Herstellung und Charakterisierung von Einzel-und Multi-Wirkstoff beladen Körperlich Eingeschlossene Polymermicellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen Schritt-für-Schritt-Prozess zur Herstellung und Charakterisierung von Arzneimittel-beladenen My-Zellen darzulegen, bevor diese in Modellen von Krankheitszuständen untersucht werden. Dies wird erreicht, indem die My-Zellen mittels Gießverfahren mit Lösungsmittel hergestellt werden, um reproduzierbare My-Zellen für die Studie zu erzeugen. Als zweiter Schritt erfolgt die Bewertung der Belastungsstabilität und Größe der My-Zellen, wodurch die Fähigkeit der My-Zellen, klinisch relevante Konzentrationen aufzunehmen und zu speichern, bestimmt wird.

Anschließend wird die Freisetzungsrate des Wirkstoffs aus den My-Zellen bestimmt, um sicherzustellen, dass die My-Zellen geeignete in-vitro-Freisetzungscharakteristika aufweisen, bevor die in-vivo-Stabilität bewertet wird. Die Ergebnisse zeigen, dass reproduzierbar hergestellte stabile My-Zellen eine Plattform darstellen, um die Wirkstoffabgabe bei verschiedenen Krankheitszuständen basierend auf den hier vorgestellten Bewertungstechniken zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie Gleichgewichtsladung oder Dialyseverfahren besteht darin, dass die Myosine wesentlich schneller hergestellt werden können, wobei eine reproduzierbare Wirkstoffbeladung und Partikelgröße erreicht wird.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie oder Diagnose verschiedener Krankheitszustände, da nanoskalige Arzneimittel Möglichkeiten jenseits konventioneller Formen bieten. Im Allgemeinen könnten Anfänger Schwierigkeiten mit diesen Techniken haben, obwohl sie einfach erscheinen, da man dennoch Freisetzungsstudien durchführen muss und den Burst-Effekt nicht wirklich beurteilen kann. Diese Verfahren werden von Shaman Duke, meinem Doktoranden, und Deepa, meiner Kooperationspartnerin, demonstriert. Wiegen Sie zunächst einen Milligramm DTX, einen Milligramm EVR und 15 Milligramm Peg 4,000-Block-PLA 2200 für die duale Arzneimittel-Mikrozellen oder DDM ab. Nach dem Abwiegen lösen Sie die Arzneistoffe und das Polymer in 0,5 Milliliter Acetonitril auf und überführen die Lösung in einen 5-Milliliter-Rundkolben. Stellen Sie einen dünnen, arzneistoffverteilten Polymerfilm her, indem Sie unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer das Arzneistoff-Polymer-Acetonitril-Gemisch verdampfen.

Nach diesem Schritt das Arzneimittel-Polymer-Film mit 0,5 Milliliter deionisiertem Wasser, das auf 50 Grad Celsius vorgewärmt wurde, rehydrieren und das Gefäß vorsichtig in einem Wasserbad mit 50 Grad Celsius schütteln, um die Mäusezellen zu bilden. Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen überführen und bei 7.200 ×g für drei Minuten zentrifugieren. Die Lösung mit einer Spritze aufziehen und die resultierende micellare Lösung über einen 0,2-Mikron-Nylon-Filter in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen filtrieren, um ungelöstes Arzneimittel oder Verunreinigungen zu entfernen. Führen Sie an diesem Punkt eine umgekehrte HPLC-Analyse mit einer C8-Säule durch, die bei 40 Grad Celsius im isokratischen Modus mit einer mobilen Phase aus Acetonitril und Wasser equilibriert wurde. Verdünnen Sie die frisch hergestellten Mizellen vor der Analyse mittels umgekehrter Phasen-HPLC in Acetonitril im Verhältnis 1:100, um die anfängliche Arzneimittelbeladung zu bestimmen.

Nachdem ich meine Zellen 48 Stunden bei Raumtemperatur unverdünnt gelagert habe, bereiten Sie frische verdünnte Proben vor, um diese mittels umgekehrter Phasen-HPLC erneut zu analysieren und die Stabilität des Wirkstoffs in meinen Zellen über einen Zeitraum von 48 Stunden zu bestimmen. Überwachen Sie die DTX- und DVR-Peaks bei 227 bzw. 279 Nanometern mit Retentionszeiten von 1,7 und 5,7 Minuten. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung der Wirkstoffbeladung dar.

Als Nächstes verdünnen Sie die frisch hergestellten My-Zellen und deionisiertes Wasser im Verhältnis 1 zu 20, um eine endgültige Polymerkonzentration von 1,5 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Überführen Sie die Lösung in eine Küvette zur Messung der dynamischen Lichtstreuung. Messen Sie die Intensität des Helium-Neon-Lasers unter einem Winkel von 173 Grad, um die Streuung zu bestimmen.

Stellen Sie die Daten als mittlere Z-Durchschnittsgröße plus/minus Standardabweichung zusammen mit dem Polydispersitätsindex oder PDI der Verteilung dar. Nachdem Sie DDM wie zuvor beschrieben hergestellt haben, geben Sie 2,5 Milliliter Ihrer Zellen in eine 3-Milliliter-Dialyseskassette mit einer Molekulargewichts-Sperrgrenze von 7.000 Gramm pro Mol. Stellen Sie die Kassette während der folgenden Intervalle in 2,5 Liter 10-Millimolar-pH-7,4-Phosphatpuffer.

Entnehmen Sie 150 Mikroliter der Lösung und ersetzen Sie diese durch 150 Mikroliter frischen Puffer. Wechseln Sie den Puffer alle drei Stunden, um synchronisierte Bedingungen sicherzustellen. Analysieren Sie die Proben mittels umgekehrter HPLC, um die Wirkstoffkonzentrationskurve zu bestimmen.

Passen Sie die Freisetzungsdaten des Wirkstoffs anhand eines einfachen Diffusionsmodells mit einer einphasigen exponentiellen Assoziation unter Verwendung der statistischen Software D-T-X-E-V-R an, und das DDM zeigte über 48 Stunden hinweg eine ähnliche Stabilität in PEG 2000 Block PLA 1800 oder PEG 2000 Block PLA 2200. Alle meine Zellen behielten nach 48 Stunden bei Raumtemperatur 97 % oder mehr der anfänglichen Beladung. Basierend auf den Ergebnissen der dynamischen Lichtstreuung zeigten alle meine Zellen eine unimodale Verteilung mit PDI-Werten unter 0,2.

Aufgrund der Daten betrug die Freisetzung von DTX aus einzelnen Myzellen und DDM innerhalb von 48 Stunden etwa 60 %. Die Freisetzung von EVR aus einzelnen Myzellen und DDM betrug jeweils 60 % bzw. 50 %. Die hier dargestellten Daten zeigen die Zeit, die für die Freisetzung von 50 % des Wirkstoffs aus einzelnen Myzellen und DDM erforderlich war, sowie die Güte der Anpassung der Daten.

Die Güte der Kurvenanpassung für alle meine Zellen außer für die einzelne EVR-Zelle liegt bei über 0,950, was bedeutet, dass die Annahme einer Freisetzung erster Ordnung eine gute Näherung darstellt, um die Arzneimittelfreisetzung aus einzelnen meinen Zellen und DDM zu erklären. Sobald diese Techniken beherrscht sind, können sie routinemäßig an einer Bibliothek von Wirkstoffen und Polymeren wie meinen Zellen innerhalb weniger Stunden bis zu einer Woche durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, meine Zellen vollständig zu charakterisieren, bevor auf Zellkulturen oder Tiermodelle gemäß diesen Verfahren zugegriffen wird. Andere Abgabesysteme wie liposomale Abgabesysteme können ebenfalls evaluiert oder charakterisiert werden, um die Frage nach der Rolle des Arzneimittelabgabesystems bei der Wirksamkeit der Behandlung zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arzneimittel beladene Zellen vorbereitet und charakterisiert, bevor man sie bei einer Krankheit im Zustand des Interesses evaluiert.