Name: Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung primärer humaner Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen aus demselben Spender. Diese Methode ermöglicht hohe Ausbeute und Vitalität für in-vitro-Modelle.

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Wir möchten Jia Li Liu für ihre Unterstützung bei der Erstellung von Abbildung 1. Diese Studie wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Projekt Virtuelle Leber unterstützt wurde zu danken: 0.315.741.

Anmerkung: Alle Zellen von resezierten nicht-tumorösen menschlichen Lebergewebe isoliert wurden, die nach partieller Leberresektion mit primären oder sekundären Lebertumoren geblieben. Universitätsmedizin Berlin - Einverständniserklärung der Patienten wurde nach den ethischen Richtlinien der Charité erhalten. 1. Herstellung von Materialien und Lösungen <ol><li> Sterilisieren alle Instrumente und die Materialien im Voraus eine bakterielle Kontamination während des Isolationsprozesses zu vermeiden. </li><li> Herstellung der Lösungen für die Perfusion der Leber Gewebeprobe erforderlich, den Isolationsprozess der Hepatozyten und nicht-parenchymalen Leberzellen und die Kultivierung von primären humanen Leberzellen gemäß den Tabellen 1 und 2, mit Ausnahme der Digestion-Lösung , die frisch zubereitet Vor dem Benutzen. Alle Lösungen können bei 4 ° C gelagert werden, und es wird empfohlen, sie innerhalb von 4 Wochen nach der Herstellung zu verwenden. </li><li> SterilisierenAlle Lösungen, die eine 0,22 um Flaschenaufsatz-Filter. </li></ol> 2. Herstellung von Perfusionsausrüstung <ol><li> Stellen Sie die Ausrüstung für die Perfusion und die Verdauung der Leber Gewebeprobe, wie in 1A gezeigt. </li><li> Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 39 ° C optimal Kollagenase P-Aktivität während der Perfusion und die Verdauung zu gewährleisten. </li></ol> 3. Perfusion und Verdauung der Leber Gewebeprobe (1,5 h) <ol><li> Wählen Sie eine Gewebeprobe mit einem intakten Glisson-Kapsel aus dem Lebergewebe reseziert. Wenn die Gewebeprobe schneiden, versuchen, eine kleine Schnittfläche mit gut sichtbaren Gefäße zu erhalten. Vermeiden Sie warme Ischämie mal durch den Transport und die Handhabung der Lebergewebeprobe auf Eis, bis die Perfusion. </li><li> Nehmen Sie das Gewebegewicht unter sterilen Bedingungen und legen Sie die Lebergewebeprobe in einer Petrischale im laminaren Luftstrom. Säubern Sie die Oberfläche der Gewebeprobe mit einer sterilen Kompresse aus reRest Blut und bündig ich die Kanüle Set mit 1x Perfusions-Lösung, um sicherzustellen, dass alle Kanüle durchlässig waren. </li><li> Verwenden Sie Gewebekleber die Oliven der Kanülen in einigen größeren Blutgefäße zu reparieren. Je nach der Größe der Lebergewebeprobe und die Anzahl der Gefäße auf der Oberfläche, mit einem Kanülensatz mit 3 bis 8 Kanülen. Testen Sie die Perfusion und prüfen Sie auf Leckagen. Schließen Sie alle Blutgefäße, die ich klar 1x Perfusions-Lösung auslaufen, mit Gewebekleber. </li><li> Legen Sie die Kanüle eingeführt Lebergewebeprobe in den Büchner - Trichter auf dem perforierten Filterscheibe (1A). </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit der peristaltischen Pumpe zwischen 7,5 ml / min und 14,6 ml / min auf der Anzahl der Kanülen Abhängigkeit verwendet und auf den Widerstand des Lebergewebes. Anpassen der Durchflussrate jedes Mal um sicherzustellen, dass ein Strom, aber langsame Perfusion ist. Perfuse das Gewebe, bis das gesamte Blut gespült wird, aber mindestens 20 min. Beobachten Sie das Gewebe heller in Gebieten mit guter perfusiauf. Anmerkung: In einigen Fällen kann es erforderlich sein, eine der Kanülen festzuklemmen mit Kunststoffklammern oder um den Innendruck eines Bereichs zu erhöhen, indem sanft mit einem Spatel gegen die Leberkapsel drückt, die Perfusion zu optimieren. Eine komplette Farbwechsel zu einem hellgelben bis leicht bräunliche Farbe zeigt eine gute Perfusion. </li><li> Ändern , um die Perfusionsflüssigkeit zur Digestion-Lösung , die Kollagenase P (Tabelle 1). </li><li> Ordnen Sie das Setup (Abbildung 1A) für die Verdauung Schritt. Deshalb eine kreisförmige Strömung des Verdaus-Lösung durchzuführen gemäß 1B für bis zu 15 min. Hinweis: Es ist wichtig, die Durchblutung sofort zu stoppen, wenn die Lebergewebeprobe ausreichend verdaut wird. Eine gute Verdauung kann beobachtet werden, wenn das Gewebe zeigt keine Anzeichen einer Elastizität durch Aufrechterhaltung der Kapsel Deformationen beurteilt als, wenn sie mit einem Spatel eingeschoben wird. </li></ol> 4. Isolierung von Hepatozyten (1 h) <ol><li> TUrne die peristaltische Pumpe ab und legen Sie die Lebergewebeprobe in einer Glasschale. Spülen Sie die Außenseite der Gewebeprobe mit eiskaltem Stopp-Lösung (Tabelle 1). Entfernen Sie die Kanülen aus der Leber Gewebeprobe. Verwenden eines Skalpells die Leber Gewebeprobe zu öffnen, indem sie in der Mitte des Bereichs, wo die Einschneiden Kanülen angebracht wurden. Halten Sie darauf, dass die Glisson&#39;s Kapsel intakt bleibt. </li><li> Spülen Sie die Innenseite der Gewebeprobe und dann decken die gesamte Gewebeprobe mit eiskaltem Stopp-Lösung. Schütteln, um das Gewebe sanft um die Zellen zu lösen aus dem Gewebe. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension und filtern sie durch einen Blick Trichter (Plastiktrichter mit Gazekompresse ausgekleidet) in 50 ml Plastikröhrchen. Noch ein Stop-Lösung zur Leber Gewebeprobe, bis ein Endvolumen von 500 ml verbraucht wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand für eine spätere nicht Parenchymzelle Isolation. Waschen des Zellpellets mit PBS (2A). </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension wieder bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und resuspendiere das Pellet in Hepatocyte Incubation Medium (Tabelle 2, 2B). </li><li> Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit in der resultierenden Zellsuspension unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung. Zählen Sie die lebenden und toten Zellen in einer Neubauer-Zählkammer. Berechnen Sie die Zellzahl, die Lebensfähigkeit und den Ertrag von PHH unter die Formeln. Ausbeute (gezählten Zellen) = gezählten Zellen x Verdünnungsfaktor x Volumen der Zellsuspension (ml) x 10.000 Ausbeute (Hepatozyten / (g Lebergewebeprobe)) = (Ausbeute (Hepatozyten / (ml Medium)) x Volumen der Zellsuspension (ml)) / (Gewicht der Lebergewebeprobe (g)) Lebensfähigkeit (%) = 100% x (Anzahl der lebenden Zellen) / (Gesamtzellzahl) </li></ol> 5. Reinigung von Hepatozyten (1 h) Hinweis: Diese Reinigungsstufe wird empfohlen, wenn die Lebensfähigkeitist niedriger als 70%. <ol><li> Führen Sie alle Schritte auf dem Eis. Bereiten Sie eine 25% Dichtegradienten durch Mischen von 5 ml Dichtegradient-Lösung und 15 ml PBS für Dichtegradientenzentrifugation. </li><li> Setzen Sie ein Maximum von 50 Mio Zellen insgesamt aus der Hepatozyten - reichen Zellsuspension vorsichtig und langsam auf dem 25% Dichtegradienten Schicht , um sicherzustellen , dass eine klare Trennung der beiden Schichten erreicht (Abbildung 2C). Setzen Sie die Rohre sorgfältig in die Zentrifuge und Zentrifuge bei 1250 · g, 20 min, 4 ° C ohne Bremse (2D). </li><li> Saugen Sie das restliche Zellsuspension und die toten Zellen in der Zwischenphase. Je nach Fettgehalt könnte man auch die Dichtegradient-Lösung anzusaugen. Hinweis: PHH mit niedrigem Fettgehalt ein dichtes Pellet-Form und der Dichtegradient vollständig abgesaugt werden. PHH mit hohem Fettgehalt ein diffuser Pellet und eine Menge an lebenden Zellen bilden sich in der Dichtegradientenlösung über dem Pellet verbleiben. </li><li>Re-suspend die Hepatozyten-Pellets mit PBS und Zentrifuge wieder bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Pool, die Pellets, waschen wieder mit PBS und erneut zu suspendieren gereinigte PHH in Hepatozyten Inkubationsmedium. Führen Zellzählung als 4.6 in Schritt beschrieben. </li></ol> 6. Der Anbau von Hepatozyten <ol><li> Vorbereitung der Zellkulturschalen für die Aussaat von PHH, indem sie mit einer extrazellulären Matrix Beschichtung, beispielsweise Rattenschwanz-Kollagen (Kollagen-Typ I). Bereiten Sie die Rattenschwanz - Kollagen nach dem Protokoll von Rajan etabliert et al. 17 </li><li> Verdünnen Sie die Rattenschwanz-Kollagen-Stammlösung 1: 200 in PBS. Transfer 100 ul / cm 2 Rattenschwanz Kollagen - Lösung in den Kulturschalen, wobei darauf geachtet , dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren der Zellkultur Kunststoffe für 20 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das restliche Rattenschwanz-Kollagen-Lösung. </li><li> Seed 15 x 10 4 Hepatozyten / cm 2 in Hepatozyten Inkubationsmedium auf Kultur dishes mit Rattenschwanz Kollagen beschichtet. Kultivieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC, 5% CO 2 für mindestens 4 Stunden. Nach 4 Stunden wurden die Hepatozyten eingehalten und das Medium verändert werden kann. </li><li> Führen Untersuchungen je nach Versuchsaufbau. Eine Kultivierungszeit von 48 h wird empfohlen, damit die Zellen aus dem Isolationsprozess zu erholen. </li></ol> 7. Isolierung von Nicht-parenchymale Leberzellen (1,5-2 h) <ol><li> Zentrifuge der gesammelte Überstand (Schritt 4.5 und 4.6) bei 72 × g, 5 min, 4 ° C, um die verbleibenden Erythrozyten und Hepatozyten zu beseitigen. Pool der Überstände und Zentrifuge sie zweimal zwei Zellpellets zu gewinnen: 300 · g, 5 min, 4 ° C für die Sedimentation von HSC, LEC und zum Teil KC und 650 · g, 7 Minuten, 4 ° C für die Sedimentation des verbleibenden KC. </li><li> Pool beide Pellets und resuspendieren sie in HBSS. Bereiten Sie eine 25% und eine Dichte von 50% Gradienten durch Mischen von Dichtegradient-Lösung und PBS für Dichtegradienten Zentri- fugalkrugation (25% Dichtegradient - Lösung: 5 ml Dichtegradient - Lösung und 15 ml PBS, 50% Dichtegradient - Lösung: 10 ml Dichtegradient - Lösung und 10 ml PBS, siehe Abbildung 2). Legen Sie die 25% Dichtegradientenlösung vorsichtig auf der Oberseite der 50% Dichtegradientenlösung Schicht. </li><li> Setzen Sie den NPC Suspension vorsichtig und langsam auf dem 25% Dichtegradientenlösung Schicht in einer Weise, dass eine klare Trennung der beiden Schichten erreicht wird. </li><li> Centrifuge die Zellsuspension auf dem Dichtegradienten bei 1.800 × g, 20 min, 4 ° C ohne Bremse (Abbildung 2.2). </li><li> Aspirat tote Zellen und Zellbruchstücke aus der obersten Schicht. Der NPC werden in der Interphase zwischen 25% und 50% Dichtegradienten Schicht (2) angeordnet ist . Sammeln NPC, waschen Sie sie mit HBSS und Zentrifuge der Zellsuspension die oben beschriebene Doppel Zentrifugationsschritt Anwendung (Schritt 7.2.). </li></ol> 8. Die Trennung von Kupffer-Zellen (AdherenceTrennungsschritt) (1 h) <ol><li> Durchführen einer Zellzahl für die KC in der Fraktion NPC wie in Schritt 4.6 beschrieben. (Bei Auftreten von KC in Suspension siehe 3B). Zentrifuge der NPC - Fraktion mit der oben beschriebenen Doppel Zentrifugationsschritt (Schritt 7.2) und resuspendieren die NPC in Kupffer Zellaussaat - Medium (Tabelle 2). </li><li> Samen der KC enthaltenden Fraktion auf Kunststoff - Zellkulturgefäßen bei einer Dichte von 5 x 10 5 KC / cm 2. Inkubieren der KC Kulturen für 20 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. Primäre KC innerhalb einer kurzen Zeitdauer (Figur 2.3) auf Zellkultur - Kunststoff anhaften. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit nicht eingehalten NPC enthält, die hauptsächlich aus LEC und HSC. Pool der Überstände für eine spätere Trennung von LEC (siehe Abschnitt 9) und HSC (siehe Abschnitt 10). Waschen Sie die anhaftende KC mit HBSS und kultivieren sie in Kupffer Zellkulturmedium (Tabelle 2) bei 37 ° C, 5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator. </li></ol> 9. Trennung von Endothelial Cells (1,5 h) <ol><li> Zentrifugieren der Überstand gesammelt (Schritt 8.5.) Bei 300 xg, 5 min, 4 ° C. Waschen Sie das Pellet mit PBS. Nach Zentrifugation bei 300 xg, 5 min, 4 ° C erneut suspendieren der Zellen in Sternzellen / Endothelial Zellseparationsmedium und einer Zellzahl für alle verbleibenden Zellen durchführen, wie in Schritt 4.6 beschrieben. </li><li> Re-suspend 1 x 10 7 Mio Zellen in 1 ml Sternzellen / Endothelial Zellseparationsmedium, 20 ul hinzufügen Blocking Solution aus der MACS-KIT und 20 ul der CD31 - Mikrokorn für Immunmarkierung und Inkubation der erhaltenen Suspension für 15 min bei 4 ° C Temperatur (Abbildung 2.4). </li><li> Separate LEC von HSC wie im Herstellerprotokoll für die magnetisch aktivierten Zellsortiersystem MACS (Abbildung 2.5) beschrieben. Eluieren magnetisch gehalten CD31-positive LEC und suspendieren sie in Sternförmige Cell / Endothelial Zellkulturmedium (Tabelle 2). </li><li> Führen Zelle für LEC Zählen, wie in Schritt 4.6 beschrieben. Seed LEC in einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / cm 2 in Zellkulturgefäße , beschichtet mit Rattenschwanz - Kollagen (siehe Schritt 6.1). Kultivieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li></ol> 10. Die Trennung von Sternzellen (0,5 Stunden) <ol><li> Unbeschriftet HSC passieren die Trennsäule während des MACS Verfahren. Sammeln Sie die HSC - Fraktion (siehe Schritt 9.5, Abbildung 2.5). Führen Zellzählung als 4.6 in Schritt beschrieben. </li><li> Seed HSC mit einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / cm 2 in Zellkulturgefäße , beschichtet mit Rattenschwanz - Kollagen (siehe Schritt 6.1) in Sternzellen / Endothelial Zellkulturmedium (Tabelle 2) und kultivieren sie bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li></ol><img alt= &quot;Tabelle 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tabelle 1: Perfusion und Isolationslösung. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tabelle 2: Kultur und Isolation Medien.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Die veröffentlichten Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung reiner PHH und NPC, nämlich KC, HSC und LEC, gleichzeitig in hoher Qualität und Reinheit aus der gleichen Probe von menschlichem Lebergewebe. Die Mehrzahl der Publikationen mit Leberzellisolationen Umgang decken nur eine dieser Zellpopulationen 18-20 und Isolierungsverfahren mit menschlichem Gewebe durchgeführt sind selten (rezensiert von Damm et al.) 21. Anpassung von Methoden mit tierischem Gewebe etabliert (zB</em...

Menschliche Lebergewebe ist sehr komplex und besteht aus zwei verschiedenen Zelleinheiten, Parenchymzellen und nicht-parenchymale Zellen (NPC). Parenchymale Leberzellen umfassen Hepatozyten und Cholangiozyten. Hepatozyten repräsentieren 60 bis 70% der gesamten Leberzellen und machen die meisten der metabolischen Leberfunktionen, zB Gallensäure und Komplementfaktor Synthese, Biotransformation und Energiestoffwechsel 2,3. Je kleiner NPC Fraktion bildet 30-40% der gesamten Leberzellen. NPC umfassen verschiedene Zellpopulationen, nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und die hepatischen Sternzellen (HSC). Diese heterogene Zellfraktion spielt eine zentrale Rolle in physiologischen Prozessen der Leber. Ferner nehmen NPC akute Leberschäden bei der Vermittlung, zB arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI) sowie bei chronischen Leberverletzungen, wie Zirrhose 4. In den letzten Jahren hUman Leberzellen haben sich mehr und mehr wesentlich in Forschung und Entwicklung von Drogentests, Arzneimittelentwicklung und Identifizierung von neuen biochemischen Wege bei Lebererkrankungen werden. Für in - vitro - Tests PHH Monokulturen sind immer noch als der &quot;Goldstandard&quot; 5 betrachtet. Die Hauptbeschränkung der gegenwärtigen homotypische Leber Modelle Dedifferenzierung , und Funktionsverlust der Hepatozyten innerhalb weniger Tage 4. Die Einrichtung von 3-dimensionalen (3D) Kulturverfahren hat gezeigt , dass diese Einschränkungen 4,6 ausgeglichen werden können. Aber auch moderne 3D - Kulturtechniken sind nicht in der Lage , alle hepatotoxischer Modi der Aktionen 7 angezeigt werden soll . Fehlende NPC Populationen in den bestehenden in vitro - Modelle werden als möglicher Grund für diese Diskrepanz auf die in vivo Situation diskutiert. Es hat sich gezeigt, dass die Zell-Zell Kommunikation eine zentrale Rolle zwischen den verschiedenen Leberzellpopulationen gezeigt in physiologischen Homöostase spielt, sondern auch in pathophysiologic verarbeitet 8. Deshalb ist die wissenschaftliche Aufmerksamkeit konzentriert sich mehr und mehr auf NPC und ihre Zell-Zell-Interaktionen. Ihre gezielte Einsatz in Co-Kultur und Tissue Engineering Systeme könnte eine Lösung für die hohe Nachfrage von in - vitro - Leber - Modelle 8,9 sein , die so nahe an die in - vivo - Situation wie möglich. Derzeit ist die größte Herausforderung ist die Entwicklung eines standardisierten humanen Leber Co-Kultur-Modell, das klar definierte Abschnitte von PHH und NPC enthält. In der Folge Isolationstechniken für die sehr heterogene Leberzellen benötigt werden und diejenigen müssen optimiert werden, um reine Zellpopulationen zu gewinnen. Während standardisierte Protokolle für die Isolierung PHH 10 vorhanden ist , ist die standardisierte Isolierung menschlicher NPC noch in der Entwicklung. Die meisten veröffentlichten NPC Isolation Protokolle basieren auf Experimenten mit nicht-menschlichen Zellen 11,12. Nur wenige Publikationen beschreiben die Isolierung Prozess der menschlichen NPC und die meisten decken nurVerfahren zur Isolierung von einem Zelltyp 11-16. Die wichtigsten Zelleigenschaften, die für die Zellseparation genutzt wurden, sind Größe, Dichte, Bindungsverhalten und der Expression von Oberflächenproteinen. Auf der Grundlage dieser Eigenschaften entwickelten wir ein vereinfachtes Protokoll PHH, KC, LEC und HSC zu isolieren, die zuvor 1 in Experimental Biology and Medicine veröffentlicht wurde. Aufgrund des breiten Interesses an dieser Technik war es das Ziel dieses Artikels ein detaillierteres Protokoll für die Leberzellisolierungsverfahren, um ein Video mit, die die Technik leichter reproduzieren können. Das Protokoll enthält auch Qualitätskontrollverfahren zur Ermittlung der Ausbeute und Lebensfähigkeit sowie zur Identifikation und Reinheits Auswertung unter Verwendung von spezifischen Immunfärbungen.

<table><tbody><tr><td>General Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urinbecher</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Spritze 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenaufsatz Filter</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Polypropylen Konisches Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td> serologische Pipetten <td>mit 24 Well</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &micro; L, 200 &Mikro; L, 1.000 &Mikro; l</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Isolationsausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkulation Thermostat</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feinskalen</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner Trichter</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststofftrichter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauchkanülen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mit Olivenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasschale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Feder</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Zählkammer</td><td>Optic Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Abdecktuch</td><td>Charit&eacute; Universität&auml; tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>Kompresse</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>sterile OP-Handschuhe</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekleber</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Glasflasche</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Trennlösung</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>Dichte 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Strang' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>ohne Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sigma</td><td></td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Low Glucose (1 g/L) (ohne L-Glutamin)</td></tr><tr><td>HEPES Puffer Lösung 1&nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>ohne L-Glutamin</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4%</td></tr><tr><td>William' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>mit GlutaMAX&trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Human-Insulin</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td><stark>Name</stark></td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung für Immunfärbungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, USA</td><td></td><td>monoklonales</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>polyklonales</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoklonales</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoklonales</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoklonales</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 4%Herbeta</td> <td>Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll für die isolierung von primären humanen hepatozyten und entsprechende hauptpopulationen von nicht-parenchymale leberzellen

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Neben parenchymal Hepatozyten besteht die Leber von nicht-Parenchymzellen (NPC) nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und hepatischen Sternzellen (HSC). Zweidimensionale (2D) Kultur von primären humanen Hepatozyten (PHH) gilt bis heute als &quot;Goldstandard&quot; betrachtet für in vitro - Untersuchung von Arzneimittelmetabolismus und Hepatotoxizität. Es ist bekannt, dass die 2D-Monokulturen von PHH von Entdifferenzierung und Funktionsverlust leidet. Kürzlich wurde gezeigt, dass hepatische NPC eine zentrale Rolle in der Leber (patho-) Physiologie spielen und die Wartung von PHH Funktionen. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Rekonstruktion von in - vivo - Gewebearchitektur von 3D- und Co-Kultur - Modelle , die Grenzen von 2D - Monokulturen zu überwinden. Vorveröffentlichten wir ein Verfahren menschlichen Leberzellen zu isolieren und untersucht um die Eignung dieser Zellen für ihre Verwendung in Zellkulturen in Experimental Biology and Medicine 1. Auf Basis des breiten Interesses an dieser tedas Ziel dieses Artikels chnique war ein detaillierteres Protokoll für den Leberzellisolierungsverfahren einschließlich eines Video zu schaffen, das eine einfache Reproduktion dieser Technik ermöglicht. Menschliche Leberzellen wurden aus menschlichen Lebergewebeproben von chirurgischen Eingriffen einem zweistufigen EGTA / Kollagenase P Perfusionstechnik isoliert. PHH wurden aus dem NPC durch eine anfängliche Zentrifugation bei 50 x g abgetrennt. Dichtegradientenzentrifugation Schritte wurden zur Entfernung von abgestorbenen Zellen verwendet. Einzelne Leberzellpopulationen wurden aus dem angereicherten NPC-Fraktion unter Verwendung von spezifischen Zelleigenschaften und Zellsortierverfahren isoliert. Neben der PHH Isolation konnten wir KC, LEC und HSC für die weitere Kultivierung zu trennen. Zusammengenommen können die präsentierten Protokoll die Isolierung von PHH und NPC in hoher Qualität und Quantität von einem Spender Gewebeprobe. Der Zugriff auf gereinigte Leberzellpopulationen könnte die Schaffung von in vivo wie menschliche li erlaubenver-Modelle.

Die Trennung in eine parenchymalen und nicht-parenchymalen Fraktion Gradientenzentrifugation als Clean-up-Verfahren unter Verwendung von Dichte mit der Verwendung von Adhärenz kombinierten Eigenschaften und MACS führt zu erfolgreichen PHH und NPC Isolation. PHH und NPC befindet sich in der hohen Qualität und Quantität isoliert werden. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Einrichtung der Ausrüstung für die Leberperfusion und Verdauung. 10% FCS wurde der Kollagenase P gege...

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Hepatologie und Toxikologie zu beantworten, und bietet uns die Möglichkeit, neue in-vitro-Kokultur- und gewebetechnisch hergestellte Lebermodelle zu entwickeln. Der Vorteil dieser neuen Technik besteht darin, alle Leberzellpopulationen aus derselben Spende und aus derselben kleinen Lebergewebeprobe zu isolieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das frisch präparierte Lebergewebe unter sterilen Bedingungen wiegen und die Gewebeprobe in die laminare Luftströmungshaube legen.Reinigen Sie dann das Blut von der Oberfläche der Gewebeprobe. Spülen Sie anschließend die Kanülen mit 1X Perfusionslösung eins durch. Befestigen Sie die Oliven der Kanülen mithilfe des Gewebeklebers in den größeren Blutgefäßen.Testen Sie anschließend die Perfusion und prüfen Sie die Kanülen auf Leckagen. Danach verschließen Sie alle Blutgefäße, aus denen klare 1X-Perfusionslösung austritt, einzeln mit Gewebeleim. Anschließend bringen Sie die kanülierte Lebergewebeprobe in den Büchner-Trichter ein.Danach die Flussrate der peristaltischen Pumpe je nach Anzahl der verwendeten Kanülen und dem Widerstand des Lebergewebes zwischen 7,5 und 14,6 Milliliter pro Minute einstellen. Das Gewebe so lange perfundieren, bis das gesamte Blut mindestens 20 Minuten, maximal jedoch 30 Minuten lang ausgespült ist. In einigen Fällen kann es notwendig sein, eine der Kanülen mit Plastikklammern zu verschließen oder den Innendruck eines Bereichs zu erhöhen, indem man vorsichtig mit einem Spatel gegen die Leberkapsel drückt, um die Perfusion zu optimieren.Eine vollständige Farbänderung von bräunlichrot zu hellbraun oder hellgelb weist auf eine gute Perfusion hin. Danach wechseln Sie die Perfusionsflüssigkeit zur Verdauungslösung, die Kollagenase P enthält. Anschließend richten Sie den Versuchsaufbau für den Verdauungsschritt neu ein. Führen Sie danach einen zirkulären Fluss der Verdauungslösung bis zu 15 Minuten lang durch.Unterbrechen Sie die Perfusion regelmäßig und überprüfen Sie den Grad der Verdauung. Es ist entscheidend, dass die Perfusion mit der Verdauungslösung sofort gestoppt wird, sobald die Lebergewebeprobe ausreichend verdaut ist. Entnehmen Sie die Leber aus dem Gerät, sobald sie fertig ist, und legen Sie sie in eine Glaswanne.Spülen Sie die Außenseite der Gewebeprobe mit eiskalter Stop-Lösung ab. Entfernen Sie die Kanülen aus der Lebergewebeprobe. Öffnen Sie dann mit einem Skalpell die Lebergewebeprobe, indem Sie die Mitte des Bereichs, an dem die Kanülen befestigt waren, einschneiden, und achten Sie darauf, dass die Glissonsche Kapsel intakt bleibt.Spülen Sie das Innere der Gewebeprobe aus und bedecken Sie anschließend die gesamte Gewebeprobe mit Stop-Lösung. Danach schütteln Sie das Gewebe vorsichtig, um die Zellen freizusetzen. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und filtrieren Sie sie durch ein Gazefunnen in 10 Plastikröhrchen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 50 Milliliter.Fügen Sie der Lebergewebeprobe weitere Stop-Lösung hinzu, bis ein Endvolumen von 500 Milliliter erreicht ist. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension, sammeln den Überstand für die spätere Isolierung von NPCs und vereinen die Zellpellets in 250-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Waschen Sie danach die Zellpellets mit PBS.Zentrifugieren Sie hierfür die Zellsuspension. Sammeln Sie den Überstand, vereinigen Sie die Pellets und resuspendieren Sie das Pellet in Hepatozyten-Inkubationsmedium. Bestimmen Sie anschließend die Zellzahl und -viabilität in der resultierenden Zellsuspension mittels Trypanblau-Färbung.Um die nicht-parenchymalen Leberzellen zu isolieren, zentrifugieren Sie das gesammelte Überstandsvolumen, um die verbleibenden Erythrozyten und Hepatozyten zu entfernen. Sammeln Sie die Überstände und zentrifugieren Sie diese zweimal, um die Zellpellets für die Sedimentation von HCS, LEC, teilweise KC sowie der verbleibenden KC zu erhalten. Anschließend resuspendieren Sie die Pellets in HBSS. Bereiten Sie dann ein 25%- und ein 50%-Dichtegradienten vor, indem Sie die Dichtegradientenlösung und PBS für die Dichtegradientenzentrifugation mischen.Platzieren Sie die 25%ige Dichtegradientenlösung vorsichtig auf der 50%igen Dichtegradientenlösungsschicht. Anschließend geben Sie die NPC-Suspension vorsichtig und langsam auf die 25%ige Dichtegradientenlösungsschicht, um eine klare Trennung beider Schichten zu erzielen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension auf dem Dichtegradienten ohne Bremse.Die NPC befinden sich an der Grenzschicht zwischen den Dichtegradientenschichten mit 25 % und 50 %. Aspirieren Sie die toten Zellen und Zelltrümmer aus der obersten Schicht und sammeln Sie die Grenzschicht vorsichtig ein. Führen Sie nach der Doppelzentrifugation eine Zellzählung für den KC- und den MPC-Anteil durch.Anschließend die NPC-Fraktion mit dem zuvor beschriebenen zweistufigen Zentrifugationsschritt zentrifugieren und die NPC in Kupffer-Zell-Aussaatmedium resuspendieren. Die Fraktion, die KC enthält, in Kunststoff-Zellkulturgefäßen mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch 5 KC pro Quadratzentimeter aussäen. Die KC-Kulturen 20 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Primäre KC sollten innerhalb kurzer Zeit an den Zellkulturgefäßen haften. Danach sammeln Sie den Überstand, der die nicht angehefteten NPC enthält, die hauptsächlich aus LEC und HSC bestehen. Um LEC von HSC zu trennen, zentrifugieren Sie zunächst den Überstand.Waschen Sie dann das Pellet mit PBS. Nach der zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in Stellatzell-Endothelzellen-Trennmedium und bestimmen die Zellzahl für alle verbleibenden Zellen. Anschließend resuspendieren Sie 10 Millionen Zellen in einem Milliliter Stellatzell-Endothelzellen-Trennmedium.Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter Blockierungslösung aus dem MAX-Kit und 20 Mikroliter der CD31-Mikroperlen für die Immunmarkierung hinzu und inkubieren Sie die resultierende Suspension 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Trennen Sie danach die LEC von den HSC gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll für das magnetisch aktivierte Zellsortiersystem max und sammeln Sie die HSC-Fraktion. Eluieren Sie die magnetisch zurückgehaltenen CD31-positiven LEC und suspendieren Sie sie in Sternzellen-Endothelzell-Kulturmedium.Hier zeigen diese Bilder die verschiedenen isolierten Leberzellpopulationen unmittelbar nach dem Isolationsprozess im Phasenkontrastmikroskop. Dieser Bildersatz zeigt die isolierten und kultivierten Zellen nach 24 Stunden Kultivierung. Die immunfluoreszenzbasierte Charakterisierung verschiedener Zellfraktionen ist hier dargestellt.PHH zeigten 24 Stunden nach der Isolierung positive Signale für das Hepatozyten-Markerprotein CK18, KC waren 24 Stunden nach der Isolierung positiv für den Marker CD68, LEC zeigten 72 Stunden nach der Isolierung positive Signale für Vimentin und HSC waren 72 Stunden nach der Isolierung positiv für GFAP. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass eine erfolgreiche Isolierung von der optimalen Verdauung der Lebergewebeprobe abhängt. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der Verdauungsprozess kontrolliert und wie die Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wird, da dies die kritischen Schritte dieses Verfahrens darstellen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der medizinischen Forschung den Weg, um hepatische Funktionen und Erkrankungen in neu geschaffenen in-vitro-Zellkulturen und gewebeengineeringbasierten Lebermodellen zu untersuchen.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Primäre Hepatozyten ein wertvolles Instrument, um biochemische, molekulare und metabolische Funktionen in einem physiologisch relevanten experimentellen Systems zu evaluieren. Wir beschreiben ein zuverlässiges Protokoll für Ratte in situ Leberperfusion, die konsequent erzeugt lebensfähigen Hepatozyten bis bis 1,0 ×...

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Eine modifizierte Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusion Verfahren zur Isolierung von humanen Hepatozyten beschrieben. Dieses Verfahren kann auch auf andere Säugetierlebern, angewendet werden. Die isolierten Hepatozyten sind in hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit, so dass sie ein geeignetes Modell für die wissenschaftliche Forschung in Bereichen wie der Leberregeneration, Pharmakokinetik und Toxikologie.

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung von gesunden und funktionalen primäre Maustaste Hepatozyten. Anweisungen für die Erkennung von hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinsynthese durch nicht-radioaktiven Kennzeichnung Substrat wurden zum besseren Verständnis der Mechanismen, die Protein-Synthese im Rahmen des Energie-Stoffwechsel-Homöostase in der Leber.

Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Erfahren Sie die Isolierung primärer humaner Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen aus demselben Spender. Diese Methode ermöglicht hohe Ausbeute und Vitalität für in-vitro-Modelle.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen (Video) | JoVE Journal

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

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