Name: Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Kalibrierung ionenselektiver Mikroelektroden zur Messung extrazellulärer Natrium- und Kaliumkonzentrationen in Hirngewebe. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Ionendynamik in akuten Mäuse-Hippocampus-Schnitten.

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Die Autoren danken C. Rodrigo für erfahrene technische Unterstützung danken. Wir danken S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) um Hilfe bei der Videoproduktion. Forschung im Laboratorium des Verfassers wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (DFG: Ro 2327 / 8-1 zur CRR), der Heinrich Heine Universität Düsseldorf (NH) und National Institutes of Health gewähren R01NS032123 (MC).

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Flüssigträgergestützter, ionenselektiven Elektroden sind seit Jahrzehnten erfolgreich und für viele Ionen eingesetzt werden, sind hochspezifische Sensoren erhältlich 22-26. Wenn sie in den extrazellulären Raum (ECS) des Wirbeltiergehirns Zubereitungen verwendet werden, muss man im Hinterkopf behalten jedoch, daß dies eine sehr invasive Technik: Während die Breite des ECS beträgt nur etwa 20-50 nm, der Durchmesser der ionenselektiven Mikroelektroden ist etwa 1 um (doppelläufige Elektroden) oder größer (konzentrischen Elektroden). Die Spitzen der ionenselektive Mikroelektroden wird das Gewebe während ihrer impalement des Gewebes also nicht nur zerstört, sondern vergrößern auch den ECS, wodurch ein Unterschätzung der Ionen Transienten. Trotz dieser Gefahren sind extrazelluläre Ionen Transienten in Reaktion auf die neuronale Aktivität bemerkenswert konsistent zwischen verschiedenen Labors 7,8, zur Bestätigung der Zuverlässigkeit dieses Verfahrens. Die Leistung und die Eignung von ionenselektiven Elektrodenist abhängig von der Empfindlichkeit und Selektivität, die mit dem Sensor-Cocktail (&quot;Flüssigmembran Ionophor &#39;) verwendet definiert ist. Sensor Cocktails enthalten eine spezielle Trägermolekül, zum Beispiel Valinomycin für K + -selektiven Mikroelektroden, die eine hohe Selektivität für Kalium 27 aufweist. Trotzdem können bei Kreuzreaktivität mit anderen Ionen sind und getestet werden müssen. Valinomycin eine signifikante Kreuzreaktivität für Ammonium, die bei der Interpretation Ergebnisse werden muss (zB 11,12). Da ferner die Spannungsantwort der Ionophoren folgt einer Nernst-Verhalten (siehe Gleichung 1), das Signal-zu-Rausch-Verhältnisses und des Schwellenwertes abhängig von der Konzentration des Ions zu messen. So, während kleine [K +] o Transienten wecken große Spannungsänderungen gegenüber dem niedrigen Ausgangswert [K +] o, klein [Na +] o Transienten sind sehr viel schwieriger, gegen die hallo erkennengh Basis [Na +] o (siehe Figur 5 und 6). Die Leistung von ionenselektiven Elektroden ist auch durch die zeitliche Auflösung, die im Wesentlichen durch seine elektrische Zeitkonstante geregelt bestimmt. Letzteres wird vor allem durch den axialen Widerstand des Sensors ermittelt und durch die verteilte Kapazität entlang der Länge der Pipette zwischen ihren internen Lösungen und des externen Fluids. In der doppelläufigen Konfiguration ist der Widerstand hoch ist, aufgrund der langen Spalte verfüllt Ionensensor. Für eine gegebene isolierendes Dielektrikum (in diesem Fall Borosilikatglas), wird die Kapazität durch die Dicke des Dielektrikums bestimmt. In doppelläufige Elektroden beträgt die dielektrische Breite an der Glaswand der Pipette. Das Glas dünner in der Nähe der Spitze, fällt die dielektrische Breite und die Kapazität ansteigt. Diese Faktoren kombinieren, um Elektroden mit Reaktionszeiten, die von einigen hundert Millisekunden bis zu mehreren nahrungsmittelSekunden, da diese Faktoren variiert. Ein Hauptvorteil des konzentrischen Konstruktion ist, daß sowohl der axiale Widerstand und die Kapazität an das Bad stark gesunken sind. Die konzentrischen Pipetten Shunts meisten der Widerstand des verfüllten Ionenaustauscher, so dass nur ein Rest in dem letzten Mikrometern vor der Spitze. Darüber hinaus wird die Füllung Lösung innerhalb des konzentrischen Pipetten physikalisch aus dem Bad entfernte, getrennt durch die Dicke von zwei Glaswänden, die Kapazität stark reduziert wird. Wie früher gezeigt 10, ist die kombinierte Wirkung der verringerten Widerstand und Kapazität eine Verbesserung der zeitlichen Auflösung von zwei Größenordnungen. Im Fall von konzentrischen Ca 2+ und pH-Mikroelektroden, waren so günstig wie 10-20 msec 10 90% Reaktionszeiten. Ein verwandter Vorteil der konzentrischen Design ist die geringeren Geräuschpegel (siehe Abbildung 8). Aufgrund der stark reduzierten Widerstand, Spannungsspitzen von jedem Ambient Rauschen minimiert. Außerdem ist die Wiederherstellung von solchen schnellen Transienten aufgrund der schnellen Zeitkonstante. Solche Artefakte sind daher klein und schnell und haben eine weniger störend auf physiologische Aufzeichnungen (siehe Abbildung 8). Gibt es auch Nachteile des konzentrischen Technik. Erstens ist ihre Montage komplizierter und zeitraubend. Ein zweiter Nachteil ist die Notwendigkeit, eine separate Referenzmikroelektrode mit seiner Spitze zu platzieren und beinhaltet die Verwendung entweder eines getrennten Mikromanipulators oder eines spezialisierten Dual-Manipulator. Schließlich kann doppelläufige Mikroelektroden zu einer dreirohrige Design erweitert werden, was die Detektion von zwei verschiedenen Ionenspezies gleichzeitig 28, die nicht für die konzentrischen Elektroden möglich. Die häufigsten Fallstricke Ineffiziente Silanisierung. Der wichtigste Schritt, und Haupthindernis bei der Herstellung einer flüssigkeits sensoder auf der Basis ionenselektive Mikroelektroden ist die Silanisierung Verfahren. Wenn die Elektroden nicht auf Änderungen der spezifischen Ionenkonzentration reagieren oder zu antworten, mit einer Unter Nernst-Reaktion (dh, auch weniger als 58 mV pro zehnfacher Konzentrationsunterschied) ist schlechte Wirksamkeit der Silanisierung in der Regel die Ursache. Nach unserer Erfahrung kann dies auftreten, wenn der Luftfeuchtigkeit zu hoch ist, oder zu niedrig ist, typisch für die Bedingungen in der Höhe des Sommers oder Winters auf. Wenn es möglich ist, eine gewisse Kontrolle über Raumfeuchte ausüben können diese Probleme überwunden werden. Elektrodenwiderstand ist zu hoch. Falls nötig, kann der Widerstand des ionensensitiven Trommel durch Abschrägung reduziert werden. Zu diesem Zweck aussetzen seiner Spitze mit einem starken Strahl eines Schleif in Wasser für ein paar Sekunden ausgesetzt. Dies führt dazu, seine oberste Spitze zu brechen und senken Sie den Widerstand auf den gewünschten Wert. Salzbrücken. SalzBrücken zwischen den Ionen und Referenz Barrel führen zu schlecht oder gar nicht reagierenden Elektroden und somit auch stark ihre Leistung bei der Kalibrierung zu verwechseln. Wie bereits erwähnt (siehe Punkt 1.6.), Ist dies vor allem ein Problem, wenn doppelläufige Theta Glas gewählt wird, ist jedoch ein seltenes Ereignis, wenn Sie das hier beschriebene Offset, verdreht Barrel-Technik. Mit Leichtigkeit der Herstellung vor Augen, kann die ursprüngliche doppelläufige Design Lux 29 oft gewinnbringend eingesetzt werden. Dieses Verfahren nutzt Vorbefüllung der Ionen und Referenz Fässer mit Salzlösungen, eine schnelle Einwirkung einer Silanlösung durch sein Ansaugen und Ausstoßen aus der Spitze, gefolgt von der Einarbeitung Ionenaustauscher, auch mittels der Spitze (siehe 30,31) . Diese Elektroden können in etwa 10 Minuten hergestellt werden, aber die Spitzengröße ist typischerweise 4 &amp; mgr; m oder mehr, und sie sind anfälliger für während eines Experiments scheitern. Im Gegensatz dazu Silanisierung Methoden beinhalten Exposition gegenüber Silan Dampf und Wärmeing können Elektroden mit kleineren Tipps, die Tage dauern, und manchmal Wochen zu produzieren. Zusammengenommen gibt es mehrere Protokolle und nähert sich, wie ionenselektive Mikroelektroden vorzubereiten. Hier haben wir zwei Hauptverfahren zur Herstellung von verdrillten Doppelnamen als auch konzentrische Mikroelektroden, die gut und zuverlässig in unseren Labors arbeiten beschrieben, mit einer Erfolgsquote von nahezu 100%. Wichtiger ist, dass diese Techniken zur Messung anderer Ionen Spezies, einschließlich pH oder Calcium übertragbar sein und wird auch auf andere Zubereitungen als das Gehirn, einschließlich flüssigkeitsgefüllten Hohlräumen oder Fluiden im Allgemeinen. Last, but not least, ionenselektiven Mikroelektroden ermöglichen die Bestimmung von Ionenkonzentrationen in den Zellen. Aufgrund ihrer relativ großen Düsengröße (~ 1 &amp; mgr; m), wird dies jedoch nur in Zellen mit einer großen Zellkörper, beispielsweise möglich, wie beispielsweise in wirbellosen Präparate 28,32 gefunden.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Die elektrische Signalübertragung im Gehirn basiert auf dem Fluss von Ionen durch Plasmamembranen. Wichtige Ionenbewegungen in und aus dem extrazellulären Raum werden nicht nur durch die Passage durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle vermittelt, sondern auch durch postsynaptische ionotrope Rezeptoren sowie Ionentransporter. Die neuronale Aktivität geht also mit komplexen Veränderungen der extrazellulären Konzentration aller wichtigen Ionen einher 1. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass der Einstrom von Natrium in Neuronen während der exzitatorischen Aktivität zu einer Abnahme der extrazellulären Natriumkonzentration ([Na+]o) führt 2. Gleiches gilt für die extrazelluläre Calciumkonzentration, da Calciumionen schnell sowohl in prä- als auch in postsynaptische Strukturen eindringen 3. Gleichzeitig bewegt sich Kalium in die entgegengesetzte Richtung, was zu einem Anstieg der extrazellulären Kaliumkonzentration ([K+]o) im niedrigen mM-Bereich führt 4,5. Die synaptische Aktivität verursacht auch Veränderungen des extrazellulären pH-Werts, die teilweise durch begleitende Gliamembranflüsse gemildert werden, die den intraglialen pH-Wert von 6,7 verändern. Diese aktivitätsbedingten Veränderungen der extrazellulären Ionenkonzentrationen haben signifikante funktionelle Konsequenzen. Zum Beispiel depolarisieren selbst kleine Erhöhungen von [K+]o Neuronen sowie Gliazellen, wodurch die neuronale Erregbarkeit verändert wird, und es gibt mehrere Mechanismen, um überschüssiges Kalium 8 zu entfernen. Ein Versagen dieser kann zu einer epileptiformen Aktivität von Neuronen oder zu Phänomenen wie der Ausbreitung von Depressionen führen 1. 
Aufgrund ihrer kritischen Bedeutung ist die quantitative Bestimmung der extrazellulären Ionenkonzentrationen oft notwendig und erforderlich, um die Funktion und Dysfunktion neuronaler Netzwerke unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu verstehen. Seit Jahrzehnten haben sich doppelläufige ionenselektive Mikroelektroden als hervorragende Werkzeuge für solche Messungen im Hirngewebe erwiesen 9. Für viele Ionen stehen hochspezifische Sensoren mit geringer Kreuzreaktivität für andere Ionen zur Verfügung. Neben den klassischen doppelläufigen Elektroden wurden vor kurzem sogenannte konzentrische Elektroden eingeführt. Letztere bieten eine überlegene Zeitauflösung, erfordern jedoch etwas mehr Zeit und Mühe, um 10 zu erstellen. 
Im Folgenden beschreiben wir die Vorbereitung und Kalibrierung dieser beiden Arten von ionenselektiven Mikroelektroden. Anschließend zeigen wir, wie diese Elektroden in Hirnschnittpräparaten eingesetzt werden können, um Veränderungen in [K+]o oder [Na+]o zu messen, die durch exzitatorische Aktivität induziert werden, indem wir verschiedenen Stimulationsparadigmen folgen, einschließlich Bad- und Druckanwendung von Medikamenten.

<table><tbody><tr><td>Abrasiv&nbsp; &nbsp;</td><td>Mikropolitur&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Gelöst in A.dest</td></tr><tr><td>Borosilikatglaskapillaren</td><td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Anwendung Pipette; 75 mm x 2 mm, Wandstärke 0,3 mm</td></tr><tr><td>Borosilikatglaskapillaren mit Filament</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatur</td><td>Für den Sensor von doppelläufigen Mikroelektroden&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatur</td><td>Als Referenz für doppelläufige Mikroelektroden&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Wissenschaft Produkte</td><td>Konzentrischer, äußerer Kanal. Außendurchmesser 2,0 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>Konzentrischer, innerer Kanal. Außendurchmesser 1,2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Elektrometerverstärker mit Kopftisch</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td><td>Rin = 10 T&Omega; und Ibias=50 fA-1pA (kommerziell erhältlich&nbsp; Alternativen: z.B. Dagan IX2-700, mit Kopftisch (10 Gig Rückkopplungswiderstand) oder EPMS-07, NPI, Tamm, Deutschland)</td></tr><tr><td>Experimentierkammer</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td><td>Kommerziell erhältlich von <>z.B. &nbsp; Warner Instruments, USA; &nbsp; Scientifica, UK</td></tr><tr><td>Ofen</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Muss konstant bei 200 &° bleiben; C</td></tr><tr><td>Hartes klebriges Wachs / Zahnwachs</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Böhme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Kochplatte</td><td></td><td>nach Maß</td><td>Muss konstant bei 40 Grad bleiben; C</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenhalter aus Plexiglas</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td><td>Doppelläufig: Außendurchmesser &nbsp; Kapillaren 1,5 mm, konzentrisch: AD &nbsp; Kapillaren 2 mm</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>MD4R</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Objektivplan</td><td>0,8xLWD</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Modell PP-830</td><td>Narishige</td><td>Konzentrische Mikroelektroden&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Modell P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Sensor von konzentrischen Mikroelektroden&nbsp;</td></tr><tr><td>Pneumatisches System zur Abwurfung von Medikamenten</td><td>Picospritzter Typ II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Travel Schwalbenschwanztisch</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Zweikomponenten-Kleber</td><td> Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>Man kann auch einen kleinen Streifen Aluminiumfolie verwenden, um die Kapillaren zusammenzukleben.</td></tr><tr><td>Silberdraht</td><td>99,9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Slicer / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Abzieher&nbsp;</td><td>Typ PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>Mit drehbarem Spannfutter für doppelläufige Mikroelektroden</td></tr><tr><td>x/y Translationstisch</td><td></td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td></tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus;)-Bicucullinmethiodid</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>Kompetitiver Antagonist von GABAA-Rezeptoren (lichtempfindlich); VORSICHT toxischer</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/Kainat-Rezeptor-Antagonist; VORSICHT: toxisches</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA-Rezeptor-Antagonist; VORSICHT toxisch</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>ACHTUNG: Entzündlich, akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) und ätzend für Metalle und Haut</td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Aktiviert NMDA und Nicht-NMDA und EAATs</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Mononatriumsalzhydrat</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Aktiviert NMDA-R, AMPA-R, QA-R und KA-R),&nbsp; mGluRs und EAATs</td></tr><tr><td>Kalium-Ionophor I - Cocktail B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>Basierend auf Valinomycin; VORSICHT giftiges</td></tr><tr><td>Natriumionophor II - Cocktail A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>Basierend auf ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor spannungsabhängiger Na+ Kanäle; VORSICHT giftiges</td></tr><tr><td>Wasser, ultrareines</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

doppelläufige und concentric mikroelektroden zur messung der extrazellulären ionensignale im hirngewebe

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Die elektrische Aktivität im Gehirn wird von signifikanten Ionenflüssen durch die Membranen begleitet, was zu komplexen Änderungen in der extrazellulären Konzentration aller wichtigen Ionen führt. Da diese Ionenverschiebungen signifikante funktionelle Konsequenzen haben, ist ihre quantitative Bestimmung oft erforderlich, um die Funktion und Dysfunktion neuronaler Netzwerke unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu verstehen. In der vorliegenden Studie demonstrieren wir die Herstellung und Kalibrierung von doppelläufigen ionenselektiven Mikroelektroden, die sich als hervorragende Werkzeuge für solche Messungen im Hirngewebe erwiesen haben. Darüber hinaus werden auch sogenannte "konzentrische" ionenselektive Mikroelektroden beschrieben, die aufgrund ihres unterschiedlichen Designs eine weitaus bessere zeitliche Auflösung von schnellen Ionenänderungen bieten. Anschließend zeigen wir, wie diese Elektroden in akuten Hirnschnittpräparationen des Hippocampus der Maus eingesetzt werden können. Mit Hilfe von doppelläufigen, kaliumselektiven Mikroelektroden werden Veränderungen der extrazellulären Kaliumkonzentration ([K+]o) als Reaktion auf exogene Applikation von Glutamatrezeptoragonisten oder während der epileptiformen Aktivität nachgewiesen. Darüber hinaus veranschaulichen wir die Reaktionseigenschaften von natriumempfindlichen, doppelläufigen und konzentrischen Elektroden und vergleichen deren Detektion von Veränderungen der extrazellulären Natriumkonzentration ([Na+]o), die durch Bad- oder Druckanwendung von Medikamenten hervorgerufen werden. Diese Messungen zeigen, dass die Ansprechamplituden zwar ähnlich sind, die konzentrischen Natrium-Mikroelektroden jedoch im Vergleich zum doppelläufigen Design ein überlegenes Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Ansprechzeit aufweisen. Im Allgemeinen lassen sich die demonstrierten Verfahren leicht auf die Messung anderer Ionenspezies, einschließlich pH oder Kalzium, übertragen und auch auf andere Präparate anwenden.

<html> Zur Überwachung von [K +] o und Veränderungen darin im Ansprechen auf exzitatorische Aktivität, eine doppelläufige kaliumselektive Mikroelektroden wurden in das Stratum radiatum von CA1-Bereich eingefügt. Wenige Minuten nach impalement, die ionenselektive Lauf der Elektrode erreicht eine stabile Basislinie (7A), entsprechend einer [K +] o von etwa 2,8 mm, einen Wert nahe dem [K +] des ACSF verwendet ( 2,5 mm). Badanwendung von 0,5 mM Glutamat für 10 sec induzierte eine reversible Zunahme von [K +] o von etwa 4 mm, gefolgt von einer Unterschreitung unter den Ausgangswert in Höhe von ~ 0,7 mM (Abbildung 7A). Absenken der Glutamatkonzentration auf 0,4, 0,3 und 0,2 mM verursacht eine entsprechende Verringerung der Amplitude von sowohl dem vorübergehenden Anstieg und dem Unter in [K +] o (7A). oad / 53.058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figur 7. Die extrazelluläre Kalium Transienten in Reaktion auf exzitatorische Aktivität. (A) [K +] o Transienten, bestehend aus einem Anstieg, gefolgt von einer Unterschreitung unter den Ausgangswert von Badanwendung verschiedener Konzentrationen von Glutamat für 10 sec induziert, wie angegeben. (B) Einfluss einer Perfusion mit Glutamat-Rezeptor-Blocker (CNQX, 100 &amp; mgr; M; APV, 100 &amp; mgr; M) und Tetrodotoxin (TTX; 0,5 &amp; mgr; M) auf [K +] o Transienten von Bad Applikation von 0,5 mM Glutamat für 10 Sekunden ausgelöst. (C) Spontane [K +] o Transienten in Gegenwart von 0 mg 2+ / BIC. Experimente in der AC gezeigt, wurden unter Verwendung von doppelläufigen Elektroden. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (SW 20) geglättet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Bitte cl</a>ick hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Frühere Experimente haben gezeigt, dass solche Glutamat induzierte [K +] o-Signale werden nicht signifikant während der Anwendung der TTX verändert und sind damit weitestgehend unabhängig von der Öffnung der spannungsgesteuerten Natriumkanäle und neuronalen Aktionspotential Generation 15,16. Die Mechanismen, die die beobachteten [K +] o Veränderungen als Reaktion auf Glutamat zu untersuchen, verwendeten wir Glutamatrezeptor-Blocker, nämlich CNQX (100 uM; Blocker der AMPA-Rezeptoren) und APV (100 uM; Blocker des NMDA-Rezeptoren) in der Gegenwart von TTX (0,5 uM). Nach Badperfusion mit diesen Blocker, Glutamat induzierte [K +] o Veränderungen waren praktisch abgeschafft, was bestätigt, ihre Abhängigkeit von der Eröffnung des ionotropen Glutamat-Rezeptor-Kanäle wie zuvor berichtet (zB 17; 7B). Um weiter zu zeigen ter Relevanz der glutamatergen Anregung für die Erzeugung von extrazellulären [K +] Signale wurden die Schnitte mit nominal Mg 2+ -freien Salzlösung, die 10 &amp; mgr; M Bicucullin Methiodid (0 mg 2+ / BIC) perfundiert. Dies entlastet spannungsabhängigen Mg 2+ -block von NMDA-Rezeptoren und dämpft die Hemmung durch GABA A -Rezeptoren blockiert, was spontan rezidivierende epileptiforme Aktivität in dem Netzwerk (zB 18,19). Wie erwartet 20, spontan, wiederkehrend [K +] o Transienten, in Höhe von etwa 1,5 mm wurden in 0mg 2+ / BIC Kochsalzlösung (7C) nachgewiesen. Zwischen diesen Antworten kleinere [K +] o Transienten mit einer mittleren Amplitude von etwa 0,2 mm eingetreten ist (7C). In einem zweiten Satz von Experimenten wurden [Na +] -empfindliche Mikroelektroden [Na +] o Änderungen durch die Anwendung der evozierten bestimmenGlutamat Agonisten. Hier haben wir auch im Vergleich das Ansprechverhalten doppelläufige und konzentrische Mikroelektroden, die zwei unterschiedliche Anwendungsparadigmen. [Na +] -empfindliche Mikroelektroden wurden in das Stratum radiatum in einer Tiefe von etwa 50 um angeordnet. Nachdem eine stabile Basislinie erreicht war, wurde die Glutamat-Agonisten L-Aspartat pro Badperfusion (10 mM, 120 sec, Badperfusion bei 2,5 ml / min) aufgetragen. Wie zuvor 21 beobachtet, die Anwendung von Aspartat verursacht eine langsame Abnahme der [Na +] o von etwa 15 mm, was etwa 5 Minuten dauert, und dann gestartet, um wieder auf die Grundlinie zurückzugewinnen (8A). Bemerkenswert ist, während die Spitzenamplituden und Kinetik der [Na +] O-Signale von beiden Elektroden bestimmt waren unter diesen Bedingungen praktisch identisch zeigte konzentrischen Elektroden eine stabilere Basislinie und einen geringeren Geräuschpegel (8A). Um das zu testen r<html> esponse Merkmale der verschiedenen Elektroden unter einer schnelleren Anwendungs ​​Paradigma wir druckbeaufschlagten Glutamat durch einen feinen Glaspipette im Stratum radiatum positioniert in einem Abstand von 20-40 &amp; mgr; m von der Spitze des ionenselektive Mikroelektroden. Wie erwartet 21. Applikation von Glutamat (10 mM) für 200 ms verursacht einen Abfall in der [Na +] o (8B). Die Spitzenamplituden der [Na +] o Rückgang waren im gleichen Bereich für beide Arten von Elektroden (doppelläufige: 4,5-13,5 mM, n = 14; konzentrische: 2,0-19,1 mM, n = 15). Doch im Gegensatz zu den mit langsamen Badperfusion (siehe oben), nicht nur das Signal-zu-Rausch-Verhältnis, sondern auch der zeitliche Verlauf der [Na +] O-Signale von den beiden Arten von Elektroden erfasst erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich signifikant. Die durchschnittliche Zeit bis zum Peak betrug 3,5 sec für die doppelläufige und nur 1,3 Sekunden für den konzentrischen Mikroelektroden. ve_content &quot;&gt; Somit zeigen diese Ergebnisse zu bestätigen und die schnellere Reaktion Kinetik konzentrischen vs. doppelläufige Na + -selektiven Mikroelektroden (vgl 6C und 8B), als auch für Ca 2+ und pH merkt selektive Gegen 10 . Im Gegensatz zu der früheren Studie, in der Kurz platzen synaptischen Stimulation durchgeführt, um schnell synaptisch induzierte Ionen Transienten hervorzurufen, gab es nur eine Tendenz, aber keinen signifikanten Unterschied in der mittleren Spitzenamplituden zwischen konzentrischen und doppelläufige Elektroden mit unseren Anwendungs Paradigma. Dies war wahrscheinlich auf die Tatsache, dass der Abstand des Angriffs Pipette von der Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode um einen Faktor von zwei (20-40 &amp; mgr; m) variiert wird, und folglich, dass die maximale Glutamatkonzentration im Zielbereich war nicht die gleiche in verschiedenen Experimenten, behindern eine vorhandene Differenz der Spitzenamplituden. (A) Top Spuren: Wechsel im voltage der Referenz Barrel (V ref) einer doppelläufigen Elektrode (schwarze gestrichelte Linie) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in dem Bad Na + Konzentration ([Na +] b), wie angegeben. Beachten, dass die Spannungsantworten beider Elektroden sind nahezu identisch. Bottom Spuren: Änderungen in der Spannung der Na + -Potential (V Na +) einer doppelläufigen Elektrode (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in [Na +] b. (B) Half-logarithmischen Graphen der [Na +] b gegenüber dem V Na + beider Elektroden. Linearen Plots der Daten zeigen eine Neigung von etwa 48 mV für beide Elektroden. (C) Reaktion des V Na + aus einer doppelläufigen (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) zu einer schnellen Änderung der [Na +] b von 152 mm bis 70 mm. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend faster. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter geglättet (Breite 20). <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Abbildung 8: Die extrazelluläre Natrium-Transienten, wie durch Doppelnamen und konzentrischen Elektroden erfasst. (A) Vorübergehende Änderungen im V ref und [Na +] o nach Bad Perfusion mit 10 mM Aspartat 120 Sekunden, wie durch den Balken angezeigt induziert. Die oberen Spuren zeigen eine Aufnahme mit einer doppelläufigen Elektrode durchgeführt, wurden die unteren Spuren unter Verwendung einer konzentrischen Elektrode erfasst. (B) Vorübergehende Änderungen im V ref und [Na +] o durch lokale Druckanwendung mit 10 mM Glutamat für 0,2 s induziert, wie durch den Pfeil angedeutet. Die oberen Spuren zeigen eine Aufnahme mit einer doppelläufigen Elektrode durchgeführt, wurden die unteren Spuren unter Verwendung einer konzentrischen Elektrode erfasst.Gepunktete rote Linien stellen linearen Anpassungen der Zeitraum zwischen dem Beginn des Signals auf seine maximale. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend schneller unter dieser Bedingung. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir demonstrieren die Herstellung, Kalibrierung und Eigenschaften von zwei Arten von ionenselektiven Mikroelektroden (doppelläufig und konzentrisch) zur Messung von Ionenkonzentrationen im Hirngewebe. Diese werden dann in der Präparation von Hippocampus-Schnitten der Maus verwendet, um zu zeigen, dass die exzitatorische Aktivität sowohl die extrazelluläre Kalium- als auch die Natriumkonzentration verändert.

Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Iondynamik im extrazellulären Raum von Gehirngewebe nachzuweisen und zu analysieren. Die Messung von Ionsignalen erfolgt mithilfe ionenselektiver Mikroelektroden, die entweder nach einem Doppelkanal- oder konzentrischen Design hergestellt werden können. Im ersten Schritt werden die Mikroelektroden in der experimentellen Badlösung kalibriert.Danach werden die Elektroden in akute hippocampale Schnitte der Maus eingeführt, um die Freisetzung von Glutamat als Transmitter zu registrieren, oder es wird ein Glutamat-Agonist zugegeben. Glutamat bindet an ionotrope Rezeptoren an postsynaptischen Dornen und öffnet diese, wodurch ein Einstrom von Natrium in die Zellen und ein Ausstrom von Kalium aus den Zellen ermöglicht wird. Letztlich führt dies zu einer Abnahme des extrazellulären Natriums sowie zu einer Zunahme des extrazellulären Kaliums, die durch die ionenselektiven Mikroelektroden detektiert werden.Diese Methode dient der Untersuchung der Regulation von extrazellulären Ionen und der eisenbezogenen Transienten, die durch neuronale Aktivität im Gehirn ausgelöst werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Kalibrierung zweier Arten ionenselektiver Mikroelektroden. Wir zeigen, wie diese in akuten Gehirnschnitten eingesetzt werden können, um Änderungen der extrazellulären Kalium- oder Natriumkonzentrationen als Reaktion auf die Applikation von Neurotransmittern zu messen.Das Verfahren wird von Nicole Hark und Simon für mein Labor demonstriert. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Borosilikatglas-Kapillare mit Filament für die ionensensitive Kammer und eine weitere für die spätere Referenzkammer vor. Befestigen Sie anschließend die lange und die kurze Kapillare an beiden Enden mit einem Zweikomponentenkleber oder einem kleinen Streifen Aluminiumfolie miteinander.Erhitzen Sie die Doppelkapillare eine Stunde lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius, um restliche Feuchtigkeit zu entfernen. Danach bewahren Sie die Elektroden bis zur Verwendung in einem Exsikkator auf. Zentrieren Sie die Doppelkapillare in einem vertikalen Ziehgerät mit einem Revolverkreidestift. Verwenden Sie Kreide, um eine Verlängerung der Kapillare zu verhindern.Halten Sie die Spule vorsichtig, bis das Glas weich genug ist, um eine horizontale Drehung des Revolvers um 180 Grad nach dem Abkühlen zu ermöglichen. Entfernen Sie danach die mechanische Trennstelle. Wenden Sie ein zweites Heizprotokoll an, um die Kapillare zu ziehen, wodurch zwei scharfe, doppelröhrige Kapillaren entstehen.Der Tippdurchmesser der Doppelkapillare sollte nahezu einem Mikrometer betragen. Füllen Sie nun den Referenzbarren bis zur Spitze mit destilliertem Wasser, um eine Besiedelung zu verhindern. Platzieren Sie im folgenden Verfahren eine Doppelkapillare mit der Spitze nach oben auf einen speziell angefertigten Halter.Danach den Halter auf die Weithalsflasche mit dem vorgewärmten HMDS setzen und 70 Minuten inkubieren. Anschließend die Kapillare auf ein Metallgestell übertragen. Im Anschluss zwei Stunden lang in den vorgeheizten Ofen stellen, um beide Kanäle nach der Besiedlung zu trocknen, und die Kapillare bis zur Verwendung trocken im Exsikkator aufbewahren.Am Tag des Experiments bereiten Sie die ionenselektive Elektrode vor, indem Sie die Spitze des silikonisierten Barrens mit zwei bis drei Mikrolitern des ionenselektiven Sensors füllen. Danach füllen Sie den Barren mit 100 Millimolar Natriumchlorid für eine natriumempfindliche Mikroelektrode oder mit 100 Millimolar Kaliumchlorid-Lösung für eine kaliumempfindliche Mikroelektrode wieder auf. Achten Sie darauf, bei diesem Vorgang keine zusätzlichen Luftblasen einzubringen.Wenn die Füllung erfolgreich ist und der Sensor ordnungsgemäß befüllt wurde, sollte die Sensoroberfläche als deutlich sichtbare konkave Fläche gegenüber der Rückfüllung erscheinen. Füllen Sie anschließend den Referenzkanal, setzen Sie die chlorierten Silberdrähte in beide Kammern ein und verschließen Sie jede Kammer mit Zahnpflege-Wachs. Ziehen Sie in diesem Verfahren eine zwei Millimeter starke Kapillare in der horizontalen Zieheinheit, sodass eine kurze Abschrägung und ein Spitzenaußendurchmesser von vier Mikrometern entsteht.Füllen Sie unmittelbar vor der Verwendung die silikonisierte Kapillare mit 0,2 Mikroliter Sensor. Zur Vorbereitung der inneren Kapillare ziehen Sie eine Kapillare mit kleinem Durchmesser, sodass zwei Kapillaren mit langen Konen und scharfen Spitzen entstehen. Füllen Sie diese anschließend mit 100 Millimolar Natriumchlorid- oder 100 Millimolar Kaliumchlorid-Salzlösung.Platzieren Sie die mit Sensor und die mit Kochsalzlösung gefüllten Kapillaren direkt hintereinander auf einen speziell angefertigten Stopfen aus Deckgläsern. Führen Sie die kleinere Kapillare teilweise in die größere Kapillare ein. Befestigen Sie anschließend die Kapillaren auf einem weiteren Deckglas.Übertragen Sie die Kapillaren mithilfe von Modellierknete auf den Mikroskoptisch und betrachten Sie sie mit einer 100-fachen Vergrößerung. Mit Hilfe eines Glasstabes, der an einem Mikromanipulator befestigt ist, schieben Sie die äußere Kapillare langsam über die innere Kapillare, bis der Abstand zwischen ihren Spitzen etwa fünf Mikrometer beträgt. Befestigen Sie das offene Ende der äußeren Kapillare mit Zahnwachs an der inneren Kapillare und führen Sie einen Silberdraht ein.Um die Referenzelektrode vorzubereiten, ziehen Sie eine Kapillare mit Filament in einem vertikalen Ziehgerät, verwerfen Sie die obere Pipette und öffnen Sie danach die untere Spannbacke. Heben Sie die untere Pipette um etwa fünf Millimeter an, schließen Sie die Spannbacke erneut und heben Sie sie so weit an, bis die Spitze der unteren Elektrode etwa fünf Millimeter über der Heizspule positioniert ist. Erwärmen Sie anschließend die Spule und biegen Sie die Spitze mithilfe einer Pinzette seitlich um etwa 45 Grad ab.Biegen Sie es erneut um etwa minus 45 Grad, um die Spitze wieder parallel zum Hauptstiel auszurichten. Füllen Sie dann das Referenzrohr mit gepuffertem Salzlösungspulver. Führen Sie einen chlorierten Silberdraht ein und verschließen Sie das Rohr mit Zahnwachs.Befestigen Sie in diesem Schritt sowohl die ionensensitive als auch die Referenzelektrode an Mikromanipulatoren und senken Sie sie in eine mit aCSF perfundierte Versuchskammer ab. Verbinden Sie unter dem Stereomikroskop die chlorierten Silberdrähte mit den jeweiligen Eingängen der Kopfstufe des Differenzverstärkers. Bestimmen Sie anschließend die Elektrodenwiderstände.Danach stellen Sie die Spannungssignale auf Null ein und beginnen mit der Aufzeichnung zur Kalibrierung. Nach Erhalt einer stabilen Grundlinie wechseln Sie zu der Salzlösung, die definierte Konzentrationen des zu messenden Ions enthält. Überführen Sie nun eine 250 Mikrometer dicke Hippocampus-Schnittpräparation in die Versuchskammer und befestigen Sie sie mit einem Gitter.Senken Sie die kalibrierte ionenselektive Mikroelektrode auf die Schnittoberfläche ab. Senken Sie die Elektrode anschließend weitere etwa 50 Mikrometer in die Stratum radiatum der CA1-Region ab. Um einen Transmitteragonisten aufzubringen, füllen Sie die Applikationspipette mit 0,5 Millimolar Glutamat.Befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator und koppeln Sie sie an eine Druckapplikationsvorrichtung. Senken Sie als Nächstes die Applikationspipette in das Gewebe ab und platzieren Sie sie vorsichtig in der Nähe der Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode. Beginnen Sie die Druckapplikation mit 40 Millibar.Hier ist die Änderung der Spannung der Referenzbarren einer Doppelbarren-Elektrode und einer konzentrischen Elektrode als Reaktion auf Änderungen der Natriumkonzentration im Bad dargestellt. Und dies sind die Änderungen der Spannung des Natrium-Potentials einer Doppelbarren-Elektrode und einer konzentrischen Elektrode als Reaktion auf Änderungen der Natriumkonzentration im Bad. Diese Abbildung zeigt die halblogarithmische Darstellung der Natriumkonzentration im Bad in Abhängigkeit von der Spannung des Natrium-Potentials beider Elektroden.Die linearen Auftragungen zeigen eine Steigung von etwa 48 Millivolt für beide Elektroden. Hier ist die Antwort einer Doppelkanal- und einer konzentrischen Elektrode auf eine schnelle Änderung in der Badlösung. Natriumkonzentration von 152 Millimolar auf 70 Millimolar.Beachten Sie, dass die Ansprechzeit der konzentrischen Elektrode deutlich schneller ist. Diese Abbildung zeigt den extrazellulären Natrium-Transienten, wie er von Doppel-Lumen- und konzentrischen Elektroden erfasst wurde; transiente Änderungen in der Spannung der Referenzlumina und der extrazellulären Natriumkonzentration wurden durch Badperfusion mit 10 Millimolar Aspartat für 120 Sekunden hervorgerufen, wie durch den Balken angegeben. Und in dieser Abbildung wurden transiente Änderungen in der Spannung der Referenzlumina und der extrazellulären Natriumkonzentration durch lokale Druckapplikation mit 10 Millimolar Glutamat für 0,2 Sekunden ausgelöst.Beachten Sie, dass die Ansprechzeit der konalen Elektrode unter diesen Bedingungen deutlich schneller ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, im Hinterkopf zu behalten, dass eine ordnungsgemäße Stille der entscheidende Schritt für die erfolgreiche Herstellung von eisenselektiven Mikroelektroden ist. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diese Elektroden zur Detektion von extrazellulärem Eisen in Gehirngewebe herstellt und verwendet.

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Iontophorese von neuronalen Agonisten und Antagonisten während der...

Herstellung und Verwendung von Piggy-Back mehrgehäusigen Elektroden für<em&gt; In vivo</em&gt; Pharmakologische Manipulationen Neural Antworten

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Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

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