Name: Photodynamische Therapie mit Blended leitendes Polymer / Fullerene Nanopartikel Photosensibilisatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von leitenden Polymer-Nanopartikeln mit Fulleren für die photodynamische Therapie bei Krebs. Diese Methode ermöglicht die gezielte Behandlung aggressiver Tumore wie Ovarialkarzinome.

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Die Autoren danken der National Science Foundation (NSF) für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit durch einen CAREER-Preis (CBET-0746210) und durch den Preis CBET-1159500. Wir danken Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) und Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) für die Unterstützung bei der Zellkultur.

1. Die Kultivierung Zelllinien <ol><li> Thaw TE 71 (Mouse Thymusepithelzellen), MDA-MB-231 (Human-Brustkrebszellen), A549 (Human Lungenkrebszellen) und OVCAR3 (Human Eierstocktumorzellen), indem die kryogene Fläschchen in warmem Wasser für weniger als 2 min . 10 ml DMEM-Medium mit 10% FBS zu jeder Zelllinie und zentrifugieren für 6 min bei 106 x g ergänzt. </li><li> Saugen Sie die Aufhängung und fügen Sie 3 ml Medium dem Pellet. Mischen Sie die Zellen richtig durch Pipettieren mehrmals. In diese Zelle Lösung vorgewärmt 7 ml DMEM-Medium mit 10% FBS in T75-Flaschen ergänzt und halten Sie die Flaschen in feuchten Atmosphäre von 95% Luft / 5% CO 2 bei 37 ° C. Beschriften Sie diese Kolben, wie Passage 0. </li><li> Wenn die Konfluenz der Zellen erreicht 80%, Ernte der Zellen durch Inkubation mit 0,05% Trypsin für 10 min. Neutralisieren die Trypsin durch Zugabe der gleichen Menge von Medien. Zentrifuge diese Lösung für 6 min bei 106 x g. Entfernen Sie die Suspension und 3 ml frisches Medium zu. Mischen Sie well und übertragen kleine Menge (100 ul) in eine Kulturflasche, enthaltend 7 ml Medium. Die Kulturflasche im Brutschrank inkubiert. Beschriften Sie die Kolben, wie Passage 1. </li><li> Kultur die Zelllinien bis zum Durchgang 11 oder 12. </li></ol> 2. Herstellung von Nanopartikeln <ol><li> Herstellung von ~ 10 -6 M (bereinigt) unverwässert MEH-PPV-Stammlösung <ol><li> In einer Phiole hinzuzufügen 1mg Poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenvinylen] (MEH-PPV) mit einem Molekulargewicht (durchschnittliches Mn) 150.000-250.000 g / mol und 3 ml Tetrahydrofuran (THF) . Das Gemisch wird für 2 Stunden unter Erhitzen bei 80 ° C auf einer heißen Platte. </li><li> Filtern der obigen Lösung in ein neues Fläschchen unter Verwendung eines 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter filtriert. Beschriften Sie diese Lösung als &quot;unverdünnte MEH-PPV-Stammlösung&quot;. Diese Lösung wird in Nanopartikel-Herstellung nach der Feinabstimmung der Konzentration wie in den Schritten 2.1.3 und 2.1.4 beschrieben, einbezogen werden. </li><li> In 50 ul der unverdünnten MEH-PPV-Stammlösung in 3 ml THF. Beschriften Sie diese Lösung als &quot;verdünnt MEH-PPV-Stammlösung&quot;. Transfer zu einem 1 cm Quarzküvette und Messung der Absorption bei 495 nm durch UV-Vis-Spektroskopie. </li><li> Wenn die Absorption der verdünnten MEH-PPV-Stammlösung höher ist als 0,17, verdünnt das unverdünnte MEH-PPV-Stammlösung durch Zugabe von mehr THF 1 ml zu einer Zeit, solange nach 2.1.3 bis die gemessene Absorption bei 495 nm ist in der reichen von 0,13 bis 0,17. </li><li> Berechnen Sie die Molarität des verdünnten MEH-PPV-Stammlösung unter Verwendung von Lambert-Beer-Gesetz, wie unten dargestellt. Hier 0,15 Extinktion wird als Beispiel für den Rest der Protokolle (dh., Bezogen auf beobachtete Extinktion einzustellen alle folgenden Berechnungen) ist die MEH-PPV Extinktionskoeffizienten verwendet 10 7 M -1 cm -1 und der Pfadlänge verwendet wird, ist 1 cm. A = ε xbxc (Gleichung 1) (ε - der molare Extinktionskoeffizient, A - Absorption, b - Weglänge c - Konzentration der Lösung) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm x c (Gleichung 2) c = 1,5 x 10 -8 M (Gleichung 3) Verwenden Sie diese Konzentration, die Konzentration der unverdünnten MEH-PPV-Stammlösung zu finden, wie folgt: M 1 V 1 = M 2 V 2 (Gleichung 4) 0,15 x 10 -7 M x 3050 ul = M 2 x 50 ul (Gleichung 5) M 2 = 9,15 × 10 -7 M (Gleichung 6) Dies ist die Konzentration des &quot;eingestellt unverwässerte MEH-PPV-Stammlösung&quot;. </li></ol></li><li> Berechnung der Masse von MEH-PPV in der eingestellten unverwässerte MEH-PPV-Stammlösung <ol><li> Berechnen Sie die Masse von MEH-PPV in 1 ml des unverdünnten eingestellt Stammlösung, wie unten mit dem im Abschnitt 2.1.4 erhalten Molarität und das Molekulargewicht (M w) von MEH-PPV, die 10 6 g / mol ist gezeigt. M = n / V (n - Nr. Der Mole, V - Volumen in L) (Gleichung 7) Somit kann die Masse von MEH-PPV in 1 ml eingestellt undiluted Stammlösung ist 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Mischen PCBM in MEH-PPV <ol><li> Berechnung der Masse des Phenyl-C 61 -buttersäuremethylester (PCBM) in das Lager MEH-PPV-Lösung zugegeben werden, um 50 Gew% PCBM dotierten MEH-PPV-Lösung, bei 50 Gew% PCBM ist mit Bezug auf die Masse festgelegt machen von MEH-PPV (dh die Hälfte der Masse von MEH-PPV). Durch Verwendung des Gewichts des MEH-PPV in Abschnitt 2.2 erhalten. Masse von PCBM / 9,15 x 10 -4 g MEH-PPV x 100% = 50 Gew% PCBM (Gleichung 8) Masse von PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Gleichung 9) </li><li> Wiegen Sie 1 mg PCBM in einem Fläschchen und fügen Sie 500 ul THF. Berechnung der Konzentration von PCBM in dieser Lösung mit dem Molekulargewicht von PCBM als 910,88 g / mol Molarität der PCBM-Lösung = 0.001 g / (910,88 g / mol * 500 ul) (Gleichung 10) Molarität der PCBM-Lösung = 2,19 x 10 -9 mol / ul (Gleichung 11) </li><li> Berechnen Sie das Volumen der PCBM-Lösung benötigt wird, um an die angepasst fügen unverdünnt MEH-PPV-Stammlösung, die 50 Gew% PCBM dotierten MEH-PPV-Lösung in THF unter Verwendung der Molarität in Schritt 2.3.2, berechnet zu erhalten 4,57 x 10 -4 g PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (Gleichung 12) Fügen Sie 229 ul der PCBM-Lösung in 1 ml eingestellt unverwässerte MEH-PPV-Stammlösung und gut mischen. </li></ol></li><li> Herstellung von Nanopartikeln durch Umfällungsverfahren <ol><li> 1 ml der gemischten MEH-PPV / PCBM Lösung in die 1 ml Spritze mit der Nadel daran befestigt. </li><li> Schnell spritzen 1 ml des gemischten MEH-PPV / PCBM-Lösung in 4 ml VE-Wasser unter Rühren bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. Sofort anhalten Rühren nach der Injektion. Verwenden Sie diese Nanopartikel ohne weitere Verarbeitung. </li></ol></li></ol> 3. Inkubation von Zelllinien mit Nanopartikel für Imaging HINWEIS: Alle Imaging Experimente wurden in 35 mm Petrischalen abgeschlossen <ol><li> Aufnahme von nanopartiCles in Zelllinien <ol><li> Kulturzelllinien bis zu dem 12. Durchgang. An den 12. Durchgang Kulturzellen in 35 mm Petrischalen. Einstellen Konzentration der Zellen auf 35 mm-Petrischalen solche zugesetzt, dass nach 24 Stunden sind die Zellen 40% konfluent. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt entfernen Sie die DMEM-Medium mit 10% FBS aus den Petrischalen ergänzt, waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS zweimal, und fügen Sie 100 ul der Nanopartikel-Suspension in 2 ml DMEM in die Petrischalen. </li><li> Nach 24 Stunden entfernen Sie das DMEM / Nanopartikel-Suspension aus den Petrischalen und waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS 3 mal. Befestigen Sie dann die Zellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen zweimal mit DPBS. Färben die Zellen mit 300 nM DAPI durch Inkubation mit dem Farbstoff für 2 min. Waschen zweimal mit DPBS. Dann halten Sie die Zellen in DPBS für die Bildgebung. </li></ol></li><li> Detektion von ROS <ol><li> Kultur A549 und OVCAR3 Zelllinien in Petrischalen, 6 pro Zelllinie, wie in Abschnitt 3.1.1 erläutert. Beschriften Sie diePetrischalen, wie in der Tabelle 1 gezeigt. </li><li> 100 l der Nanopartikel-Suspension in 2 ml DMEM bis drei der Petrischalen, wie in der Tabelle 1 dargestellt und Inkubation für 24 Stunden. Für die Petrischalen, die Lichtdosen erhalten werden, waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden, und die Zellen zu suspendieren in HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) färben freien Medien. </li><li> Aufwärmen der Lampe des Sonnensimulators für 15 min. Stellen UV-Filter vor der Lampe herausfiltern UV-Licht. Kalibrieren der Lampe mit einer Referenzsolarzelle durch Einstellen der Lampenleistung auf 0,5 Sonne (50 mW / cm 2) Intensität an der Oberfläche der Petrischale erhalten. In diesem speziellen Aufbau wurde diese Bedingung mit 218 W Leistung an die Lampe geliefert erreicht. </li><li> Legen die Petrischalen unter der Lampe (Deckel offen) für 60 min, die in einer Lichtdosis von 180 J / cm 2, wie in den Berechnungen unten dargestellten Ergebnisse: 50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1.000 = 180 J / cm 2 </li><li> Entfernen HBSS und ohne Waschen weitere 2 ml DMEM-Medium mit 10% FBS zu den Petrischalen ergänzt hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 2 Std. </li><li> Für die positive Kontrolle Inkubieren der Zellen mit 100 uM Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) für 30 min. </li><li> Färben die Zellen in allen Petrischalen mit einer Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M des ROS Nachweisreagens durch Inkubation der Zellen mit dem Farbstoff für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Befestigen Sie die Zellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen zweimal mit DPBS. Färben die Zellen mit 300 nM DAPI durch Inkubation mit dem Farbstoff für 2 min. Waschen zweimal mit DPBS. Dann halten Sie die Zellen in DPBS für die Bildgebung. </li></ol></li><li> Apoptose und Nekrose von PI und Annexin V FITC <ol><li> Kultur jede Zelllinie in 5 Petrischalen. Drei dieser Petrischalen werden für den Versuch, während die übrigen 2 Petrischalen werden Kontrollproben sein. Die 3 Petrischalen für Experiment mit Nanopartikeln als E inkubierenin Abschnitt 3.1.2 Xplained. Die Kontrollproben werden nicht mit Nanopartikeln inkubiert. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation folgen Sie den Schritt 3.2.3. </li><li> Legen Sie die 3 Versuchspetrischalen unter der Lampe (Deckel offen) und nehmen Sie ein zu 20 min, einer bei 40 min und eine bei 60 min. Dies ergibt drei Proben, die Lichtdosen von 60, 120 und 180 J / cm 2, bzw. (Berechnung in Abschnitt 3.2.4) ausgesetzt waren. Als nächstes zu verwalten eine 180 J / cm 2 Lichtdosis zu einer der Kontrollpetrischalen. Dies ist die Steuerung mit Lichtdosis in Abwesenheit von Nanopartikeln angewandt. Sie Lichtdosis zu der verbleibenden Kontrollprobe (keine Nanopartikel und kein Licht Dosis angewendet) gelten nicht. </li><li> Ersetzen Sie die HBSS mit DMEM-Medium mit 10% FBS ergänzt und halten Sie die Petrischalen in den Inkubator für 4 Stunden. </li><li> Färben die Zellen in der experimentellen und der Kontrollpetrischalen mit 20 ul Annexin V FITC durch Inkubation der Zellen mit dem Farbstoff für 15 min. Waschen zweimal mit DPBS. Flecken auf der cEllen mit 300 nM DAPI, sowie 300 nm PI (Propidiumiodid) durch Inkubation mit den Farbstoffen für 2 min. Waschen zweimal mit DPBS. Dann halten Sie die Zellen in DPBS für die Bildgebung. </li></ol></li></ol> 4. Eigen Zytotoxizität von Nanoteilchen <ol><li> Zählen der Zellen und Kultivierung in 96-Well-Platten <ol><li> Ernte der Zellen aus Kulturflaschen durch Entfernen von Medien und Waschen der Zellen zweimal mit DPBS, gefolgt von der Inkubation der Zellen mit 0,05% Trypsin für 10 min. 2 ml DMEM-Medium mit 10% FBS zu dem resultierenden Zelllösung ergänzt. Mischen Sie die Lösung richtig an Zellclustern in Singuletts zu trennen. </li><li> Nehmen Sie 100 ul der Zellsuspension und fügen Sie 900 ul DMEM-Medium mit 10% FBS ergänzt. Gut mischen. Zeigen 10 ul dieser Suspension auf einem Hämocytometer. Zähle die Zellen unter Verwendung der Zählkammer und Einstellen der Konzentration der Zellsuspension in 4.1.1 bis 5 x 10 4 Zellen / ml. </li><li> Take 5 Platten mit 96 Vertiefungen als 0 h, 24 h markiertr, 48 h, 72 h und 96 h. Dann werden 50 ul der 5 × 10 4 Zellen / ml Zelllösungen (TE 71 und A549) in die Vertiefungen, wie in Tabelle 2 gezeigt, wodurch der Aussaat 2500 Zellen / Well. Machen Sie dasselbe Verfahren für OVCAR3 und MDA-MB-231 Zelllinien. </li><li> Nach 24 Stunden Waschen der Vertiefungen mit 1x DPBS und 50 ul von steigenden Konzentrationen von Nanopartikeln in die Vertiefungen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Bereiten verschiedenen Nanopartikelkonzentrationen durch Zugabe von 20, 100 und 180 ul der Nanopartikel-Suspension aus 2.4.2 DMEM erhalten ein Endvolumen von 2 ml, die Nanopartikelkonzentration von 0,4 × 10 -4 mg / ml ergibt, 2,0 × 10 -4 mg / ml und 3,6 × 10 -4 mg / ml. Jede Zelllinie Triplikaten für jede Konzentration der Nanopartikel. </li></ol></li><li> Messung der Zelllebensfähigkeit in dunklen <ol><li> In 10 ul MTT zu der 0 h Platte unmittelbar nach der Zugabe von Nanopartikeln. Die Platte 4 Stunden für Formazan crystals zu bilden. In 50 ul Solubilisierungslösung in die Vertiefungen. Die Platte 6 Stunden, um die Formazan Kristalle aufzulösen. </li><li> Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen der 0 h Platte durch Aufzeichnen der Extinktion bei 570 nm mit Mikroplatten-Reader. </li><li> 24 h Platte, waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie 50 ul Medium in jeder Vertiefung nach 24 Stunden Inkubation mit Nanopartikeln. In MTT und lesen Sie das, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 erläutert Platte. </li><li> 48 h, 72 h und 96 h Platten, waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie 50 ul Medium in die Vertiefungen nach 24 Stunden Inkubation mit Nanopartikeln. Inkubieren der Zellen für die restlichen Zeitperioden. </li><li> 4.2.5) Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen an den jeweiligen Zeitpunkten, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 beschrieben. </li><li> Wiederholen Sie das vollständige Experiment für 3-mal (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. Messzelle Lebensfähigkeit nach PDT <ol><li> Zählen der Zellen und Kultivierung in 96-Well-Platten. <ol><li> Beschriften Sie eine Reihe von 96-Well-Platten, wie in Tabelle 3 gezeigt ist, sowohl für die TE 71 + A549 Platten und OVCAR3 + MDA-MB-231-Platten. Die Anordnung der Platten wird die gleiche sein, wie in 4.1.3 gezeigt. </li><li> Samen der 96-Well-Platten, wie in Abschnitt 4.1 mit dem gleichen Layout erläutert, wie in Tabelle 2 in Abschnitt 4.1.2 dargestellt. </li><li> Nach 24 Stunden Nanopartikel in den Platten, wie in 4.1.4 beschrieben. </li><li> 24 Stunden nach der Zugabe von Nanopartikeln waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie 50 ul HBSS in jede Vertiefung. </li><li> Bestrahlen der Platten mit den jeweiligen Lichtdosen, wie in 3.2.3 beschrieben. </li><li> Ersetzen Sie die HBSS mit 50 ul DMEM-Medium mit 10% FBS ergänzt und Inkubation der Platten für die jeweiligen Zeiträume nach PDT. </li><li> Nach jeder Zeitperiode zu messen, die die Lebensfähigkeit der Zellen, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 beschrieben. </li></ol></li></ol> 6. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Aufnahme von Nanopartikeln <ol><li> Schalten Sie die Lampen des Mikroskops einnd der Laser 30 Minuten vor der Bilderzeugung. Setzen die Petrischale mit der fixierten Zellen auf dem Objekttisch des Mikroskops (wie in Abschnitt 3.1 beschrieben). </li><li> Sammeln Sie die Fluoreszenz von Nanopartikeln und DAPI mit Hilfe von Filtern, wie in Tabelle 4 gezeigt. Überlagern der Phasenkontrast, Nanopartikel und DAPI Bilder in ImageJ Software. </li></ol></li><li> Detektion von ROS <ol><li> Schalten die Lampen des Mikroskops 30 Minuten vor der Bilderzeugung. Legen Sie die Petrischale mit der Zellen auf der Bühne des Mikroskops (wie in Abschnitt 3.2 beschrieben). </li><li> Sammeln der Fluoreszenz von Nanopartikeln, DAPI und den ROS Nachweisreagenz mit Hilfe von Filtern, wie in Tabelle 4 gezeigt. Überlagern des Phasenkontrastes, Nanopartikel, DAPI und ROS Nachweisreagenz Bilder in ImageJ Software. </li></ol></li><li> Apoptose und Nekrose von PI und Annexin V FITC <ol><li> Schalten die Lampen des Mikroskops 30 Minuten vor der Bilderzeugung. Legen Sie die Petrischale mit den Zellen (wie unterAbschnitt 3.3) auf dem Tisch des Mikroskops. </li><li> Sammeln der Fluoreszenz von Nanopartikeln, DAPI, PI und Annexin V FITC unter Verwendung von Filtern, wie in Tabelle 4 gezeigt. Überlagern des Phasenkontrastes, Nanopartikel, DAPI, PI und Annexin V FITC Bilder in ImageJ Software. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um Nanopartikel-Aufnahme zu erreichen war es notwendig, einige kritische Maßnahmen aufrechtzuerhalten, während der Herstellung der Nanopartikel. A 10 -6 M MEH-PPV-Lösung in THF (50 Gew% gemischt PCBM) hergestellt, in DI-Wasser zu injizieren, wie es beobachtet wurde, dass die Konzentration der Lösung spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Größe von Nanopartikeln gebildet wird. Konzentration wurde durch UV-vis-Spektroskopie überprüft. Man beachte, dass in Schritt 2.1.3 Protokoll war es notwendig, anf...

In Photodynamische Therapie (PDT) Photosensitizer verabreicht, um Zielgewebe und bei der Belichtung, um den Photosensibilisator Licht erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS). ROS Spezies wie Singulett-Sauerstoff und Superoxid oxidativen Stress und nachfolgende strukturelle Schäden an Zellen und Gewebe 1-4 induzieren. Aufgrund seiner Einfachheit der Anwendung dieser Methode hat sich aktiv untersucht und klinische Studien haben statt 5,6 gemacht. Jedoch erhebliche Probleme wie Dunkeltoxizität der Sensibilisatoren, Patientenlichtempfindlichkeit (aufgrund nicht-selektiven Verteilung des Sensibilisators) und Hydrophobie der Sensibilisatoren (was zu einer verminderten Bioverfügbarkeit und potentielle akute Toxizität führt) bleibt. Hier berichten wir ein Verfahren für die Herstellung und in-vitro-Bewertung aus leitendem Polymer-Nanopartikel mit Fulleren gemischt als die nächste Generation Photosensibilisatoren für die PDT. Die Nanopartikel durch Selbstaggregation gebildetdas halbleitende Polymer MEH-PPV (Poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenvinylen]) mit dem Fulleren PCBM (Phenyl-C 61 -buttersäuremethylester), wenn diese Materialien in einem kompatiblen gelösten Lösungsmittel rasch in einem nicht kompatiblen Lösungsmittel (1A) injiziert. Die Wahl der MEH-PPV als Wirtspolymer durch seine hohe Extinktionskoeffizienten, die hohe Triplettbildung führt motiviert und effizient und ultra Ladungs- und Energieübertragung auf das Fulleren PCBM 7. Diese Eigenschaften sind ideal für die Sensibilisierung von Singulett-Sauerstoff und Bildung von Superoxid in PDT. Fullerene hat in der Tat in der PDT sowohl in molekularen und Nanopartikel-Form 13.08 angewandt. Allerdings hat schwere Zytotoxizität Weiterentwicklung 12 behindert. Hier zeigen wir, dass das Einkapseln der Fulleren in einer Host-Matrix von MEH-PPV, um zusammengesetzte MEH-PPV / PCBM-Nanopartikel zu einer PDT sensibilisierende Material zu ergeben, dass ichs nicht eigen zytotoxische, zeigt Spezifität gegenüber Krebszellen aufgrund von Nanopartikelgröße und Oberflächenladung, und die Renditen sehr effektive PDT-Behandlung bei niedriger Lichtdosen aufgrund der genannten photophysikalischen Eigenschaften.

<table><tbody><tr><td>Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenvinylen] (MEH-PPV)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>536512-1G</td><td>durchschnittlich Mn&nbsp; 150.000-250.000</td></tr><tr><td>[6,6]-Phenyl C61&nbsp; Buttersäuremethylester (PCBM)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>684449-500MG</td><td>>99,5%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Drisolv</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>National Scientific Company</td><td>37510-1</td><td>Zur Filtration von MEH-PPV-Lösung</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0,2 & Mikro; m, PTFE</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>Spritze Hamilton Company</td><td>81320</td><td>Zur Injektion von MEH-PPV-Lösung in Wasser zur Herstellung von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution without Phenolred (HBSS)</td><td>Quality Biological (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x ohne Calcium und Magnesium (DPBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, regulär (hitzeinaktiviert) (FBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x 0,25%</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-664</td><td>Trypsin/2,21 mM EDTA in HBSS ohne Natriumbicarbonat, Calcium und Magnesium Schweine-Parvovirus getestet</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopische Wissenschaften&nbsp;</td><td>15710</td><td>16 % Paraformaldehyd wird durch Zugabe von PBS DAPI auf 4 % verdünnt</td></tr><tr><td>&</td><td>nbsp; Biotium VWR</td><td>89139-054</td><td>Kernfärbemittel</td></tr><tr><td>5 ml Pipetten</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kulturkolben</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>für die Kultivierung von Zellen</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>für MTT-Assays</td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen mit Entlüftungen</td><td>Greiner Bio-One (VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>Farbstoff für die Apoptose</td></tr><tr><td>Celltiter 96 non-R 1000 Assays</td><td>Promega (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Green Reagenz, zum Nachweis von oxidativem Stress</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>Für ROS Detektion</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektrometer</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzspektrometer</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamische Lichtstreuung</td><td>PD2000DLS, Präzisionsdetektor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>NuAir DH Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X Ölimmersionsobjektiv</td></tr><tr><td>Epilumineszenzmikroskop</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X Wasserimmersionsobjektiv, Andor Zyla sCMOS-Kamera</td></tr><tr><td>Sonnensimulator</td><td>Newport 67005 Oriel Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Referenz Solarzelle</td><td>Oriel&nbsp;</td><td></td><td>VLSI Standards Incorporated</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>Zum Zählen von Zellen</td></tr></tbody></table>

photodynamische therapie mit blended leitendes polymer / fullerene nanopartikel photosensibilisatoren

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung und reproduzierbaren In-vitro-Bewertung von leitenden Polymer-Nanopartikeln berichtet, die mit Fulleren als Photosensibilisatoren der nächsten Generation für die Photodynamische Therapie (PDT) gemischt sind. Die Nanopartikel entstehen durch hydrophobe Wechselwirkung des halbleitenden Polymers MEH-PPV (Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenvinylen]) mit dem Fulleren PCBM (Phenyl-C 61-buttersäuremethylester) in Gegenwart eines unverträglichen Lösungsmittels. MEH-PPV hat einen hohen Extinktionskoeffizienten, der zu hohen Triplett-Bildungsraten und einem effizienten Ladungs- und Energietransfer zum Fulleren-PCBM führt. Letztere Prozesse erhöhen die Effizienz des PDT-Systems durch Fulleren-unterstützte Triplett- und Radikalbildung und ultraschnelle Deaktivierung von MEH-PPV, die angeregt wurden. Die hier berichteten Ergebnisse zeigen, dass dieses Nanopartikel-PDT-Sensibilisierungssystem hochwirksam ist und eine unerwartete Spezifität für Krebszelllinien aufweist.

Aufnahme und intrinsische Zytotoxizität von Nanoteilchen Die 50 Gew% blended MEH-PPV / PCBM-Nanopartikel wurden mit TE-71 inkubiert, MDA-MB-231, A549 und OVCAR3 Zelllinien. Die PCBM Mischstufe wurde als 50 Gew% PCBM, das gezeigt worden ist, um ideale Ladung und Energie Übertragungseigenschaften zwischen konjugierten Polymeren und Fullerenen 14 bereitzustellen entschieden. Fluoreszenzbilder der Funktion gestört werden in 1B gezeigt. Die Zellen wurden 24 Stunden lan...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von leitenden Polymer-Nanopartikeln, die mit Fulleren gemischt werden. Diese Nanopartikel wurden auf ihren potenziellen Einsatz als Photosensibilisatoren der nächsten Generation für die Photodynamische Therapie (PDT) untersucht.

Photodynamische Therapie mit Blended leitendes Polymer / Fullerene Nanopartikel Photosensibilisatoren

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen Photosensibilisator der nächsten Generation für die Anwendung in der photodynamischen Therapie oder PDT bei der Krebsbehandlung zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem ein Fällungsverfahren zur Herstellung angepasst wird, um wasserdispergierbare leitfähige Polymer-Nanopartikel herzustellen. In einem zweiten Schritt werden die Nanopartikel in vitro mit Krebszellen inkubiert und anschließend einer Lichtbehandlung unterzogen, um reaktive Sauerstoffspezies oder ROS zu erzeugen, die die aktiven Radikale darstellen, die an der PDT beteiligt sind.Anschließend wird die Behandlungswirksamkeit durch quantitative Assays und qualitative Bildgebung bewertet, um die Anteile lebender Zellen im Vergleich zu TED-Fraktionen der Zellpopulation zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass aggressive Krebserkrankungen wie hier beispielhaft durch OAR drei modellierter Eierstockkrebs die in dieser Arbeit beschriebenen nanopartikulären Photosensibilisatoren effizient aufnehmen und dass die PDT-Behandlung in vitro hochwirksam ist. In diesem Fall korreliert die PDT-Wirksamkeit direkt mit der Menge an von den verschiedenen Zelllinien aufgenommenen Nanopartikeln.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Chemotherapie, Strahlentherapie und Chirurgie besteht darin, dass die Behandlung gezielt auf die erkrankte Stelle ausgerichtet werden kann, um Nebenwirkungen zu verringern. Das verwendete Wirkstoffmaterial zeigt keine in-vitro-Zytotoxizität, und durch weitere Entwicklung wird das Nanomaterialsystem noch spezifischer gegenüber der tDCS-Stelle. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Kultivieren der Zelllinien und der Herstellung der M-E-H-P-P-V-Stammlösung, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 50 Mikroliter der unverdünnten M-E-H-P-P-V-Stammlösung in drei Milliliter TETRAHEDRAN oder THF.Etikettieren Sie diese Lösung als verdünnte M-E-H-P-P-V-Stammlösung, überführen Sie sie in eine Quarz-Küvette mit einem Zentimeter Pfadlänge und messen Sie die Absorption bei 495 Nanometern mittels UV-Vis-Spektroskopie. Falls die Absorption der verdünnten M-E-H-P-P-V-Stammlösung höher als 0,17 ist, verdünnen Sie die unverdünnte M-E-H-P-P-V-Stammlösung, indem Sie jeweils ein Milliliter THF hinzufügen, bis die gemessene Absorption bei 495 Nanometern im Bereich von 0,13 bis 0,17 liegt. Bereiten Sie anschließend die Nanopartikel nach der Fällungsmethode vor, indem Sie ein Milliliter einer gemischten M-E-H-P-P-V-P-C-B-M-Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze mit angebrannter Nadel überführen. Schnell.Geben Sie ein Milliliter der gemischten M-E-H-P-P-V-P-C-V-M-Lösung in vier Milliliter entionisiertes Wasser, das mit 1200 U/min gerührt wird, und stoppen Sie unmittelbar nach der Injektion das Rühren. Verwenden Sie diese Nanopartikel ohne weitere Aufarbeitung, um eine PDT an Zellen durchzuführen, die mit Nanopartikeln inkubiert wurden. Beschriften Sie zunächst einen Satz von 96-Well-Platten, wie im textlichen Protokoll beschrieben.Rufen Sie dann die Zellen aus den Kulturflaschen, indem Sie das Medium entfernen und die Zellen zweimal mit docos-phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS waschen, gefolgt von einer Inkubation der Zellen mit 0,05 % Trypsin für 10 Minuten bei zwei Millilitern Delcos-modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, zu der resultierenden Zelllösung. Mischen Sie die Lösung gründlich, um Zellklumpen in Einzelzellen aufzulösen. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension zu 900 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, mischen Sie gut und geben Sie 10 Mikroliter dieser Suspension auf ein Hämozytometer.Zählen Sie die Zellen mithilfe des Hämozytometers und stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf 50.000 Zellen pro Milliliter ein. Anschließend besäen Sie die 96-Well-Platte, indem Sie 50 Mikroliter der Zelllösung in die Wells geben, wodurch jeweils 2.500 Zellen pro Well ausgebracht werden. Bereiten Sie danach verschiedene Nanopartikelkonzentrationen vor, indem Sie 2100 bzw. 180 Mikroliter der hergestellten Nanopartikelsuspension zu DMEM hinzufügen, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erreichen.Nach 24 Stunden waschen Sie die Vertiefungen mit einem X-D-P-B-S und geben 50 Mikroliter steigender Konzentrationen von Nanopartikeln in die Vertiefungen. Jede Zelllinie weist für jede Konzentration von Nanopartikeln Triplikate auf. 24 Stunden nach Zugabe der Nanopartikel.Waschen Sie die Zellen mit einem X-D-P-B-S und geben Sie 50 Mikroliter Hank’s Balanced Salt Solution oder HBSS in jede Vertiefung, um die Zellen zu bestrahlen. Heizen Sie die Lampe des Sonnensimulators 15 Minuten lang vor. Platzieren Sie einen UV-Filter vor der Lampe, um UV-Licht herauszufiltern. Kalibrieren Sie die Lampe mit einer Referenzsolarzelle, indem Sie die Lampenleistung so einstellen, dass hier auf der Oberfläche der 96-Loch-Platte eine Intensität von 0,5 Sonnen erreicht wird.Dieser Zustand wurde mit einer Leistung von 218 Watt, die der Lampe zugeführt wurden, erreicht. Stellen Sie die 96-Well-Platte mit geöffnetem Deckel unter die Lampe und bestrahlen Sie die Zellen 60 Minuten lang, was nach einer Bestrahlung zu einer Lichtdosis von 180 Joule pro Quadratzentimeter führt. Ersetzen Sie das HBSS durch 50 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, und inkubieren Sie die Platten für die jeweiligen Zeiträume nach der photodynamischen Therapie.Nach jedem Zeitintervall die Zellviabilität messen, indem 10 Mikroliter MTT in die Vertiefung gegeben werden. Die Platte vier Stunden lang inkubieren, damit Kristalle entstehen können. Anschließend 50 Mikroliter der Lösungsmittellösung in die Vertiefungen geben und die Platte sechs Stunden lang inkubieren.Um die Kristalle aufzulösen. Messen Sie die Zellviabilität, indem Sie die Absorption bei 570 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader aufzeichnen, um die intrinsische Zytotoxizität der Nanopartikel zu bestimmen. Lesen Sie die 96-Well-Platte ohne Anwendung von PDT aus, um die Aufnahme der Nanopartikel zu messen.Nachweis von nach der PDT gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies sowie Nachweis von Apoptose und Nekrose nach der PDT. Zuerst die Lampen des Mikroskops und den Laser einschalten, 30 Minuten vor der Bildaufnahme. Die Petrischale mit den fixierten Zellen auf die Mikroskopbühne stellen.Sammeln Sie die Fluoreszenz von Nanopartikeln. RROS-Erkennungsreagenz Propidium wurde abgetötet. Eine XIN fünf fitsi und DPI überlagern die Phasenkontrastbilder und die Fluoreszenzbilder in der Software Image J. Hier werden repräsentative Ergebnisse nach der Inkubation von Nanopartikeln mit verschiedenen Zelllinien gezeigt.Die Ocar-Dreizelllinie zeigt die höchste Aufnahme, gefolgt von 5 49 und MDA MB 2 31. TE 71 zeigt keine Fluoreszenz von Nanopartikeln. Die Messungen der Zellviabilität an diesen Zelllinien bei Dunkelheit sind hier in den Balkendiagrammen dargestellt.Es tritt praktisch kein Zelltod bis zu 96 Stunden in keiner der Zelllinien auf. Die durch ein ROS-Detektionsreagenz nachgewiesene ROS-Bildung ist hier für die drei Zelllinien dargestellt. In dieser Kontrollprobe.Es gibt keine grüne Fluoreszenz, da keine Nanopartikel und keine Lichtdosis vorhanden sind. Wenn jedoch sowohl die Nanopartikel- als auch die Lichtdosis unmittelbar nach der PDT den Zellen verabreicht werden, ist die intensive grüne Fluoreszenz des R os-Detektionsreagenzes sichtbar. Die Zellviabilität nach DT wird hier durch das Balkendiagramm für verschiedene Nanopartikeldosen dargestellt.Die Ergebnisse des Live-Dead-Doppelfärbungsversuchs sind hier dargestellt, bei dem die Car-3-Zelllinie bei hoher Dosis einer Lichtbehandlung einer Nekrose unterliegt, während die Zellen bei geringer Lichtdosis einem apoptotischen Zelltod unterworfen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zusammengesetzte leitfähige Polymer-Nanopartikel für die Anwendung in der photodynamischen Therapie zur Behandlung von Krankheiten herstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. In diesem Protokollvideo wird eine PDT-basierte Methode verwendet, um das phototoxische Potenzial eines potenziellen Photosensibilisators in Lungenkrebszellen zu bewerten.

In vitro Phototoxizitäts-Assay: Eine PDT-basierte Methode zur Bewertung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators in Lungenkrebszellen

Organische Farbstoffmoleküle und ölsäurebeschichtete Upconverting-Nanopartikel sind nicht wasserlöslich. Dieses Protokoll beschreibt eine "Plug-and-Play"-Methode, die den Transfer von organischen Farbstoffmolekülen und die Umwandlung von Partikeln von ihrem ursprünglichen hydrophoben Lösungsmittel in Wasser ermöglicht.

A &#39;Plug and Play&#39; Methode, um Wasser dispergierbare Nanoanordnungen mit einem Gehalt eines amphiphilen Polymers, organische Farbstoffe und Hochskalierungs-Nanopartikel erstellen

Es wird ein Verfahren zur Stimulation der elektrischen Aktivität von in-vitro-Zellkulturen mit sichtbarem Licht beschrieben, das auf der Verwendung organischer halbleitender Polymere basiert.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Es wird ein Protokoll für die Synthese und Herstellung von Nanopartikeln vorgestellt, die aus elektroaktiven Polymeren bestehen.

Elektroaktiven Polymer-Nanopartikel Teilnahmephotothermische Eigenschaften

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine alternative Wahl zur Behandlung von Lungenkrebs. Um die therapeutische Wirkung der PDT zu erhöhen, wurden Nanopartikel entwickelt, die auf Lungenkrebs abzielen und mit einer Chemotherapie kombiniert werden. Sowohl in vitro als auch in vivo wurde die Wirksamkeit der PDT mit präparierten Nanopartikeln gegen Krebs untersucht.

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.

Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Die zunehmende Inzidenz von arzneimittelresistenten Candida albicans ist weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Pilzinfektionen bieten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die bengalenvermittelte aPDT-Wirksamkeit von Rose auf einem multiresistenten C. albicans-Stamm in vitro.

Rosenbengalen-vermittelte photodynamische Therapie zur Hemmung von Candida albicans

Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung einer photoresponsiven Prodrug-Farbstoff-Nanoanordnung. Die Methodik zur Wirkstofffreisetzung aus den Nanopartikeln durch lichtgesteuerte Demontage, einschließlich des Lichtbestrahlungsaufbaus, wird explizit beschrieben. Die Wirkstoffe, die nach Lichtbestrahlung aus den Nanopartikeln freigesetzt wurden, zeigten eine hervorragende Antiproliferationswirkung auf menschliche kolorektale Tumorzellen.

Einfache Herstellung und Photoaktivierung von Prodrug-Dye-Nanoassemblys

In diesem Artikel wird das Protokoll zur Herstellung von Tumor-Gewebe-Phantomen vorgestellt, die optische Eigenschaften für die plasmonische photothermische Therapie replizieren. Es beschreibt die Phantompräparation, photothermische Bewertungen und die Validierung des entwickelten numerischen Modells auf der Grundlage photothermischer Temperaturmessungen zur Bewertung therapeutischer Parameter und bietet eine ethische, kostengünstige Alternative zu In-vivo-Studien für Vortests.

Plasmonische photothermische Krebstherapie: Nanopartikel-eingebettete Tumorgewebe-imitierende Phantome zur Visualisierung der photothermischen Temperaturverteilung

Erfahren Sie die Herstellung von leitenden Polymer-Nanopartikeln mit Fulleren für die photodynamische Therapie bei Krebs. Diese Methode ermöglicht die gezielte Behandlung aggressiver Tumore wie Ovarialkarzinome.

Photodynamische Therapie mit Blended leitendes Polymer / Fullerene Nanopartikel Photosensibilisatoren

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