Name: Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Entdecken Sie einen Hochdurchsatz-Screening-Ansatz zur Identifizierung von Stressresistenz-Genen in embryonalen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Generierung von Mausmodellen für Langlebigkeitsstudien.

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Wir möchten dem Wellcome Trust Sanger Institute für die Geschenke von piggyBac Transposon und piggyBac Transposase danken. Diese Arbeit wurde durch das Butcher Grant of Colorado und das NIH R01 AG041801 (W.S.C.) unterstützt.

<ol><li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+also+mediate+increased+resistance+to+stress+and+prevent+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease.</a> J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).</li>
<li>Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+stress+resistance+in+cells+from+long-lived+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice.</a> Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).</li>
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<li>Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+mutant+phenotypes+from+ES+cells+to+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice.</a> Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).</li>
<li>Ramirez-Solis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+splinkerette-PCR+method+for+the+isolation+and+sequencing+of+retroviral+insertion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites.</a> Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).</li>
<li>Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+piggyBac+transposon-based+genome-wide+library+of+insertionally+mutated+Blm-deficient+murine+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells.</a> Genome Res. 19, 667-673 (2009).</li>
<li>Chick, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+stress-resistance+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening for stress-resistance mutations in the mouse.</a> Front Genet. 5, 310(2014).</li>
<li>Salmon, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cell+lines+from+young+adult+mice+of+long-lived+mutant+strains+are+resistant+to+multiple+forms+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36, 543-544 (2015).</li>
<li>Baker, K. E., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+terminating+erroneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression.</a> Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).</li>
<li>Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+nonsense-mediated+mRNA+decay+permits+unbiased+gene+trapping+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).</li>
<li>Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+mouse+mutations+in+embryonic+stem+cells+by+use+of+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling.</a> Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Vorwärtsanalyse ermöglicht eine unvoreingenommene Befragung des Genoms nach Genen, die für einen bestimmten Phänotyp verantwortlich sind. Diese Methode ist sehr leistungsfähig, um neue Genfunktionen aufzudecken. Es wurde häufig bei niederen Organismen eingesetzt, nicht jedoch bei Säugetieren wie der Maus, hauptsächlich aufgrund der extrem hohen Kosten, die mit der damit verbundenen Infrastruktur und Logistik verbunden wären. Hier haben wir den genetischen Screening-Prozess auf die ES-Zellkulturplattform verlagert,...

Langlebigkeit hat eine intime Beziehung mit Stressresistenz. Im allgemeinen langlebige Spezies weisen häufig erhöhte Resistenz gegen multiple Stressoren, wie Wasserstoffperoxid, Paraquat (PQ), UV, Wärme und Schwermetalle 1,2. Im Gegensatz dazu erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Stress verursacht verkürzten Lebensdauer und / oder eine Krankheit anfälligen Phänotyp zusagen. Die Antioxidationsmittel fang Weg war lange spekuliert worden, eine wichtige Rolle bei der Verleihung Stressresistenz für das Tier zu spielen. Mit wenigen Ausnahmen, Studien aus einer Vielzahl von transgenen Tieren mit Manipulationen in verschiedenen antioxidativen Enzymen (zB SOD) zeigen jedoch, dass die Erhöhung des Oxidationsfänger Enzyme nicht die Lebensdauer oder die Gesundheit Spannweite 3 zu erhöhen. Diese Daten legen nahe, dass die Stressresistenz Merkmal konsequent in langlebigen Tieren beobachtet wird von anderen zellulären Wege noch aufgedeckt werden vermittelt. Wir nahmen eine unvoreingenommene vornegenetischer Ansatz für Gene, die auf mutierten, eine Stressresistenz-Phänotyp in kultivierten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) verleihen könnten. ES-Zellen bieten zwei wesentliche Vorteile in dieser Studie: (1) anspruchsvolle genetische Manipulationen sind vorhanden, um das Genom von ES-Zellen zu modifizieren; und (2) Stress resistente ES-Zellen aus dem Bildschirm wiedergewonnen können direkt für Maus Produktion verwendet werden, was eine schnelle Übersetzung in ganzen Tierstudien zur Lebenserwartung und Gesundheitsspanne zu messen. In diesem Bericht beschrieben wir die Verwendung von C9 ES-Zelllinie, in welcher die BLM Allele unter Steuerung durch ein Tetracyclin ansprechende Element. Behandlung von Doxycyclin (DOX) vorübergehend von der Expression von Blm führt zu einer erhöhten Vorfall von Schwesterchromatidaustausch gedreht. Diese kurzfristige Blm Knock-out für die Erzeugung homozygoter Mutationen innerhalb der heterozygote Population erlaubt, so dass rezessive Mutationen für Stressresistenz könnte in das Screening-Verfahren erfasst werden. Wirbeschrieben die Verwendung von piggyBac (PB) Transposon als erbgutverändernd nach dem Zufallsprinzip setzen Sie einen Poly-A-Trap-Kassette (PB-UPA), um Gene in das Genom zu mutieren. Zellen, die mit Unterbrechung eines Gens durch die Poly-A-Falle wurden G418-resistente und konnte zurückgewonnen, so dass eine Sammlung von Gen-Trap-Mutanten (Gen-Trap-Bibliothek) können hergestellt werden, und in der Folge für die mutierten Klone, die Stress resistent waren zu sehen sein. Stress-resistente Klone von der Selektion gewonnen könnte ziemlich rasch durch molekulare Techniken hinsichtlich der Anzahl von Einfügungen (qPCR) charakterisiert werden, der Ort der Insertion (splinkerette PCR), die Identität der unterbrochene Gen (BLAST) und sein Expressionsniveau ( RT-qPCR). Die PB Einsetzen könnte durch transiente Expression mPB Transposase in dem Klon wieder mobilisiert werden, um die Wildtyp-DNA-Sequenz wieder herzustellen und damit zu testen für den Verlust von Stressresistenz. Diese sind leistungsfähige Möglichkeiten, um die Kausalität der Mutation zu bestätigen, die vor getan werden sollteteure Maus Produktion. Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellen, die Stressfaktoren ausgesetzt verloren ihre Pluripotenz 4,5. Somit wird in diesem Protokoll ist die Erhaltung einer Replikatgruppe von mutierten Zellen, die nicht mit Stressoren behandelt werden, würde die für den erfolgreichen Produktions Maus. Unser Labor hat den C9 ES-Zelllinie und der PB-UPA-Vektor entwickelt, die beide zur Verfügung stehen, um anderen Forschern auf Anfrage. Das Protokoll die hier berichtet wird durch die Erzeugung von de novo Bibliothek von Gen-gefangen ES-Zellen mit PB-UPA (1A), gefolgt von Replika-Plattierung und Streßselektion auf Stress-resistente Klone (1B) zu isolieren, zu starten. Wir haben gezeigt, die Auswahl mit Paraquat, ein potenter Radikalerzeuger innerhalb der Zellen. Praktisch jede zytotoxische Verbindung oder ein Toxin, beispielsweise ER Stressoren (zB Thapsigargin und Tunicamycin), neuronale Oxidationsmittel (zB MPP +, 6-Hydroxy Dopamin und Rotenon), Wärme und SchwerMetalle (zB Cd, Se) könnten mit dem Verfahren geeignet ist, für die jeweiligen resistenten Mutanten auszuwählen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Vector</td></tr><tr><td>PB-UPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBasePuro<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Tissue Culture</td></tr><tr><td>500-ml-Stericup-Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>250-ml-Stericup-Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Steriflip-GV Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>KO DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Tissue Culture Biologicals</td><td>104</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Viologen Dichlorid ( Paraquat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid Hybri-MAX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMAX 0,1 % Gelatine</td><td>EMD Millipore</td><td>ES006B</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td></td><td>Corning 353108</td><td></td></tr><tr><td>T75-Kolben</td><td>Corning</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-Platte</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>150-mm-Platte</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3585</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Bodenplatte</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Reservoir</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Röhrchen</td><td>VWR International, LLC</td><td>82050-276</td><td></td></tr><tr><td>Primäre embryonale Fibroblasten der Maus</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>DR4 Embryonale Fibroblasten der Maus</td><td>Angewendete Stammzellen</td><td>ASF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Fisher BioReagenzien&nbsp;</td><td></td><td></td>BP25312</tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Fisher BioReagenzien&nbsp;</td><td></td><td></td>BP26531</tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5702</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides (für TC10)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electroporation</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652611</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Küvetten (4&#160; mm Abstand)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Molecular Biology</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercylcer ep Gradient&nbsp; S</td><td></td></tr><tr><td>Puregene Core Kit B</td><td>Qiagen</td><td>158745</td><td></td></tr><tr><td>Topo-TA Klonierungskit</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Synthesekit mit hoher Kapazität</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Doppelt verarbeitetes Gewebekulturwasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Sau3A1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0169L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">96-Well-Lysepuffer (Ramires-Solis et al. 1992)</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher BioReagenzien&nbsp;</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134<</td><td></td></tr><tr><td>em>N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Fisher BioReagenzien&nbsp;</td><td>BP1700<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Elektrophorese</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4469EDU</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose&nbsp;</td><td>GeneMate</td><td>E3120500</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA-Leiter</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA-Leiter</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>2-log DNA-Leiter</td><td>New England BioLabs</td><td>N3200L</td><td></td></tr></tbody></table>

vorwärts genetische ansatz zur stressresistenz-gene in mäuse entdecken - hochdurchsatz-bildschirm in es-zellen

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phänotyp-getriebene genetische Screens bei Mäusen sind eine leistungsfähige Technik, um Genfunktionen aufzudecken, werden aber oft durch extrem hohe Kosten behindert, was ihr Potenzial stark einschränkt. Wir beschreiben hier die Verwendung von embryonalen Stammzellen (ES) der Maus als Surrogatzellen, um nach einem Phänotyp von Interesse zu suchen und diese Zellen anschließend in einen Wirtsembryo einzuführen, um sich zu einer lebenden Maus zu entwickeln, die den Phänotyp trägt. Diese Methode bietet (1) eine kostengünstige Hochdurchsatzplattform für das genetische Screening in Säugetierzellen; (2) eine schnelle Möglichkeit, die mutierten Gene zu identifizieren und die Kausalität zu überprüfen; und (3) eine Abkürzung, um Mausmutanten direkt aus diesen ausgewählten ES-Zellen für Ganztierstudien zu entwickeln. Wir zeigten, wie Paraquat (PQ) verwendet wird, um resistente Mutanten zu selektieren und Mutationen zu identifizieren, die oxidative Stressresistenz verleihen. Andere Stressoren oder zytotoxische Verbindungen können auch verwendet werden, um nach resistenten Mutanten zu suchen, um neue genetische Determinanten einer Vielzahl von zellulären Stressresistenzen aufzudecken.

In einem typischen Experiment Mutagenese erfolgte die Transfektion besteht aus einer Gesamtzahl von 3 x 10 7 ES-Zellen mit PB-UPA und mPB Transposase. Die Zahl der Gene-gefangen ES-Zellen in zwei unabhängigen Experimenten erzeugt, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Effizienz der Gen-Einschluss etwa 0,04%. Die kombinierten Gen-Trap-Bibliotheken enthalten 22.400 unabhängigen Mutanten, über eine vollständige Abdeckung des Mausgenoms (23.000 kodierenden Gene). Übermäßige Abde...

Stressresistenz ist eines der Markenzeichen für Langlebigkeit und ist bekannt, genetisch geregelt. Hier entwickelten wir eine unvoreingenommene Hochdurchsatzverfahren für Mutationen, die Stress-Resistenz verleihen in ES-Zellen, mit dem Maus-Modelle für Langlebigkeit Studien entwickeln zu screenen.

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Die allgemeinen Ziele dieser Methode bestehen darin, effizient stressresistente mutante embryonale Stammzellen auszuwählen, assoziierte Gene schnell zu identifizieren und kostengünstig lebensfähige Mausmodelle zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Alterungsforschung zu beantworten, indem sie es uns ermöglicht, Gene zu identifizieren, die an der Stressresistenz beteiligt sind, und die Verbesserung der Gesundheits- und Lebensspanne bei Säugetieren zu untersuchen. Ein Vorteil dieser Technik besteht daher darin, dass sie die kostengünstige Selektion neuartiger Mutanten sowie die Erzeugung phänotypischer Mausmodelle nach dem Screening embryonaler Stammzellen als Ersatzmodell ermöglicht.Um mit der Kultivierung von ES-Zellen zu beginnen, zunächst ein Gefäß mit mitomycin-C-aktivierten primären embryonalen Mausfibroblasten oder PMFs in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auftauen, die als Fütterungszellen für die ES-Zellkultur verwendet werden sollen. Die Zellen in fünf Milliliter ES-Zellmedium überführen und bei 100 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Den Überstand absaugen und die Zellen in 30 Milliliter ES-Zellmedium resuspendieren.Verteilen Sie die

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