Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Hepatologie und Toxikologie zu beantworten, und bietet uns die Möglichkeit, neue in-vitro-Kokultur- und gewebetechnisch hergestellte Lebermodelle zu entwickeln. Der Vorteil dieser neuen Technik besteht darin, alle Leberzellpopulationen aus derselben Spende und aus derselben kleinen Lebergewebeprobe zu isolieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das frisch präparierte Lebergewebe unter sterilen Bedingungen wiegen und die Gewebeprobe in die laminare Luftströmungshaube legen.

Reinigen Sie dann das Blut von der Oberfläche der Gewebeprobe. Spülen Sie anschließend die Kanülen mit 1X Perfusionslösung eins durch. Befestigen Sie die Oliven der Kanülen mithilfe des Gewebeklebers in den größeren Blutgefäßen.

Testen Sie anschließend die Perfusion und prüfen Sie die Kanülen auf Leckagen. Danach verschließen Sie alle Blutgefäße, aus denen klare 1X-Perfusionslösung austritt, einzeln mit Gewebeleim. Anschließend bringen Sie die kanülierte Lebergewebeprobe in den Büchner-Trichter ein.

Danach die Flussrate der peristaltischen Pumpe je nach Anzahl der verwendeten Kanülen und dem Widerstand des Lebergewebes zwischen 7,5 und 14,6 Milliliter pro Minute einstellen. Das Gewebe so lange perfundieren, bis das gesamte Blut mindestens 20 Minuten, maximal jedoch 30 Minuten lang ausgespült ist. In einigen Fällen kann es notwendig sein, eine der Kanülen mit Plastikklammern zu verschließen oder den Innendruck eines Bereichs zu erhöhen, indem man vorsichtig mit einem Spatel gegen die Leberkapsel drückt, um die Perfusion zu optimieren.

Eine vollständige Farbänderung von bräunlichrot zu hellbraun oder hellgelb weist auf eine gute Perfusion hin. Danach wechseln Sie die Perfusionsflüssigkeit zur Verdauungslösung, die Kollagenase P enthält. Anschließend richten Sie den Versuchsaufbau für den Verdauungsschritt neu ein. Führen Sie danach einen zirkulären Fluss der Verdauungslösung bis zu 15 Minuten lang durch.

Unterbrechen Sie die Perfusion regelmäßig und überprüfen Sie den Grad der Verdauung. Es ist entscheidend, dass die Perfusion mit der Verdauungslösung sofort gestoppt wird, sobald die Lebergewebeprobe ausreichend verdaut ist. Entnehmen Sie die Leber aus dem Gerät, sobald sie fertig ist, und legen Sie sie in eine Glaswanne.

Spülen Sie die Außenseite der Gewebeprobe mit eiskalter Stop-Lösung ab. Entfernen Sie die Kanülen aus der Lebergewebeprobe. Öffnen Sie dann mit einem Skalpell die Lebergewebeprobe, indem Sie die Mitte des Bereichs, an dem die Kanülen befestigt waren, einschneiden, und achten Sie darauf, dass die Glissonsche Kapsel intakt bleibt.

Spülen Sie das Innere der Gewebeprobe aus und bedecken Sie anschließend die gesamte Gewebeprobe mit Stop-Lösung. Danach schütteln Sie das Gewebe vorsichtig, um die Zellen freizusetzen. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und filtrieren Sie sie durch ein Gazefunnen in 10 Plastikröhrchen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 50 Milliliter.

Fügen Sie der Lebergewebeprobe weitere Stop-Lösung hinzu, bis ein Endvolumen von 500 Milliliter erreicht ist. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension, sammeln den Überstand für die spätere Isolierung von NPCs und vereinen die Zellpellets in 250-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Waschen Sie danach die Zellpellets mit PBS.

Zentrifugieren Sie hierfür die Zellsuspension. Sammeln Sie den Überstand, vereinigen Sie die Pellets und resuspendieren Sie das Pellet in Hepatozyten-Inkubationsmedium. Bestimmen Sie anschließend die Zellzahl und -viabilität in der resultierenden Zellsuspension mittels Trypanblau-Färbung.

Um die nicht-parenchymalen Leberzellen zu isolieren, zentrifugieren Sie das gesammelte Überstandsvolumen, um die verbleibenden Erythrozyten und Hepatozyten zu entfernen. Sammeln Sie die Überstände und zentrifugieren Sie diese zweimal, um die Zellpellets für die Sedimentation von HCS, LEC, teilweise KC sowie der verbleibenden KC zu erhalten. Anschließend resuspendieren Sie die Pellets in HBSS. Bereiten Sie dann ein 25%- und ein 50%-Dichtegradienten vor, indem Sie die Dichtegradientenlösung und PBS für die Dichtegradientenzentrifugation mischen.

Platzieren Sie die 25%ige Dichtegradientenlösung vorsichtig auf der 50%igen Dichtegradientenlösungsschicht. Anschließend geben Sie die NPC-Suspension vorsichtig und langsam auf die 25%ige Dichtegradientenlösungsschicht, um eine klare Trennung beider Schichten zu erzielen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension auf dem Dichtegradienten ohne Bremse.

Die NPC befinden sich an der Grenzschicht zwischen den Dichtegradientenschichten mit 25 % und 50 %. Aspirieren Sie die toten Zellen und Zelltrümmer aus der obersten Schicht und sammeln Sie die Grenzschicht vorsichtig ein. Führen Sie nach der Doppelzentrifugation eine Zellzählung für den KC- und den MPC-Anteil durch.

Anschließend die NPC-Fraktion mit dem zuvor beschriebenen zweistufigen Zentrifugationsschritt zentrifugieren und die NPC in Kupffer-Zell-Aussaatmedium resuspendieren. Die Fraktion, die KC enthält, in Kunststoff-Zellkulturgefäßen mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch 5 KC pro Quadratzentimeter aussäen. Die KC-Kulturen 20 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Primäre KC sollten innerhalb kurzer Zeit an den Zellkulturgefäßen haften. Danach sammeln Sie den Überstand, der die nicht angehefteten NPC enthält, die hauptsächlich aus LEC und HSC bestehen. Um LEC von HSC zu trennen, zentrifugieren Sie zunächst den Überstand.

Waschen Sie dann das Pellet mit PBS. Nach der zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in Stellatzell-Endothelzellen-Trennmedium und bestimmen die Zellzahl für alle verbleibenden Zellen. Anschließend resuspendieren Sie 10 Millionen Zellen in einem Milliliter Stellatzell-Endothelzellen-Trennmedium.

Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter Blockierungslösung aus dem MAX-Kit und 20 Mikroliter der CD31-Mikroperlen für die Immunmarkierung hinzu und inkubieren Sie die resultierende Suspension 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Trennen Sie danach die LEC von den HSC gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll für das magnetisch aktivierte Zellsortiersystem max und sammeln Sie die HSC-Fraktion. Eluieren Sie die magnetisch zurückgehaltenen CD31-positiven LEC und suspendieren Sie sie in Sternzellen-Endothelzell-Kulturmedium.

Hier zeigen diese Bilder die verschiedenen isolierten Leberzellpopulationen unmittelbar nach dem Isolationsprozess im Phasenkontrastmikroskop. Dieser Bildersatz zeigt die isolierten und kultivierten Zellen nach 24 Stunden Kultivierung. Die immunfluoreszenzbasierte Charakterisierung verschiedener Zellfraktionen ist hier dargestellt.

PHH zeigten 24 Stunden nach der Isolierung positive Signale für das Hepatozyten-Markerprotein CK18, KC waren 24 Stunden nach der Isolierung positiv für den Marker CD68, LEC zeigten 72 Stunden nach der Isolierung positive Signale für Vimentin und HSC waren 72 Stunden nach der Isolierung positiv für GFAP. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass eine erfolgreiche Isolierung von der optimalen Verdauung der Lebergewebeprobe abhängt. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der Verdauungsprozess kontrolliert und wie die Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wird, da dies die kritischen Schritte dieses Verfahrens darstellen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der medizinischen Forschung den Weg, um hepatische Funktionen und Erkrankungen in neu geschaffenen in-vitro-Zellkulturen und gewebeengineeringbasierten Lebermodellen zu untersuchen.