Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Ionendynamik im extrazellulären Raum des Gehirns zu erfassen und zu analysieren. Gewebe. Die Messung der Ionentransienten erfolgt unter Verwendung ionenselektiver Mikroelektroden, die auf der Grundlage eines doppelläufigen oder konzentrischen Designs hergestellt werden können. In einem ersten Schritt werden die Mikroelektroden im Versuchsbad kalibriert.

Dann werden die Elektroden in die akuten Hippocampus-Schnitte der Maus eingeführt, um aufzuzeichnen, um extrazelluläre Ionenverschiebungen, den Transmitter Glutamat hervorzurufen, oder ein Glutamat-Agonist wird zugeführt. Glutamat bindet und öffnet ionotrope Rezeptoren an postsynaptischen Stacheln, was den Einstrom von Natrium in die Zellen und den Einstrom von Kalium aus den Zellen ermöglicht. Letztendlich führt dies zu einer Abnahme des extrazellulären Natriums sowie einer Zunahme des extrazellulären Kaliums, die von den ionenselektiven Mikroelektroden detektiert werden.

Diese Methode wird eingesetzt, um die extrazelluläre Ionenregulation und aktivitätsinduzierte Eisentransienten im Gehirn zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Kalibrierung von zwei Arten von ionenselektiven Mikroelektroden. Wir zeigen, wie sie in akuten Hirngewebeschnitten eingesetzt werden können, um Veränderungen von extrazellulärem Kalium oder Natrium als Reaktion auf die Anwendung von Neurotransmittern zu messen.

Das Verfahren wird von Nicole Hark und Simon für mein Labor demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Kapillare aus Silikatglas mit Filament vor, die für den ionenempfindlichen Zylinder und eine weitere für den späteren Referenzzylinder verwendet wird. Verwenden Sie als Nächstes Zweikomponentenkleber oder einen kleinen Streifen Aluminiumfolie, um die lange und kurze Kapillare an beiden Enden miteinander zu befestigen.

Erhitzen Sie die Doppelkapillare in einem Ofen bei 60 Grad Celsius für eine Stunde, um Restfeuchtigkeit zu entfernen. Bewahren Sie anschließend die Elektroden bis zur Verwendung in einem Trockenmittel auf und zentrieren Sie die Doppelkapillare in einem vertikalen Abzieher mit einer Revolverkreide. Verwenden Sie eine Kreide, um eine Dehnung der Kapillare zu verhindern.

Halten Sie die Spule vorsichtig, bis das Glas weich genug ist, um eine horizontale Drehung des Revolvers zu ermöglichen. Nach dem Abkühlen um 180 Grad drehen, mechanische Unterbrechung entfernen. Wenden Sie ein zweites Heizprotokoll an, um die Kapillare zu ziehen, was zu zwei scharfen, doppelläufigen Kapillaren führt.

Der Spitzendurchmesser der Doppelkapillare sollte nahe einem Mikrometer liegen. Füllen Sie nun das Referenzfass bis zur Spitze mit destilliertem Wasser, um eine Besiedlung zu verhindern. Setzen Sie im folgenden Verfahren eine doppelläufige Kapillare mit der Spitze nach oben auf einen speziell angefertigten Halter.

Setzen Sie dann diesen Halter auf die Weithalsflasche mit dem vorgewarnten HMDS und inkubieren Sie ihn 70 Minuten lang. Übertragen Sie danach die Kapillare auf einen Metallständer. Legen Sie es anschließend für zwei Stunden in den vorgeheizten Ofen, um beide Fässer nach der Besiedlung zu trocknen, und halten Sie die Kapillare bis zur Verwendung in der Trockenheit trocken.

Bereiten Sie am Tag des Experiments die ionenselektive Elektrode vor, indem Sie die Spitze des silikonisierten Zylinders mit zwei bis drei Mikrolitern des ionenselektiven Sensors füllen. Füllen Sie dann den Zylinder mit 100 Millimolar Natriumchlorid für eine natriumempfindliche Mikroelektrode oder 100 Millimolar Kaliumchlorid Kochsalzlösung für eine kaliumempfindliche Mikroelektrode auf. Achten Sie darauf, dass Sie während dieses Vorgangs keine zusätzlichen Luftblasen einbringen.

Wenn die Aktivierung erfolgreich ist und der Sensor ordnungsgemäß gefüllt ist, sollte die Sensoroberfläche als deutlich sichtbare konkave Fläche gegen den Backfill erscheinen. Füllen Sie dann den Referenzkanal, führen Sie dann die chlorierten Silberdrähte in beide Fässer ein und versiegeln Sie jedes Fass mit Zahnwachs. Bei diesem Verfahren wird eine zwei Millimeter große Kapillare in den horizontalen Abzieher gezogen, was zu einer kurzen Verjüngung und einem Spitzendurchmesser von vier Mikrometern führt.

Füllen Sie die silikonisierte Kapillare direkt vor dem Gebrauch mit 0,2 Mikrolitern Sensor. Um die innere Kapillare vorzubereiten, ziehen Sie an einer Kapillare mit kleinem Durchmesser, so dass zwei Kapillaren mit langen Verjüngungen und scharfen Spitzen entstehen. Füllen Sie sie dann mit 100 Millimolar Natriumchlorid oder 100 Millimolar Kaliumchlorid Kochsalzlösung.

Platzieren Sie die mit Sensor gefüllten und die mit Kochsalzlösung gefüllten Kapillaren direkt in einer Linie zueinander auf einen speziell angefertigten Stopfen aus Deckgläsern. Führen Sie die kleinere Kapillare teilweise in die größere Kapillare ein. Befestigen Sie anschließend die Kapillaren auf einem anderen Deckglas.

Übertragen Sie die Kapillaren mit Modelliermasse auf den Tisch eines Mikroskops und visualisieren Sie sie mit 100-facher Vergrößerung. Mit Hilfe eines Glasstabes, der auf einem Mikromanipulator montiert ist, schieben Sie die äußere Kapillare langsam über die innere Kapillare, bis der Abstand zwischen ihren Spitzen etwa fünf Mikrometer beträgt. Befestigen Sie das offene Ende der äußeren Kapillare mit Zahnwachs auf der inneren Kapillare und führen Sie Silberdraht ein.

Um die Referenzelektrode vorzubereiten, ziehen Sie eine Kapillare mit Filament in einen vertikalen Abzieher, entsorgen Sie die obere Pipette, öffnen Sie dann das untere Bohrfutter und heben Sie die untere Pipette um etwa fünf Millimeter an. Schließen Sie das Spannfutter wieder und heben Sie es an, bis die Spitze der unteren Elektrode etwa fünf Millimeter über der Heizspirale positioniert ist. Erhitzen Sie anschließend die Spule und biegen Sie die Spitze mit einer Pinzette um etwa 45 Grad zur Seite.

Biege ihn nochmals um ca. minus 45 Grad, um die Spitze wieder parallel zum Hauptschaft zu lenken. Füllen Sie dann das Referenzfass mit haufenweise gepufferter Kochsalzlösung. Führen Sie einen chlorierten Silberdraht hinein und versiegeln Sie den Zylinder mit Zahnwachs.

In diesem Schritt befestigen Sie sowohl die ionenempfindliche als auch die Referenzelektrode an Mikromanipulatoren und senken sie in eine A-CSF-perfundierte Versuchskammer ab. Verbinden Sie unter dem Stereomikroskop die chlorierten Silberdrähte mit den entsprechenden Eingängen der Kopfstufe des Differenzverstärkers. Bestimmen Sie dann die Elektrodenwiderstände.

Stellen Sie danach die Spannungssignale auf Null ein und beginnen Sie mit der Aufnahme zur Kalibrierung. Nach Erhalt einer stabilen Basislinie wechseln Sie zu der Kochsalzlösung, die definierte Konzentrationen des zu messenden Ions enthält. Übertragen Sie nun eine 250 Mikrometer dicke Hippocampus-Scheibe in die Versuchskammer und fixieren Sie sie mit einem Gitter.

Senken Sie die kalibrierte ionenselektive Mikroelektrode auf die Scheibenoberfläche ab. Senken Sie dann die Elektrode um etwa 50 Mikrometer weiter in den Schichtstrahler des CA-Bereichs ab. Um einen Transmitter-Agonisten aufzutragen, füllen Sie die Applikationspipette mit 0,5 millimolaren Glutamat.

Befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator und koppeln Sie sie an eine Druckaufgabevorrichtung. Senken Sie anschließend die Applikationspipette in das Gewebe ab und platzieren Sie sie vorsichtig in der Nähe der Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode. Beginnen Sie die Druckanwendung bei 40 Millibar.

Hier ist die Spannungsänderung der Referenzzylinder einer doppelläufigen Elektrode und einer konzentrischen Elektrode als Reaktion auf Änderungen der Natriumkonzentration im Bad dargestellt. Und das sind die Änderungen der Spannung des Natriumpotentials einer doppelläufigen Elektrode und einer konzentrischen Elektrode als Reaktion auf Änderungen der Natriumkonzentration im Bad. Diese Abbildung zeigt das halblogarithmische Diagramm der Natriumkonzentration im Bad im Verhältnis zur Spannung des Natriumpotentials beider Elektroden.

Die linearen Diagramme zeigen eine Steigung von etwa 48 Millivolt für beide Elektroden. Hier ist die Reaktion einer doppelläufigen und einer konzentrischen Elektrode auf einen schnellen Wechsel im Bad. Natriumkonzentration von 152 Millimolar bis 70 Millimolar.

Beachten Sie, dass die Ansprechzeit der konzentrischen Elektrode deutlich schneller ist. Diese Abbildung zeigt die extrazelluläre Natriumtransientität, wie sie durch doppelläufige und konzentrische Elektroden detektiert wurde, transiente Änderungen der Spannung der Referenzzylinder und der extrazellulären Natriumkonzentration wurden durch Badperfusion mit 10 millimolaren Aspartat für 120 Sekunden induziert, wie durch den Balken angezeigt. Und in dieser Abbildung wurden transiente Änderungen der Spannung der Referenzzylinder und der extrazellulären Natriumkonzentration durch lokale Druckanwendung mit 10 millimolarem Glutamat für 0,2 Sekunden induziert.

Beachten Sie, dass die Ansprechzeit der konalen Elektrode unter dieser Bedingung deutlich schneller ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, im Hinterkopf zu behalten, dass die richtige Stille der Schlüsselschritt für die erfolgreiche Produktion von Eisenelektiv-Mikroelektroden ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Elektroden für den Nachweis von extrazellulärem Eisen vorbereiten und verwenden, das im Gehirngewebe transient ist.