Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Iondynamik im extrazellulären Raum von Gehirngewebe nachzuweisen und zu analysieren. Die Messung von Ionsignalen erfolgt mithilfe ionenselektiver Mikroelektroden, die entweder nach einem Doppelkanal- oder konzentrischen Design hergestellt werden können. Im ersten Schritt werden die Mikroelektroden in der experimentellen Badlösung kalibriert.

Danach werden die Elektroden in akute hippocampale Schnitte der Maus eingeführt, um die Freisetzung von Glutamat als Transmitter zu registrieren, oder es wird ein Glutamat-Agonist zugegeben. Glutamat bindet an ionotrope Rezeptoren an postsynaptischen Dornen und öffnet diese, wodurch ein Einstrom von Natrium in die Zellen und ein Ausstrom von Kalium aus den Zellen ermöglicht wird. Letztlich führt dies zu einer Abnahme des extrazellulären Natriums sowie zu einer Zunahme des extrazellulären Kaliums, die durch die ionenselektiven Mikroelektroden detektiert werden.

Diese Methode dient der Untersuchung der Regulation von extrazellulären Ionen und der eisenbezogenen Transienten, die durch neuronale Aktivität im Gehirn ausgelöst werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Kalibrierung zweier Arten ionenselektiver Mikroelektroden. Wir zeigen, wie diese in akuten Gehirnschnitten eingesetzt werden können, um Änderungen der extrazellulären Kalium- oder Natriumkonzentrationen als Reaktion auf die Applikation von Neurotransmittern zu messen.

Das Verfahren wird von Nicole Hark und Simon für mein Labor demonstriert. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Borosilikatglas-Kapillare mit Filament für die ionensensitive Kammer und eine weitere für die spätere Referenzkammer vor. Befestigen Sie anschließend die lange und die kurze Kapillare an beiden Enden mit einem Zweikomponentenkleber oder einem kleinen Streifen Aluminiumfolie miteinander.

Erhitzen Sie die Doppelkapillare eine Stunde lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius, um restliche Feuchtigkeit zu entfernen. Danach bewahren Sie die Elektroden bis zur Verwendung in einem Exsikkator auf. Zentrieren Sie die Doppelkapillare in einem vertikalen Ziehgerät mit einem Revolverkreidestift. Verwenden Sie Kreide, um eine Verlängerung der Kapillare zu verhindern.

Halten Sie die Spule vorsichtig, bis das Glas weich genug ist, um eine horizontale Drehung des Revolvers um 180 Grad nach dem Abkühlen zu ermöglichen. Entfernen Sie danach die mechanische Trennstelle. Wenden Sie ein zweites Heizprotokoll an, um die Kapillare zu ziehen, wodurch zwei scharfe, doppelröhrige Kapillaren entstehen.

Der Tippdurchmesser der Doppelkapillare sollte nahezu einem Mikrometer betragen. Füllen Sie nun den Referenzbarren bis zur Spitze mit destilliertem Wasser, um eine Besiedelung zu verhindern. Platzieren Sie im folgenden Verfahren eine Doppelkapillare mit der Spitze nach oben auf einen speziell angefertigten Halter.

Danach den Halter auf die Weithalsflasche mit dem vorgewärmten HMDS setzen und 70 Minuten inkubieren. Anschließend die Kapillare auf ein Metallgestell übertragen. Im Anschluss zwei Stunden lang in den vorgeheizten Ofen stellen, um beide Kanäle nach der Besiedlung zu trocknen, und die Kapillare bis zur Verwendung trocken im Exsikkator aufbewahren.

Am Tag des Experiments bereiten Sie die ionenselektive Elektrode vor, indem Sie die Spitze des silikonisierten Barrens mit zwei bis drei Mikrolitern des ionenselektiven Sensors füllen. Danach füllen Sie den Barren mit 100 Millimolar Natriumchlorid für eine natriumempfindliche Mikroelektrode oder mit 100 Millimolar Kaliumchlorid-Lösung für eine kaliumempfindliche Mikroelektrode wieder auf. Achten Sie darauf, bei diesem Vorgang keine zusätzlichen Luftblasen einzubringen.

Wenn die Füllung erfolgreich ist und der Sensor ordnungsgemäß befüllt wurde, sollte die Sensoroberfläche als deutlich sichtbare konkave Fläche gegenüber der Rückfüllung erscheinen. Füllen Sie anschließend den Referenzkanal, setzen Sie die chlorierten Silberdrähte in beide Kammern ein und verschließen Sie jede Kammer mit Zahnpflege-Wachs. Ziehen Sie in diesem Verfahren eine zwei Millimeter starke Kapillare in der horizontalen Zieheinheit, sodass eine kurze Abschrägung und ein Spitzenaußendurchmesser von vier Mikrometern entsteht.

Füllen Sie unmittelbar vor der Verwendung die silikonisierte Kapillare mit 0,2 Mikroliter Sensor. Zur Vorbereitung der inneren Kapillare ziehen Sie eine Kapillare mit kleinem Durchmesser, sodass zwei Kapillaren mit langen Konen und scharfen Spitzen entstehen. Füllen Sie diese anschließend mit 100 Millimolar Natriumchlorid- oder 100 Millimolar Kaliumchlorid-Salzlösung.

Platzieren Sie die mit Sensor und die mit Kochsalzlösung gefüllten Kapillaren direkt hintereinander auf einen speziell angefertigten Stopfen aus Deckgläsern. Führen Sie die kleinere Kapillare teilweise in die größere Kapillare ein. Befestigen Sie anschließend die Kapillaren auf einem weiteren Deckglas.

Übertragen Sie die Kapillaren mithilfe von Modellierknete auf den Mikroskoptisch und betrachten Sie sie mit einer 100-fachen Vergrößerung. Mit Hilfe eines Glasstabes, der an einem Mikromanipulator befestigt ist, schieben Sie die äußere Kapillare langsam über die innere Kapillare, bis der Abstand zwischen ihren Spitzen etwa fünf Mikrometer beträgt. Befestigen Sie das offene Ende der äußeren Kapillare mit Zahnwachs an der inneren Kapillare und führen Sie einen Silberdraht ein.

Um die Referenzelektrode vorzubereiten, ziehen Sie eine Kapillare mit Filament in einem vertikalen Ziehgerät, verwerfen Sie die obere Pipette und öffnen Sie danach die untere Spannbacke. Heben Sie die untere Pipette um etwa fünf Millimeter an, schließen Sie die Spannbacke erneut und heben Sie sie so weit an, bis die Spitze der unteren Elektrode etwa fünf Millimeter über der Heizspule positioniert ist. Erwärmen Sie anschließend die Spule und biegen Sie die Spitze mithilfe einer Pinzette seitlich um etwa 45 Grad ab.

Biegen Sie es erneut um etwa minus 45 Grad, um die Spitze wieder parallel zum Hauptstiel auszurichten. Füllen Sie dann das Referenzrohr mit gepuffertem Salzlösungspulver. Führen Sie einen chlorierten Silberdraht ein und verschließen Sie das Rohr mit Zahnwachs.

Befestigen Sie in diesem Schritt sowohl die ionensensitive als auch die Referenzelektrode an Mikromanipulatoren und senken Sie sie in eine mit aCSF perfundierte Versuchskammer ab. Verbinden Sie unter dem Stereomikroskop die chlorierten Silberdrähte mit den jeweiligen Eingängen der Kopfstufe des Differenzverstärkers. Bestimmen Sie anschließend die Elektrodenwiderstände.

Danach stellen Sie die Spannungssignale auf Null ein und beginnen mit der Aufzeichnung zur Kalibrierung. Nach Erhalt einer stabilen Grundlinie wechseln Sie zu der Salzlösung, die definierte Konzentrationen des zu messenden Ions enthält. Überführen Sie nun eine 250 Mikrometer dicke Hippocampus-Schnittpräparation in die Versuchskammer und befestigen Sie sie mit einem Gitter.

Senken Sie die kalibrierte ionenselektive Mikroelektrode auf die Schnittoberfläche ab. Senken Sie die Elektrode anschließend weitere etwa 50 Mikrometer in die Stratum radiatum der CA1-Region ab. Um einen Transmitteragonisten aufzubringen, füllen Sie die Applikationspipette mit 0,5 Millimolar Glutamat.

Befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator und koppeln Sie sie an eine Druckapplikationsvorrichtung. Senken Sie als Nächstes die Applikationspipette in das Gewebe ab und platzieren Sie sie vorsichtig in der Nähe der Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode. Beginnen Sie die Druckapplikation mit 40 Millibar.

Hier ist die Änderung der Spannung der Referenzbarren einer Doppelbarren-Elektrode und einer konzentrischen Elektrode als Reaktion auf Änderungen der Natriumkonzentration im Bad dargestellt. Und dies sind die Änderungen der Spannung des Natrium-Potentials einer Doppelbarren-Elektrode und einer konzentrischen Elektrode als Reaktion auf Änderungen der Natriumkonzentration im Bad. Diese Abbildung zeigt die halblogarithmische Darstellung der Natriumkonzentration im Bad in Abhängigkeit von der Spannung des Natrium-Potentials beider Elektroden.

Die linearen Auftragungen zeigen eine Steigung von etwa 48 Millivolt für beide Elektroden. Hier ist die Antwort einer Doppelkanal- und einer konzentrischen Elektrode auf eine schnelle Änderung in der Badlösung. Natriumkonzentration von 152 Millimolar auf 70 Millimolar.

Beachten Sie, dass die Ansprechzeit der konzentrischen Elektrode deutlich schneller ist. Diese Abbildung zeigt den extrazellulären Natrium-Transienten, wie er von Doppel-Lumen- und konzentrischen Elektroden erfasst wurde; transiente Änderungen in der Spannung der Referenzlumina und der extrazellulären Natriumkonzentration wurden durch Badperfusion mit 10 Millimolar Aspartat für 120 Sekunden hervorgerufen, wie durch den Balken angegeben. Und in dieser Abbildung wurden transiente Änderungen in der Spannung der Referenzlumina und der extrazellulären Natriumkonzentration durch lokale Druckapplikation mit 10 Millimolar Glutamat für 0,2 Sekunden ausgelöst.

Beachten Sie, dass die Ansprechzeit der konalen Elektrode unter diesen Bedingungen deutlich schneller ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, im Hinterkopf zu behalten, dass eine ordnungsgemäße Stille der entscheidende Schritt für die erfolgreiche Herstellung von eisenselektiven Mikroelektroden ist. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diese Elektroden zur Detektion von extrazellulärem Eisen in Gehirngewebe herstellt und verwendet.