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Augenheilkunde den Weg, Gentherapien für die Behandlung von angeborenen, monogenetisch vererbten Netzhauterkrankungen und der altersbedingten Makuladegeneration zu erforschen.

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Forschung

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Neurowissenschaften

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Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

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