Name: Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Elektrophysiologie an isolierten Hirnstamm-Rückenmarks-Präparationen neugeborener Nagetiere zur Aufzeichnung neuronaler Atemnetzwerk-Aktivität. Diese Methode ermöglicht pharmakologische Untersuchungen.

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Die Autoren danken dem Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 und der Star Foundation for Children's Health Research sowie der Molly Towell Foundation herzlich für die Bereitstellung der Forschungseinrichtung und die finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Kinkead Richard auch herzlich für das Korrekturlesen und die Beratung des Manuskripts.

Diese Methode erforderte den Einsatz von Versuchstieren, die von der Universität Laval Tierethikkommission (Protokoll # 2012-170) erlaubt. 1. Aufbau und Vorbereitung <ol><li> Lösungen <ol><li> Bereiten aCSF Stammlösungen gemäß den folgenden Rezepturen 7,17. Weitere Rezepte mit Konzentrationsschwankungen sind in der Literatur. Shop-Stammlösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat. <ol><li> Salzlösung: add 75,39 g NaCl (129 mM final); 2,5 g KCl (3,35 mM final); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g MgCl &amp; sub2; (1,15 mM final); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Man löst in 800 ml destilliertem Wasser, dann mit 1 l mit destilliertem Wasser zu füllen. </li><li> Bicarbonat-Lösung: fügen 17,65 g NaHCO 3 (21 mM final). Man löst in 900 ml destilliertem Wasser, dann auf 1 Liter mit destilliertem Wasser zu füllen. Variationen der Bicarbonat-Konzentration wird im pH-Schwankungen führen. </li><li> Glucose-Lösung: fügen 54,06g Glucose (30 mM Endkonzentration). Man löst in 400 ml destilliertem Wasser und dann auf 500 ml mit destilliertem Wasser zu füllen. </li></ol></li><li> Vorbereitung aCSF durch Verdünnen mit 100 ml Salzlösung, 100 ml Natriumbicarbonat-Lösung und 50 ml Glukoselösung in 1 l destilliertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine Glaselektrode durch Erwärmen und Strecken einer Glasröhre, bis er bricht. Sand auf der Spitze vor dem Gebrauch. Die Elektrode kann viele Zeit wiederverwendet werden, solange es sauber bleibt. </li></ol></li><li> Versuchsaufbau Hinweis: Die Setup-Details sind in Abbildung 2 dargestellt. <ol><li> Einschalten des Verstärkers, Bewegen Mittelwertbildner, Datenerfassungssystem, einem Temperaturregler und der Pumpe. Sie können die Signalverstärkung (Verstärkung = 10.000), die Filtration (niedrige Schwelle, 10 Hz; hohe Schwelle, 5 kHz) und die Abtastrate des Analog-Digital-Umwandlung des Rohsignals (2,5 kHz). </li><li> Füllen Sie eine Flasche mit aCSF und blasen es mit Carbogen (95% O 2 </sub&gt;, 5% CO 2). Induzieren eine bubbled- und erwärmten aCSF Fluss in der Aufzeichnungskammer (Volumen 5 ml) bei 4 ml / min. Halten der Temperatur in dem Aufnahmeraum auf 26 (± 1) ° C. pH-Wert sollte 7,4 in diesen Standardbedingungen ist. </li><li> Halten Sie 50 ml RT und Carbogen blasigen aCSF in einem 50-ml-Spritze in der Nähe der Dissektion Kammer. </li><li> Schalten Sie den Computer und starten Sie die Aufnahme-Software. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol><li> Wiegen und das Geschlecht des Tieres visuell zu bestimmen (Männer haben eine längere anogenitalen Abstand, während Frauen haben eine kurze anogenitalen Abstand; Männchen Genitalien sind oft dunkel, während weiblichen Genitalien sind rosa). </li><li> Betäuben die neugeborenen Nagern durch eine der folgenden Optionen: cryoanesthesia (das Tier im Eis vollständig einzutauchen für 4 - 5 min 18), Injektion (equitensine bei 4 ml / kg) 19 oder Einatmen von volatilen Anästhetika (Isofluran 20 oder Ether-21). Konfirm ein ausreichender Ebene Anästhesie durch das Fehlen einer Pfotenrückzugsreflex. </li><li> Legen Sie das Tier auf der Bank, Bauchseite nach unten. Abschnitt der rostralen Teil des Kopfes koronal mit einem Skalpell am Bregma Ebene (durch die Haut und Schädel sichtbar). Führen Sie diesen Schritt unmittelbar nach dem das Tier narkotisiert. </li><li> Abschnitt der Körper koronal mit einem Skalpell unter den vorderen Mitglieder. </li><li> Entfernen Sie Haut, Muskeln, Fettgewebe und Eingeweide mit chirurgischen und dünne Scheren und Zangen. Da die Knochen sind weich in diesem Alter, seien Sie vorsichtig, um das Nervensystem nicht beschädigen. Führen Sie diesen Schritt auf der Bank. </li><li> Legen Sie die Zubereitung in der Dissektion Kammer. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. Von diesem Punkt an das Ende der Aufzeichnung, mit einem Mikroskop. </li><li> Auf der Rückenseite der Vorbereitung, schneiden Sie den Schädel und Wirbel von der rostral zur Schwanzteil entlang der mittleren Achse mit einer chirurgischen und dünne Scheren und Zangen. Öffnen Sie die Schnitt Schädelund Wirbeln, um das Nervengewebe freizulegen. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze strored, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Mit der Zange, entfernen Sie die Arachnoidea, eine, die die Oberfläche des Nervengewebes dünne Gewebe. Bewahren Sie die Pia mater und der Blutgefäße gegenüber dem Nervengewebe. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Platzieren Sie das Präparat mit der Rückenseite nach unten, und sorgfältig bringen den Hirnstamm und Rückenmark, indem die Nerven und Bindegewebe mit der Schere, während Sie die Zubereitung vorhanden. Ein dorsalen Zugang ist ebenfalls möglich. Halten Sie die Wurzeln und Nerven so lange wie möglich. Entfernen Sie die Knochen, um den Hirnstamm und Rückenmark zu isolieren. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Entfernen Sie das Kleinhirn und Rest rostral Strukturen durch Schneiden sie mit dem Skalpell. Verwenden Sie die aCSF im Nadel gespeichert werden, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Gegebenenfalls in Abhängigkeit experimental Design, entfernen Sie die Brücke mit dem Skalpell durch einen Frontalschnitt ventral des unteren Kleinhirnarterie 22. Beachten Sie, dass das Halten der gesamten Brücke wird den Rhythmus bei Ratten zu verlangsamen und vollständig zu hemmen sie in Mäusen. Präparate, die nur das Schwanzteil der Brücke sind zeigen eine Atem-ähnliche Aktivität mit einer stabilen Frequenz am C4 Wurzel. </li></ol> 3. Aufnahme <ol><li> Legen Sie die Zubereitung in der Aufnahme Kammer, Bauchseite nach oben. Befestigen Sie die Vorbereitung mit Stiften im untersten Teil des Rückenmarks und rostral-größten Teil des Hirnstamms. </li><li> Unter Verwendung einer Spritze zu der Elektrode durch die Nadel verbunden ist, induzieren eine Vertiefung in der Elektrode (Glas Spitze einen Durchmesser von 150 bis 225 um) durch Herausziehen des Spritzenkolbens, um die Elektrode teilweise zu füllen mit aCSF. </li><li> Mit einem Mikromanipulator, vorsichtig die Elektrode in der Nähe von einer der vierten Vorderwurzeln. Andere ventralen Wurzeln könnte auch präsentieren eine Atem-ähnliche Aktivität (z.g., XII Hirnnerv, C1 ventralen Wurzel). </li><li> Induzieren eine Vertiefung in der Elektrodentank über der Spritze durch Herausziehen des Kolbens, um sanft saugen Sie den Nerven rootlet. Dann vorsichtig die Elektrode zu bewegen, um es gegen das Rückenmark an. Anmerkung: Idealerweise wird die Größe des rootlet passt die Größe der Elektrodenöffnung und schafft so eine Dichtung zwischen den inneren und äußeren Kammern der Elektrode. Da Differenzverstärker werden üblicherweise für solche Aufzeichnungen verwendet, jede Öffnung zwischen der Innenseite der Elektrode und dem Aufzeichnungsraum reduziert die Qualität des Signals und macht es schwierig, Hintergrundrauschen zu beseitigen. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. </li><li> Aufzeichnung der durch die Herstellung unter normoxischen Bedingungen hergestellt Rhythmus (dh geperlt aCSF mit Carbogen: 95% O 2 und 5% CO 2) für mindestens 20 min, um die Basislinienparameter der Zubereitung bestimmen. </li><li> Schalten Sie die Perfusion von Carbogen blasigen aCSF zuaCSF Stimulus (dh mit 95% N 2 und 5% CO 2 für Hypoxie Stimulus perlt) für 15 min. Alter Expositionsdauer in Abhängigkeit der Versuchsprotokoll. Notieren Sie sich die Expositionsdauer auf das Aufzeichnungs und Tier Datenblatt. Verwenden Edelstahlrohre zwischen aCSF Flasche und der Kammer, wenn möglich, Gasdiffusion zu der Außenseite des Rohres zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie die Durchblutung wieder in Standard Carbogen blasigen aCSF für mindestens 15 Minuten auf eine Erholung Aufnahme. Nehmen Sie diese auf dem Aufzeichnungs und Tier Datenblatt. </li><li> Beenden Sie die Aufnahme. </li></ol> 4. Statistische Analyse <ol><li> Aus dem integrierten Signal, die Berechnung der Frequenz wie die Anzahl der Bursts pro Minute (in Bursts / min ausgedrückt wird), die Amplitude der Differenz zwischen dem Ausgangswert und der Spitze des Bursts (in mV), die Burstdauer als die Dauer von Anfang bis zum Ende des Bursts (ausgedrückt in s), die Burst-Fläche wie die Fläche unter der curve des Bursts auf dem integrierten Signal (in mV · s) (Abbildung 3). </li><li> Berechnen Sie die Frequenz, Amplitude, Burstdauer und Burst-Bereich unter normoxischen (Baseline), hypoxische (Stimulus) und Post-hypoxischen (post-Stimulus) Erholung Bedingungen wie der Durchschnitt der letzten 5 Minuten der Aufnahmen für jede Bedingung. Analyse nicht den ersten Abschnitt einer jeden Zustand, da es eine Verzögerung zwischen dem Einschalten der Perfusion und aCSF Homogenisierung im Aufnahmeraum. </li><li> Express dann Stimulus (dh Hypoxie) und Post-Stimulus (dh post-hypoxischen) Recovery-Werte als Prozentsatz der Baseline-Werte für die entsprechende Aufnahme. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte offenzulegen.

Genaue Quantifizierung der Atmungsaktivität kann eine Herausforderung sein. In der Tat ist die Atmung eine Funktion, die automatische und freiwillig sein kann, und das ist entsprechend der Umgebung, die Bedürfnisse des Körpers, den emotionalen Zustand und das Verhalten moduliert. Der Vorteil dieser Technik ist die Isolierung von den neuronalen Elementen zur Erzeugung des Atembefehl verantwortlich. Somit elektrophysiologische Aufzeichnungen von Hirnstamm-Rückenmarkspräparaten und Plethysmographie komplementäre Techniken,...

Die Atmung ist eine komplexe und Lebenstätigkeit vom Gehirn gesteuert, so dass Disauerstoff (O 2) Aufnahme und Kohlendioxid (CO 2) Beseitigung. Der zentraler Atemantrieb wird durch ein komplexes Netzwerk im Hirnstamm sowohl in Säugetieren als 1 liegt, Amphibien 2, Reptilien 3, 4 Vögel und Fische 5 generiert. Auch wenn die Untersuchung der Atmung kann in vivo verarbeitet werden, präzise mechanistische Untersuchungen erfordern einen direkten Zugang zu dem Atemsteuerungsnetz. Hierzu Adrian und Buytendijk entwickelt eine reduzierte Goldfischzubereitung, bei dem Elektroden auf der Hirnoberfläche aktenkundig den erzeugten Rhythmuskiemen Belüftung 5 verbunden. Dieser Ansatz wurde später von Suzue 1984 6 zur Verwendung bei neugeborenen Nagern angepasst. Das Aufkommen dieser Zubereitung zu erheblichen Fortschritten in der Atem Neurobiologie geführt. Da es relativ einfach ist, hat die Technik here zugänglich ist eine breite Palette von Grundlagenuntersuchungen der rhythmische motorische Verhaltensweisen und ihren Ursprung in der neugeborenen Nagern. Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, das neuronale Korrelat inspiratorischen Aktivität aufzuzeichnen, eine Atemwegsartigen Rhythmus genannte fiktive Atmung, ausgelöst durch den Atem Netzwerk hergestellt. Dieses Verfahren kann in einem breiten Spektrum von Forschungsziele eingesetzt werden, Targeting Inspirations antwortet Atemschwankungen oder Pharmakologie in beiden Wildtyp 7 und 8 transgenen Tieren. Da die Versuche werden bei einer niedrigen Temperatur durchgeführt wird, ohne afferenten Neuronen, und unter Bedingungen, bei denen die Konzentrationen von Glucose und O 2 in der aCSF hoch sind Fragen aufgeworfen über die physiologische Bedeutung des aufgezeichneten Signals. Zwar gibt es deutliche Unterschiede zwischen den in-vivo- und in-vitro-Bedingungen (z. B. die Frequenz des inspiratorischen Bursts) bleibt die Tatsache, dass das Vorhandensein vondie Kernelemente der Atemnetz 6 ist es möglich, eine robuste Rhythmus zu einer lebenswichtigen homöostatischen Funktion 9,10 assoziiert zu studieren. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung und der Einsatz dieser Technik ist es, einen direkten Zugang zum Hirnstamm Elemente des Atem Netzwerk, das in vivo schwer zugänglich sind, insbesondere bei Neugeborenen zu erleichtern. Der Hirnstamm unter streng kontrollierten Bedingungen ausgesetzt: das aufgezeichnete Rhythmus nicht von peripheren afferenten Inputs der Lunge oder der Halsschlagkörpern moduliert, so dass die Untersuchung auf den zentralen Atemantrieb selbst 11 konzentrieren. Somit ist dieser Zugang genutzt, um Reize gelten und notieren Sie die Ausgangssignal. Im Gegensatz zu Aufzeichnungen Plethysmographie wird der Atemrhythmus durch alle ihre Komponenten im ganzen Körper moduliert (z. B. Lungendehnung, periphere Chemosensoren) und macht es schwierig, eine genaue Stimuli anzuwenden. In einem (newborn Ratte, das Protokoll aus der Aufzeichnung der vierten ventralen Wurzel Signal auf einem isolierten Hirnstamm und ein verkürztes Rückenmark, in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) gehalten. Die von Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen erzeugten Rhythmus der einzelnen langsamen Bursts, die auf der Inspirationssignal 9 verknüpft sind. Isolated Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen sind leicht bei Ratten bespielbar von postnatalen Tag 0-4 (P0 - P4) 7. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die hypoxische Reaktion der Atem Netzwerk und auch die Antwort auf Hyperkapnie, Azidose oder Arzneimittel zu bewerten. Eine akute Hypoxie Protokoll wird hier vorgestellt. Diese Stimulation wird durch Entnahme von O 2 in der aCSF erhalten; Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die Toleranz und Ansprechbarkeit auf hypoxische Beleidigungen beurteilen. Das Protokoll verursacht eine Rhythmus Vertiefung von der ersten Minute, bis zum Ende der Belichtung Hypoxie (1) 12. Diese Vertiefung wird umgekehrtwährend der post-hypoxischen Recovery 12. Bezüglich der Versuchsanordnung ist es wichtig, zu bemerken, daß die Brücke, an der rostralen Teil der Hirnstamm, eine hemmende Wirkung auf den Rhythmusgenerator 8. So Zubereitungen der volle Hirnstamm und Rückenmark rostral zeigen eine geringere Rhythmus. Einbeziehung der Brücke in der isolierten Probe auf die Aufzeichnung wird entsprechend dem Ziel des Experiments 13 bestimmt wird; das Studium der pontine Einfluss auf das verlängerte Mark Netz erfordern würde Aufnahmen mit und ohne die Brücke, um die Ergebnisse 14 zu vergleichen. Außerdem ist einer der Vorteile dieser Technik die Möglichkeit einer Ausdehnung des rostralen Teil der Vorbereitung auf Mesencephalon-und / oder Zwischenhirnregionen 15,16 umfassen, die es ermöglicht, die Wirkung dieser Regionen auf dem ponto-medullären Atemnetz bewerten.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Verwendung unter der Haube</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Saugelektrode</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>Modell 573000</td><td></td></tr><tr><td>Differenz-AC-Verstärker</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>Modell 1700</td><td></td></tr><tr><td>Gleitender Mittelwert</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>Modell MA-821</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td><td>Modell DI-720</td><td></td></tr><tr><td>LabChart Software</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism sofware</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierkammer</td><td>Kunststoffbox (z. B. Petribox) wird machen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Hausgemachte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basis</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB Peristaltic</td><td></td></tr><tr><td>pump</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Hausgemachter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektrophysiologie auf isolierte hirnstamm-rückenmarks zubereitungen aus newborn nagetiere ermöglicht neural atem netzwerk output recording

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Obwohl bekannt ist, dass der zentrale Atemantrieb im Hirnstamm lokalisiert ist, müssen einige Aspekte seiner grundlegenden Funktion, Entwicklung und Reaktion auf Reize noch vollständig verstanden werden. Um die Schwierigkeit des Zugangs zum Hirnstamm beim gesamten Tier zu überwinden, wird eine Isolierung des Hirnstamms und eines Teils des Rückenmarks durchgeführt. Dieses Präparat wird in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit aufbewahrt, in der Gase, Konzentrationen und Temperaturen kontrolliert und überwacht werden. Das Ausgangssignal des Atmungsnetzes wird durch eine Saugelektrode aufgezeichnet, die an der vierten ventralen Wurzel platziert wird. Auf diese Weise können Reize direkt auf den Hirnstamm aufgebracht und die Wirkung direkt aufgezeichnet werden. Das aufgezeichnete Signal ist mit dem inspiratorischen Signal verknüpft, das über den Nervus phrenicus an das Zwerchfell gesendet wird, und kann als Bursts (ca. 8 Bursts pro Minute) beschrieben werden. Die Analyse dieser Bursts (Frequenz, Amplitude, Länge und Fläche unter der Kurve) ermöglicht eine genaue Charakterisierung der Stimuluswirkung auf das Atmungsnetzwerk. Die Haupteinschränkung dieser Methode ist die Durchführbarkeit des Präparats über die frühen postnatalen Stadien hinaus. Daher konzentriert sich diese Methode stark auf die Untersuchung des gesamten Netzwerks ohne die peripheren Eingaben bei der neugeborenen Ratte.

Wie in der Einleitung erwähnt, ist einer der wichtigsten Vorteile dieser Technik die direkten Zugang zum Hirnstamm verschiedene Stimuli anzuwenden. Als Beispiel wurde hier Hypoxie aufgetragen. Abbildung 1. AB zeigt eine vollständige Protokollaufzeichnung, mit beiden normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Abbildung 1.CE zeigt den Rhythmus in normoxischen Bedingungen (dh aufgezeichnet, sprudelte aCSF mit 95% O 2 und 5% CO 2 bei 26 ° C). Wie zuvor in diesem genauen Z...

Der zentrale Atemantrieb befindet sich im Hirnstamm. Die spontane respiratorische Leistung aus einem isolierten Hirnstamm-Rückenmark wird aufgezeichnet, indem eine Elektrode an der vierten ventralen Wurzel platziert wird. Dieser experimentelle Ansatz ist wertvoll für pharmakologische Untersuchungen oder die Beurteilung von respiratorischen Herausforderungen und genetischen Manipulationen des rhythmischen motorischen Verhaltens.

Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Rhythmus aufzuzeichnen, der von den Atemkernen im Hirnstamm in Abwesenheit peripherer E unter verschiedenen Bedingungen erzeugt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst der Nacken und der obere Rücken der Ratte, an denen sich der Hirnstamm befindet, entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Nervensystem zu isolieren und die Schädel- sowie Wirbelknochen zu entfernen.Als Nächstes platzieren Sie die Elektrode am vierten ventralen Nervenwurzelast und beginnen mit der Aufzeichnung. Letztendlich dienen elektrophysiologische Ableitungen am isolierten Hirnstamm und Rückenmark dazu, den Rhythmus darzustellen, der vom Hirnstamm als Reaktion auf verschiedene Reize erzeugt wird.Mit dieser Methode kann eine zentrale Frage im Bereich der Atmungsforschung beantwortet werden, beispielsweise, ob das Molekül an der Rhythmik beteiligt ist. Die Erzeugung von R-Kontrollen zeigt, welchen Effekt das medizinische Ende auf das Atemzentrum hat. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine anästhetisierte neugeborene Ratte auf eine Schale legen.Entfernen Sie sofort die rostrale Seite des Kopfes auf Höhe des bgma koronal mit einem Skalpell. Entfernen Sie anschließend den Körper unterhalb der vorderen Gliedmaßen koronal. Danach entfernen Sie die Hautmuskulatur und das Fettgewebe über dem Schädel.Anschließend entfernen Sie die viskose Flüssigkeit und achten Sie darauf, das Nervensystem nicht zu beschädigen. Danach überführen Sie die Präparation in die Präparationskammer. Stellen Sie die Präparationskammer unter das Mikroskop.Tragen Sie anschließend das oxygenierte A-CSF mit einer Spritze auf, um die Präparation auf der dorsalen Seite zu oxygenieren. Schneiden Sie den Schädel entlang der Mittelachse und öffnen Sie ihn, um das Nervengewebe freizulegen. Führen Sie das gleiche Verfahren für die Wirbel durch.Tragen Sie dann das oxygenierte ACSF auf, um das Präparat zu oxygenieren. Positionieren Sie anschließend das Präparat mit der dorsalen Seite nach unten. Isolieren Sie vorsichtig Gehirn, Stamm und Rückenmark, indem Sie die Nerven und das Bindegewebe durchtrennen, während Sie das Präparat an Ort und Stelle halten.Entfernen Sie dann das Kleinhirn und die verbleibenden rostralen Strukturen. Geben Sie das oxygenierte A-CSF auf das Präparat. Legen Sie bei diesem Verfahren das Nervengewebe mit seiner ventralen Seite nach oben in die Ableitungskammer. Befestigen Sie es mit Nadeln im untersten Teil des Rückenmarks und im am weitesten rostral gelegenen Teil des Hirnstamms.Danach entfernen Sie die Arachnoidea, eine dünne Membran, die die Oberfläche des Nervengewebes bedeckt. Achten Sie darauf, die Pia mater und die Blutgefäße des Nervengewebes nicht zu beschädigen. Füllen Sie danach die Elektrode mit A CSF.Platzieren Sie mithilfe eines Mikromanipulators die Elektrode vorsichtig in der Nähe der vierten ventralen Wurzel. Aspirieren Sie behutsam das Nervenwurzelchen mit der Spritze. Bringen Sie anschließend die Elektrode mit dem Nervenwurzelchen gegen das Rückenmark an.Zeichnen Sie anschließend die von dem Nervengewebe unter normoxischen Bedingungen erzeugten elektrophysiologischen Aktivitäten mindestens 20 Minuten lang auf. Um die Basisparameter der Präparation zu bestimmen, wechseln Sie die Perfusionslösung von carbogengebutterter A-CSF zu hypoxischer Stimulus-A-CSF und nehmen Sie 15 Minuten lang auf. Danach wechseln Sie die Perfusionslösung wieder zurück zur Standard-Carbogenlösung.Blasen Sie die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und nehmen Sie mindestens weitere 15 Minuten lang auf, bevor die Aufzeichnung beendet wird. Hier sind die Atemausgaben, die vom C4-Ventralwurzel des Gehirnstamm-Rückenmark-Präparats einer P4-Ratte unter normoxischen, hypoxischen und posthypoxischen Erholungsbedingungen aufgezeichnet wurden. Dies ist das integrierte Signal und dies ist das Rohsignal.Und hier sind die vergrößerten Aufnahmen und die einzelnen Burst-Aktivitäten für jede Bedingung nach der Entwicklung. Diese Methode eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Atmung den Weg, um die neuronalen Gruppen und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an der Atemregulation und -erzeugung bei Neugeborenen beteiligt sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Demonstration der Isolierung von Neugeborenen Maus Rückenmark für elektrophysiologische Untersuchungen.

Spinal Cord Elektrophysiologie

Eine Demonstration der Herstellung und Verwendung einer extrazellulären Saugelektrode zur elektrophysiologischen Ableitungen von Neugeborenen Nagetier Rückenmark...

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Dieses Video zeigt elektrophysiologische Aufzeichnungen von isolierten Hirnstamm-Rückenmark-Präparaten von neugeborenen Nagetieren. Das Präparat wird in eine Aufnahmekammer gegeben, und die inspiratorischen Ausbrüche aus dem Hirnstamm werden unter sauerstoffreichen und sauerstoffarmen Bedingungen unter Verwendung der vierten ventralen Nervenwurzel im Rückenmark aufgezeichnet.

Elektrophysiologische Ableitungen von Hirnstamm-Rückenmark-Präparaten eines neugeborenen Nagetiers

Ein chirurgisches Verfahren beschrieben, um die Schädel im ventralen Neugeborene Ratten aus. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine Kraniotomie, um akute Elektrophysiologie und der Zwei-Photonen-Mikroskopie Experimente im Hirnstamm von betäubten Jungtiere durchführen zu öffnen.

Eine Methode, um eine Kraniotomie auf der Bauch Schädel des Neugeborenen Nagetiere Stellen

Dieses Verfahren führt langanhaltende in vivo intrazelluläre Aufnahmen von einzelnen Neuronen während physiologisch relevanten Hirnzustände und nach der vollständigen Abschaffung der laufenden elektrischen Aktivitäten, in einem isoelektrischen Zustand des Gehirns führt. Die physiologischen Konstanten des Tieres während des Übergangs zur künstlichen komatösen Zustand sorgfältig überwacht.

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung<em&gt; In Vivo</em

Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Hier stellen wir eine neuartige Technik vor, die für die Aufzeichnung der Elektroenzephalographie (EEG) in frei bewegten neonatalen epileptischen Welpen und deren Beschreibung, Funktionen und Anwendungen entwickelt wurde. Diese Methode erlaubt es, EEG für mehr als 1 Woche aufzunehmen.

Aufzeichnung von EEG in frei bewegten neonatalen Ratten mit einer neuartigen Methode

In dieser Studie wird die Methodik vorgestellt, wie man mehrfache in vivo elektrophysiologische Aufnahmen aus dem hyperdirekten Weg unter Urethananästhesie durchführt.

Akut<em&gt; In vivo</em&gt; Elektrophysiologische Aufzeichnungen von lokalen Feldpotentialen und Multi-Unit-Aktivitäten von der Hyperdirect-Pathway in anästhesierten Ratten

Diese Studie stellt eine Methode für die gleichzeitige Aufzeichnung von lokales Feld Potenziale im Gehirn, EKG, Elektromyogrammen und Signale einer frei beweglichen Ratte zu atmen. Diese Technik, die experimentelle Kosten reduziert und vereinfacht die Analyse der Daten, wird zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Gehirn und periphere Organe beitragen.

Gleichzeitige Aufnahmen der kortikalen lokales Feld Potentiale, Elektrokardiogramm, Elektromyogramm und Atemrhythmus aus einem frei beweglichen Ratte

Dieses Protokoll sowohl visuell kommuniziert die Hirnstamm Rückenmark Vorbereitung und klärt die Vorbereitung der Hirnstamm quer Scheiben in umfassender Weise Schritt für Schritt. Es wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erlangung lebensfähiger, lang anhaltender, rhythmisch aktiv Scheiben für die Aufzeichnung von neuronalen Ausgang aus der Atemwege Regionen der Hirnstamm.

Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um in vivo Einzelneuronen-Aufzeichnungen mit hoher Dichte aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Dieser Ansatz wird eingesetzt, um das Aktionspotentialfeuer von Neuronen im ventrolateralen periaquäduktalen Grau - einer Hirnstammregion, die während des REM-Schlafs (Rapid Eye Movement) inaktiv ist - vor und während der Vollnarkose zu messen.

Akute Einzel-Multi-Elektroden-Ableitungen aus dem Hirnstamm von Mäusen mit fixiertem Kopf

Erfahren Sie die Elektrophysiologie an isolierten Hirnstamm-Rückenmarks-Präparationen neugeborener Nagetiere zur Aufzeichnung neuronaler Atemnetzwerk-Aktivität. Diese Methode ermöglicht pharmakologische Untersuchungen.

Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording (Video) | JoVE Journal

Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording

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