Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Hepatologie und Toxikologie zu beantworten und bietet uns die Möglichkeit, neue in vitro Co-Kultur- und Tissue-Engineering-Lebermodelle zu entwickeln. Der Vorteil dieser neuen Technik besteht darin, dass alle Leberzellpopulationen aus demselben Spender und demselben kleinen Stück Lebergewebe isoliert werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, wiegen Sie das frisch präparierte Lebergewebe unter verschiedenen Bedingungen und legen Sie die Lebergewebeprobe in die laminare Luftstromhaube.

Reinigen Sie dann das Blut von der Oberfläche der Gewebeprobe. Spülen Sie anschließend die Kanülen mit 1X Perfusionslösung eins. Verwenden Sie den Gewebekleber, um die Oliven der Kanülen in den größeren Blutgefäßen zu fixieren.

Testen Sie dann die Durchblutung und prüfen Sie, ob die Kanülen undicht sind. Verschließen Sie anschließend alle Blutgefäße, aus denen eine klare 1X-Perfusionslösung austritt, eine mit Gewebekleber. Danach geben Sie die kanülierte Lebergewebeprobe in den Buchner-Trichter.

Stellen Sie dann die Durchflussmenge der Schlauchpumpe zwischen 7,5 und 14,6 Milliter pro Minute ein, abhängig von der Anzahl der verwendeten Kanülen und dem Widerstand des Lebergewebes. Perfundieren Sie das Gewebe, bis das Vollblut mindestens 20 Minuten und maximal 30 Minuten lang ausgespült ist. In einigen Fällen kann es notwendig sein, eine der Kanülen mit Kunststoffklammern zu klemmen oder den Innendruck eines Bereichs zu erhöhen, indem man mit einem Spatel sanft gegen die Leberkapsel drückt, um die Durchblutung zu optimieren.

Ein vollständiger Farbumschlag von bräunlich-rot zu hellbraun oder hellgelb deutet auf eine gute Durchblutung hin. Tauschen Sie anschließend die Perfusionsflüssigkeit gegen eine Aufschlusslösung aus, die Kollagenase P enthält. Ordnen Sie dann die Einrichtung für den Aufschlussschritt neu an. Führen Sie anschließend einen zirkulären Fluss der Aufschlusslösung für bis zu 15 Minuten durch.

Stoppen Sie regelmäßig die Durchblutung und überprüfen Sie den Grad der Verdauung. Es ist wichtig, dass die Perfusion mit Aufschlusslösung sofort gestoppt wird, wenn die Lebergewebeprobe ausreichend verdaut ist. Nehmen Sie die Leber aus dem Gerät, wenn sie fertig ist, und legen Sie sie in eine Glasschale.

Spülen Sie die Außenseite der Gewebeprobe mit eiskalter Stopplösung ab. Entnehmen Sie die Kanülen aus der Lebergewebeprobe. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um die Lebergewebeprobe zu öffnen, indem Sie die Mitte des Bereichs einschneiden, an dem die Kanülen befestigt waren, und stellen Sie sicher, dass die Glisson-Kapsel intakt bleibt.

Spülen Sie das Innere der Gewebeprobe und bedecken Sie dann die gesamte Gewebeprobe mit Stop Solution. Schütteln Sie anschließend das Gewebe vorsichtig, um die Zellen daraus zu befreien. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und filtrieren Sie sie durch einen Mulltrichter in 10 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Geben Sie mehr Stop Solution in die Lebergewebeprobe, bis ein endgültiges Volumen von 500 Millilitern verbraucht ist. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspension, sammeln Sie den Überstand für die spätere NPC-Isolierung und poolen Sie die Zellpellets in 250-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Anschließend waschen Sie die Zellpellets mit PBS.

Zentrifugieren Sie dazu die Zellsuspension. Sammeln Sie den Überstand, sammeln Sie die Pellets und resuspendieren Sie das Pellet in Hepatozyten-Inkubationsmedium. Bestimmen Sie dann die Zellzahl und die Lebensfähigkeit in der resultierenden Zellsuspension mit Hilfe der Trypanblau-Färbung.

Um die nicht-parenchymalen Leberzellen zu isolieren, zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand, um die verbleibenden Erythrozyten und Hepatozyten zu eliminieren. Sammeln Sie die Überstände und zentrifugieren Sie sie zweimal, um die Zellpellets für die Sedimentation von HCS, LEC, teilweise KC und dem restlichen KC zu gewinnen. Als nächstes suspendieren Sie die Pellets wieder in HBSS. Bereiten Sie dann einen Dichtegradienten von 25 % und einen Dichtegradienten von 50 % vor, indem Sie die Dichtegradientenlösung und PBS für die Dichtegradientenzentrifugation mischen.

Legen Sie die 25%ige Dichtegradientenlösung vorsichtig auf die 50%ige Dichtegradientenlösungsschicht. Legen Sie anschließend die NPC-Suspension vorsichtig und langsam auf die 25%ige Dichtegradienten-Lösungsschicht, um eine klare Trennung beider Schichten zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension auf dem Dichtegradienten ohne Unterbrechung.

Die NPC befinden sich in der Interphase zwischen den Gradientenschichten mit 25 % und 50 % Dichte. Aspirieren Sie die abgestorbenen Zellen und Zelltrümmer aus der obersten Schicht und sammeln Sie die Zwischenphase vorsichtig. Nach der dualen Zentrifugation führen Sie eine Zellzählung für die KC- und die MPC-Fraktion durch.

Zentrifugieren Sie dann die NPC-Fraktion mit dem zuvor beschriebenen dualen Zentrifugationsschritt und resuspendieren Sie das NPC in Kupffer Cell Seeding-Medium. Die KC-haltige Fraktion bei einer Dichte von fünfmal 10 auf das 5. KC pro Quadratzentimeter auf die Kunststoff-Zellkulturgefäße aussäen. Inkubieren Sie die KC-Kulturen 20 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius 5% Kohlendioxid.

Primäres KC sollte innerhalb kurzer Zeit an den Zellkulturkunststoffen haften. Sammle dann den Überstand ein, der den nicht anhaftenden NPC enthält, der hauptsächlich aus LEC und HSC besteht. Um LEC von HSC zu trennen, beginnen Sie mit einer Zentrifugation des Überstands.

Waschen Sie dann das Pellet mit PBS. Nach der zweiten Zentrifugation werden die Zellen erneut in einem Sternzell-Endothelzelltrennmedium suspendiert und eine Zellzählung für alle verbleibenden Zellen durchgeführt. Als nächstes werden 10 Millionen Zellen in einem Milliliter Sternzell-Endothelzell-Trennmedium resuspendiert.

Fügen Sie dann 20 Mikroliter Blockierungslösung aus dem MAX-Kit und 20 Mikroliter der CD31-Mikrokügelchen für die Immunmarkierung hinzu und inkubieren Sie die resultierende Suspension 15 Minuten lang bei einer Temperatur von vier Grad Celsius. Trennen Sie anschließend LEC von HSC, wie im Herstellerprotokoll für das magnetisch aktivierte Zellsortiersystem max beschrieben, und sammeln Sie die HSC-Fraktion. Eluieren Sie die magnetisch zurückgehaltene CD31-positive LEC und suspendieren Sie sie in einem Sternzell-Endothelzellkulturmedium.

Hier zeigen diese Bilder die verschiedenen isolierten Leberzellpopulationen direkt nach dem Isolationsprozess in Phasenkontrastmikroskopie-Ansicht. Diese Reihe von Bildern zeigt die isolierten und kultivierten Zellen nach 24 Stunden Kultivierung. Die Immunfluoreszenz-basierte Charakterisierung verschiedener Zellfraktionen wird hier gezeigt.

PHH zeigte 24 Stunden nach der Isolierung positive Signale für den Hepatozytenmarker CK18, KC waren 24 Stunden nach der Isolierung positiv für den Marker CD68, LEC zeigte positive Signale für Vimentin 72 Stunden nach der Isolierung und HSC waren 72 Stunden nach der Isolierung positiv für GFAP. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass eine erfolgreiche Isolierung von einer optimalen Verdauung der Lebergewebeprobe abhängt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Aufschluss kontrollieren und wie Sie die Dichtegradiententrennung durchführen, was die kritischen Schritte dieses Verfahrens sind.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der medizinischen Forschung, um Leberfunktionen und -krankheiten in neu geschaffenen In-vitro-Zellkulturen und Tissue-Engineering-Lebermodellen zu erforschen.