Generation und quantitative Analyse der Pulsed niederfrequenter Ultraschall, um die Sensitivität der Sonic Unbehandelte ermitteln und behandelten Tumorzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit von gepulstem, niederfrequentem Ultraschall bei der Schädigung menschlicher Leukämiezellpopulationen in Abwesenheit oder Gegenwart eines Cholesterin-depletierenden Wirkstoffs zu bewerten. Dies wird erreicht, indem das Sonifikationssystem gereinigt und seine Stabilität überprüft wird. Anschließend werden die menschlichen Leukämiezellen in Abwesenheit und Gegenwart von Methyl-β-Cyclodextrin sonifiziert.

Danach werden automatisierte Zellzähler verwendet, um die Zellviabilität sowie die Effekte von Sonifikation und Cholesterinabfuhr zu bewerten. Die mitochondriale Aktivität von Leukämiezellen wird mittels XTT-Assay analysiert. Letztendlich legen die Daten nahe, dass Ultraschall mit niedriger Frequenz dazu genutzt werden kann, maligne Zellen zu schädigen, wobei dieser Effekt durch den Einsatz eines Cholesterin-depletierenden Agents verstärkt wird.

Unser Labor beschäftigt sich mit der Sonar-NAMP-Therapie, einer neuartigen therapeutischen Modalität, die die antineoplastischen Wirkungen von Ultraschall mit spezialisierten Wirkstoffen kombiniert, um die Effekte des Schalls zu verstärken. Unser Protokoll bewertet die Schallempfindlichkeit sowohl neoplastischer als auch normaler Zellen, um potenzielle anwendungsspezifische chemotherapeutische Ansätze zu identifizieren, die einer weiteren präklinischen Untersuchung bedürfen. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Ausrüstung haben, die zur Beurteilung der Stabilität des Schallsystems verwendet wird, da es einige Zeit in Anspruch nehmen kann, das optimale Anwenden dieser Geräte zu erlernen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die zum Bewerten des Sonikatorsystems verwendeten Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren unerlässlich sind, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Vor Beginn eines Experiments verwenden Sie Chloroform und einen Wattestäbchen, um die Verbindung zwischen Horn und Wandler zu reinigen. Anschließend tragen Sie ein leichtes Öl auf die Gewindegänge von Horn und Wandler auf.

Um weitere Metallspäne, Rost oder Oxidationsrückstände zu entfernen, anschließend das Öl und alle anderen Verunreinigungen mit zusätzlichem Chloroform aus der Verbindung zu lösen und das Horn erneut am Wandler zu befestigen. Um das System korrekt anzuziehen, ziehen Sie das Horn aus der Unterseite des Bechers heraus und setzen einen Schlüssel in eines der drei kleinen Löcher nahe der Oberseite des Wandlers ein. Positionieren Sie nun einen Drehmomentschlüssel, der mit einem Halbzoll-Griff (Crow's Foot) ausgestattet ist, am geschlitzten Teil des Horns und ziehen Sie im üblichen Uhrzeigersinn fest, bis das Drehmomentsmessgerät 39,99 Foot-Pound anzeigt.

Nach dem Anziehen setzen Sie den Wandler und das Horn wieder in die Tasse ein und befestigen die Teile aufrecht an einem Stativ. Schließen Sie den Wandler erneut an die Stromversorgung an und stellen Sie das System auf Impulsdosierung ein. Nutzen Sie eine Sekunde Sonifikation mit einer Sekunde Pause zwischen den Impulsen und stellen Sie dann das System auf die gewünschten Amplituden ein, um die Intensität und Funktion des Sauna-Fire-Systems zu bewerten. Halten Sie dazu das Kavitationsmessgerät in einem Abstand von 1,5 Zentimetern, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen an der Messsonde vorhanden sind.

Lesen Sie den Bildschirm des Kavitationsmessgeräts ab, um zu bestätigen, dass das System mit der geeigneten Intensität betrieben wird. Tauchen Sie danach den Hydrofonsensor vollständig in ein Probenfläschchen mit 12,5 Milliliter Wasser ein und befestigen Sie den Sensor mit Hilfe des Ringständers. Um die Stabilität der Wellenformcharakteristika zu überprüfen, schließen Sie den Hydrofon an den Eingang des Oszilloskops an und vergewissern Sie sich, dass eine klare Sinuswelle sichtbar ist, da abweichende Wellenformen die Frequenz des Systems verändern können.

Um die Zellen für die Sonifikation vorzubereiten, säen Sie sie zunächst mit vier mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter in einer 25 Quadratzentimeter-Flasche unter Verwendung frisch zubereiteten Mediums aus. Nach der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Wenn die Zellen für die Sonifikation bereit sind, verwenden Sie ein Vakuum und einen Büchnerkolben, um eine Menge deionisiertem destilliertem Wasser zu entgasen.

Danach das Wasser verwenden, um das Trichterhorn bis zu 15 Millimeter über die Oberkante des Horns zu füllen. Das System etwa sieben Minuten lang mit entgastem Wasser betreiben. Anschließend drei Milliliter Zellen in ein Glas-20-Milliliter-Scintillationsfläschchen überführen und das Fläschchen an der Haltevorrichtung befestigen.

Befestigen Sie als Nächstes die Haltevorrichtung an der Oberseite des Cup-Horns und verwenden Sie den Schiebemechanismus, um die Haltevorrichtung auf eine Höhe von 15 Millimetern über der Oberkante des Horns an der Wasseroberfläche einzustellen. Sonoziert nun die Zellen mit drei Ultraschallimpulsen von jeweils einer Sekunde Dauer und einer Sekunde Abstand zwischen den Impulsen bei 33 und 50 % Amplitude. Beurteilen Sie die Zellviabilität nach der Sonifikation mittels Trypanblau-Ausschluss. Um die Zellschädigung zu beurteilen, spülen Sie die Öffnung eines Z2-Partikelanalysators mindestens zwei Mal mit isotoner Kochsalzlösung aus.

Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter der sonifizierten Zellen zu 20 Milliliter isotonischer Kochsalzlösung hinzu und überführen Sie die Zellprobe in den Zählerhalter. Heben Sie dann die Plattform zur Öffnung und analysieren Sie die Zellschädigung, Vitalität und das Zelltrümmermaterial gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Vitalität der sonifizierten Zellen mittels XTT-Assay zu bewerten, sonifizieren Sie die Zellen im Bereich von eins bis drei.

Eine Sekunde lange Pulse im Abstand von einer Sekunde erzeugen, um ein Spektrum an Schäden für die Beurteilung mit dem XTT-Assay zu erzeugen, anschließend die Zellen abzentrifugieren und die Pellets in frisch zubereitetem Wachstumsmedium auf eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Danach 100 µL Zellsuspension pro Vertiefung in einzelne flache 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten aussäen, jeweils im Triplikat, einschließlich drei Kontrollvertiefungen, die jeweils 100 µL vollständiges Wachstumsmedium ohne Zellen enthalten, zur Aufnahme der Leerwerte für die Absorptionsmessung.

Inkubieren Sie die Zellen am Morgen des Assays 24 Stunden lang, schwenken Sie Aliquote des auf 37 Grad Celsius erwärmten XTT- und Aktivierungsreagenz vorsichtig, bis die Lösungen klar sind. Geben Sie anschließend 0,1 Milliliter des Aktivierungsreagenz zu fünf Milliliter Eloqua des XTT-Reagenz. Fügen Sie danach 50 Mikroliter der aktivierten XTT-Lösung in jedes Loch der mit U 9 37 und THP 1 besiedelten Platten hinzu und bringen Sie die Zellen zurück in den Zellkultur-Inkubator.

Nach zwei Stunden die Platten vorsichtig schütteln, um den orangefarbenen Farbstoff in den positiven Vertiefungen gleichmäßig zu verteilen, und die Extinktion mit einem Mikrotiterplatten-Reader zwischen 450 und 500 Nanometern messen. Abschließend die Extinktion aller Testvertiefungen erneut zwischen 630 und 690 Nanometern messen. Wie erwartet, wird eine stärkere Zellschädigung in der Zellpopulation beobachtet, die bei 50 % Amplitude beschallt wurde, im Vergleich zu der bei 33 % Amplitude.

Die 33 % Amplitude ermöglicht jedoch die Detektion weiterer Schäden, wenn Wirkstoffe angewendet werden. Wie in diesem Experiment, in dem die dosisabhängigen Effekte des Cholesterin-depletierenden Wirkstoffs Methyl-beta-Cyclodextrin auf die Potenzierung der ultraschallinduzierten Empfindlichkeit von U 937-Zellen untersucht wurden.

Obwohl die mit Nons-Methyl-beta-Cyclodextrin behandelten Zellen in ihrer Vitalität den unbehandelten Nons-Zellen ähnelten, sank die Vitalität deutlich nach dreimaligem Einbringen von einsekündigen Ultraschallimpulsen mit 40 Kilohertz. Außerdem scheint die Abnahme der Vitalität nach der Beschallung dosisabhängig zu sein, da fünf Millimolar des Cholesterin-depletierenden Agents den stärksten Rückgang der Zellzahl verursachten, gefolgt von Behandlungen mit einem Millimolar bzw. 0,5 Millimolar Methyl-beta-Cyclodextrin, wie mittels XTT-Assay bewertet wurde. Obwohl die THP-1-Zellen leicht resistenter gegenüber Beschallung erschienen als die U-937-Zellen, wurden beide humanen Leukämiezelllinien dosisabhängig geschädigt.

Außerdem führte die Kombination höherer Konzentrationen von Methyl-β-Cyclodextrin mit einer größeren Anzahl von Ultraschallimpulsen bei beiden Zelllinien, U 9 37 und THP-1, zur stärksten Verminderung der XTT-Reduktion zu einem löslichen, leuchtend orangefarbenen Derivat, was einer geringeren Zellviabilität und mitochondriale Aktivität entspricht. Mit dieser Methode können weitere sonosensibilisierende Substanzen, wie zytoskelettgerichtete Wirkstoffe oder solche, die reaktive Spezies erzeugen, hinsichtlich ihrer Potenzierung der Sonosensitivität bewertet werden, wodurch neuartige therapeutische Ansätze etabliert werden können, deren pleonastische klinische Wirksamkeit untersucht werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die vom TC- und Z2-Zähler erfassten SON-Daten angemessen zu organisieren, da diese detaillierte Informationen über die Wirksamkeit des Behandlungsprotokolls liefern, die sonst verloren gehen könnten.

Wenn kein logistisches Schema verwendet wird, sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie niederfrequente Ultraschallanwendungen in Kombination mit potenziellen Sonosensibilisatoren in präklinischen in-vitro-Modellen genutzt werden können, um deren therapeutische Wirksamkeit zu bewerten.