Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zusammensetzung extrazellulärer Matrizen aus Geweben mittels Massenspektrometrie zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem das ausgewählte Gewebe zunächst so lange aufgebrochen wird, bis es vollständig homogenisiert ist. Der zweite Schritt beinhaltet die Dezellularisierung des Gewebes, um es für extrazelluläre Matrixproteine anzureichern, während gleichzeitig alle intrazellulären Komponenten erschöpft werden.

Als nächstes wird die mit EZM angereicherte Proteinprobe im letzten Schritt denaturiert, die denaturierte EZM-angereicherte Proteinprobe wird deglycosyliert und zu Peptiden verdaut. Die westliche Blutanalyse wird verwendet, um die Qualität der Dezellularisierung und der EZM-Proteinanreicherung zu überwachen. Letztendlich ermöglicht die massenspektrometrische Analyse der Peptide die Charakterisierung der Zusammensetzung der EZM für das jeweilige Gewebe.

Diese Methode kann Aufschluss über die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix normaler Gewebe geben, kann aber auch auf andere Systeme wie Krankheitsgewebe wie Krebs angewendet werden. Bereiten Sie zunächst alle Puffer vor, wie im Textprotokoll angegeben. Tabelle eins, einschließlich der Zugabe von Proteaseinhibitoren.

Anschließend werden 100 mg Gewebe in 500 Mikrolitern Puffer C mit einem Gewebehomogenisator zerkleinert, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten wird. Übertragen Sie das Homogenat in einen Röhrchenrotator und inkubieren Sie es 20 Minuten lang. Bei vier Grad Celsius hatte das Rohr 10 bis 20 Mikroliter der Probe in ein Röhrchen, das als Gesamtgewebeextrakt oder Ausgangsmaterialblitz gekennzeichnet war. Frieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Homogenat bei 16.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einem sauberen Röhrchen und beschriften Sie ihn als zytosolische oder C-Fraktion. Blitz. Frieren Sie die C-Fraktion ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Pipettieren Sie dort. Suspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern Puffer doppelt und inkubieren Sie es dann 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenrotator. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe und verwerfen den Überstand, um zuerst die Kernproteine zu extrahieren.

Das Pellet in 150 Mikrolitern Puffer N resuspendieren und 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenrotator inkubieren. Zentrifugieren Sie anschließend die Probe und sammeln Sie den Überstand in einem sauberen Röhrchen. Die Inkubation in Puffer N wird nach der Zentrifusion wiederholt.

Kombinieren Sie die Überstände und bezeichnen Sie sie als Kern- oder N-Fraktion. Blitz. Frieren Sie die N-Fraktion für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius ein. Fügen Sie 100 Mikroliter Puffer M und Reanimation hinzu, suspendieren Sie das Pellet.

Inkubieren Sie die Probe anschließend 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenrotator, bevor Sie sie zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand in einem sauberen Röhrchen und beschriften Sie ihn als Membran- oder M-Fraktionsblitz. Frieren Sie die M-Fraktion ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Suspendieren Sie das Pellet erneut in 200 Mikrolitern Puffer CS, indem Sie es kräftig pipettieren und inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang auf einem Röhrchenrotator. Bei Raumtemperatur wird die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand in einem sauberen Röhrchen aufgefangen und als Zytoskelett- oder CS-Fraktion gekennzeichnet. Das Pellet sollte nun deutlich kleiner sein.

Suspendieren Sie das Pellet erneut in 150 Mikrolitern Puffer C. Übertragen Sie die Probe in einen Röhrchenrotator und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand auffangen. Kombinieren Sie anschließend den Überstand mit dem Überstand aus dem CS-Puffer in dem Röhrchen, das bereits als Zytoskelett- oder CS-Fraktion gekennzeichnet ist. Blitz.

Frieren Sie die CS-Fraktion ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Um das Pellet zu waschen, resusen Sie. Suspendieren Sie es in 500 Mikrolitern PBS und inkubieren Sie es dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenrotator.

Das Röhrchen zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Insgesamt dreimal waschen. Um das mit ECM angereicherte Pellet zu erhalten, lagern Sie einen kleinen Teil der ECM-Fraktion für die QC-Analyse des Experiments im westlichen Block.

Die Fraktionen in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die Verdauung zu beginnen. Zuerst wird das mit ECM angereicherte Pellet in acht molaren Harnstoff resuspendiert und eine Lösung von Dihi-Drei-Etol-Salz in Wasser hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erreichen.

Übertragen Sie das Röhrchen in einen Inkubator und schütteln Sie es zwei Stunden lang bei 1400 U/min bei 37 Grad Celsius. Als nächstes kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur ab und fügen Sie eine Lösung von rekonstituiertem IOTA-Acetamid in Wasser auf eine Endkonzentration von 25 Millimolar hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang im Dunkeln.

Bei Raumtemperatur auf eine Harnstoffkonzentration von zwei molaren mit 100 millimolaren Ammoniumbicarbonat verdünnen und dann P PGA F hinzufügen. Die Probe in einen Inkubator geben und zwei Stunden lang bei 1400 U/min schütteln. Bei 37 Grad Celsius Endoprotease hinzufügen, C in Scheiben schneiden und bei 1400 U/min zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius schütteln. Als nächstes Trypsin hinzufügen und über Nacht bei 1400 U/min bei 37 Grad Celsius schütteln.

Die trübe Lösung sollte nach dem Übernachtverdau bei einem zweiten Trypsin-Quad klar werden und weitere zwei Stunden lang schütteln, um die Trypsinpipette 50%ige Trifluoressigsäure in der Mischung in Schritten von einem Mikroliter zu inaktivieren, bis der pH-Wert weniger als zwei beträgt. Überwachen Sie den pH-Wert, indem Sie einen Mikroliter der Peptidlösung auf pH-Papier aufbringen. Zentrifugieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Sammeln Sie schließlich den Überstand in einem sauberen Röhrchen mit geringer Retention. Lagern Sie die ECM-Peptidlösung bei minus 20 Grad Celsius. Die Western Blots aus der Dezellularisierung von spiegelndem Lungengewebe zeigen die Extraktion von intrazellulären Komponenten wie ASIN, beta, eins, Aktin, GA, dh und Histonen in den intermediären Fraktionen.

Diese Komponenten fehlen in der ECM-Fraktion fast vollständig, obwohl einige geringfügige Histonkontaminationen zurückbleiben. Im Gegensatz dazu ist Kollagen eins in der ECM-Fraktion stark angereichert, wird aber in den anderen Fraktionen nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass während der Zwischenschritte der Extraktion kein Kollagen verloren geht. Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem menschlichen Gedächtniskarzinom erzielt.

Xenotransplantat-Kollagen eins war in der EZM-Fraktion signifikant angereichert, mit nur einem geringen Verlust an der CS-Fraktion. Ein Teil der Restkontamination von Aktin verblieb in der ECM-Fraktion Nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete Biologen und Klinikern den Weg, die Komplexität der extrazellulären Matrix von normalem und krankem Gewebe zu erforschen.