Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten, Endothelzellen und Thrombozytenleukozyten während der Entzündung in vivo zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Maus mit den interessierenden Substanzen vorbehandelt und die Blutzellen als Ileumschleife markiert werden, und dann die begleitenden mesentaren Gefäße exteriorisiert werden und die STO-Zellinteraktionen, die innerhalb einer ausgewählten mesentaren Vene stattfinden, durch intravitale Mikroskopie abgebildet werden. Letztendlich können die Wechselwirkungen zwischen den Leukozyten und den Blutplättchen mit dem Endothel oder untereinander analysiert werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entzündung zu beantworten, z. B. welche Arten von Leukozyten-, Endothel- oder Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen in vivo während verschiedener Entzündungsmodelle oder nach verschiedenen Vorbehandlungen von Interesse auftreten. Vier Stunden vor der intravitalen Bildgebung injizieren Sie 20 Milligramm pro Kilogramm LPS IP in eine 16 bis 20 Gramm schwere, vier bis sechs Wochen alte männliche Maus, um die vorgetäuschte bakterielle Entzündungsreaktion auszulösen. Erwärmen Sie auch zu diesem Zeitpunkt eine 0,9%ige Kochsalzlösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad, um die Kunststoffkammer und das Mesentärgewebe zu befeuchten.

Als nächstes bestätigen Sie die angemessene Anästhesietiefe, indem Sie bei der mit LPS behandelten Maus nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, und tragen Sie dann Salbe auf die Tiergröße auf, bestimmen Sie den Bauch mit einem Rasierer und entfernen Sie alle losen Haare mit 70% Ethanol-getränkter Gaze. Verwenden Sie dann eine kleine gebogene Pinzette und eine Schere, um den Bauch zu öffnen, identifizieren Sie die epigastrischen Gefäße und öffnen Sie das Bauchfell in der linearen Alba-Region, um die Gefäße zu schützen. Tragen Sie ein paar Tropfen vorwarme Kochsalzlösung in die Bauchhöhle auf, um das Gewebe feucht zu halten, gefolgt von einer retroorbitalen Injektion von 50 Mikrolitern Stäbchen Domine sechs G, um die zirkulierenden Blutzellen zu markieren.

Legen Sie dann die Maus in eine 10 Zentimeter große Petrischale, entfernen Sie eine Schleife aus Illium und verabreichen Sie die vorwarme Kochsalzlösung alle zwei Minuten, um das Gewebe feucht zu halten. Um die Entzündungsreaktion intravitalmikroskopisch sichtbar zu machen, platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop und bringen Sie eine Mesentärvene mit einem Durchmesser von 200 bis 300 Mikrometern und so wenig sichtbarem umgebendem Fett wie möglich ins Blickfeld. Mit der entsprechenden Mikroskopsoftware.

Zeichnen Sie die endothelialen Wechselwirkungen der Blutzellen eine Minute lang in vier verschiedenen Venen pro Maus auf. Analysieren Sie dann die Zell-zu-Zell-Reaktionen, um die Stabilität zu bestätigen und individuelle Blutflussbedingungen einzugeben. Um die Anzahl der rollenden Leukozyten zu quantifizieren, ziehen Sie eine vertikale Linie durch die Vene und zählen Sie manuell alle Leukozyten, die diese Linie in einer Minute überqueren.

Um die Rollgeschwindigkeit zu bestimmen, ziehen Sie zwei vertikale Linien im Abstand von 50 Mikrometern durch die Vene und messen Sie die Zeit, die ein einzelner Leukozyt benötigt, um die Linien zu überqueren, während er stabil auf dem Endothel rollt. Um die Leukozytenadhäsion zu messen, zeichnen Sie ein 200 x 200 Mikrometer großes Quadrat in die Vene. Zählen Sie dann manuell die fest anhaftenden Leukozyten, die 30 Sekunden lang keine sichtbare Bewegung innerhalb des Quadrats aufweisen.

Um die Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu quantifizieren, wird schließlich manuell die Anzahl der an einen Leukozyten gebundenen Blutplättchen gezählt. Obwohl es bei unbehandelten Tieren aufgrund des Eingriffs selbst zu einer gewissen Aktivierung kommt, gibt es fast kein langsames Rollen oder eine feste Adhäsion von unbehandelten Leukozyten. Tatsächlich wird eine höhere Anzahl von rollenden und adhärenten Leukozyten mit einer Abnahme der Rollgeschwindigkeit der zirkulierenden Blutzellen bei LPS-herausgeforderten Mäusen beobachtet.

In diesem Experiment wurde die intravitale Mikroskopie ohne weitere LPS-Provokation unmittelbar nach akuter intraperitonealer Behandlung mit Fluoxetin durchgeführt. Es ist zu beachten, dass die höhere Anzahl fest adhärenter Leukozyten und die niedrigeren Rollgeschwindigkeiten bei den mit Fluoxetin behandelten Tieren auf einen Einfluss der akuten Fluoxetin-Behandlung auf die Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen hinweisen. Des Weiteren kann, wie in diesem repräsentativen Bild der Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen mit einer Mesenterialvene während einer LPS-induzierten Peritonitis beobachtet wird, eine Färbung der Blutplättchen um die Leukozyten sowie die Wechselwirkungen dieser Komplexe mit der Gefäßwand beobachtet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Inalmikroskopie durchführen, um Leukozyten-, Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu untersuchen.