Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Die allgemeinen Ziele der folgenden Experimente bestehen darin, die Wirkungen von NTBC auf die Produktion von P. mein und die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress sowie die minimalen Hemmkonzentrationen von Antibiotika, also die Mics, zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem NTBC Bakterienkulturen zugesetzt wird, um die Konzentration zu ermitteln, die die Produktion von p Melanin verringert, was der zweite Schritt ist. Bakterienkulturen werden mit NTBC und Antibiotika behandelt, wodurch der Anwender feststellen kann, ob die Behandlung mit NTBC einen Einfluss auf die minimalen Hemmkonzentrationen der Antibiotika (Mics) hat.

Kulturen, die mit NTPC behandelt wurden, werden anschließend Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress nach NTPC-Behandlung zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung genischer Bakterien mit NTPC zu einer Verringerung der Pigmentproduktion führt und gleichzeitig die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress erhöht, während keine Wirkung auf den antibiotischen MIC-Wert festzustellen ist, basierend jeweils auf Spot-Platten zur Beurteilung der Antwort auf oxidativen Stress und mikrotiterplattenbasierten MIC-Assays. Der Hauptvorteil der Oxidativer-Stress-Spot-Platten-Technik gegenüber etablierten Methoden wie Keimzahlermittlung oder Scheiben-Diffusions-Assays besteht darin, dass niedrigere Konzentrationen an Wasserstoffperoxid verwendet werden können, im Gegensatz zu den hohen Konzentrationen, die bei anderen Assays notwendig sind. In der Regel haben Personen, die neu in unserer Methode zur Bestimmung von antibiotischen MIC-Werten sind, Schwierigkeiten, da eine ungenaue Pipettier-Technik die Variabilität zwischen den Wiederholungen erhöht.

Diese Variabilität kann es schwierig machen, den Wirkstoff genau zu bestimmen. MIC Einen Tag vor dem MIC-Assay. Bereiten Sie Kulturen der zu testenden Stämme in LB mit und ohne vor.

Zwei zwei Nitro, vier Trior Ethylbenzoyl ein drei Cyclohexan-Dion oder NTBC. Diese Demonstration verwendet eine repräsentative Konzentration von 300 Mikromolar NTBC. Die Titrationmethode zur Bestimmung der geeigneten Konzentration von NTBC ist im Protokolltext beschrieben: Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung am folgenden Tag.

Stellen Sie LB mit NTBC und LB mit DMSO als Stammlösungen für den MIC-Test her, um ein Antibiotikum an einem Stamm zu testen, wobei 600 Mikromolar NTBC zu zwei Millilitern LB gegeben und gemischt werden. Zur Herstellung der NTBC-Stammlösung: NTBC wird in einer Konzentration von 600 Mikromolar zugegeben, da es verdünnt wird, wenn der Inokulum hinzugefügt wird.

Um eine Endkonzentration von 300 Mikromolar zu erreichen, geben Sie ein äquivalentes Volumen des Fahrzeugs DMSO zu zwei Millilitern LB hinzu und mischen Sie, um die NO-NTBC-Masterlösung herzustellen. Diese beiden Masterlösungen werden verwendet, um Antibiotikastammlösungen herzustellen sowie um die Verdünnungsreihen in 96-Well-Platten aufzusetzen. Bereiten Sie anschließend die Antibiotikalösungen in den LB-plus-NTBC- oder LB-plus-DMSO-Masterlösungen vor.

Stellen Sie die Gentamycin-Plus-oder-Minus-NTBC-Stammlösung bei 64 Mikrogramm pro Milliliter her. Bereiten Sie die Kanamycin-Plus-oder-Minus-NTBC-Stammlösung bei 256 Mikrogramm pro Milliliter vor. Bereiten Sie die Tobramycin-Plus-oder-Minus-NTB-Stammlösung bei acht Mikrogramm pro Milliliter vor.

Nachdem die beiden Antibiotikalösungen hergestellt wurden, je 100 Mikroliter jeder Antibiotikalösung in vier Vertiefungen einer 96-Loch-Platte in Reihe A geben. Zum Beispiel sollte Gentamicin in A1 bis A4, Kanamycin in A5 bis A8 und Tobramycin in A9 bis A12 gegeben werden. 50 Mikroliter der LB-plus-NTBC- oder LB-plus-DMSO-Masterlösung zu den Reihen B bis H der 96-Loch-Platte hinzufügen; sicherstellen, dass eine Platte LB plus NTBC und eine Platte LB plus DMSO enthält. Mit einem Mikropipettiergerät zweifache serielle Verdünnungen der Antibiotika durchführen, indem 50 Mikroliter der Lösung von Reihe A nach Reihe B übertragen werden. Die Lösung mischen, die Pipettenspitzen wechseln und 50 Mikroliter der Lösung von Reihe B nach Reihe C übertragen. Dies für die verbleibenden Reihen wiederholen, nachdem Reihe G verdünnt wurde. 50 Mikroliter der Lösung aus dieser Reihe entfernen und verwerfen.

Verwenden Sie Reihe H als Kontrolle ohne Antibiotikum für das bakterielle Wachstum. Entnehmen Sie die Übernachtkulturen, nachdem Sie alle Kulturen gewaschen haben, um Lanin im Medium zu entfernen, messen Sie den OD 600 der Kulturen und verdünnen Sie die Übernachtkulturen in LB unter Verwendung eines Mehrkanal-Mikropipettiersystems.

Fügen Sie 50 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur in die entsprechenden Vertiefungen hinzu. Geben Sie Bakterien in drei Vertiefungen für jeden Stamm und jede Antibiotikakonzentration. Fügen Sie 50 Mikroliter LB in die vierte Vertiefung hinzu, um als Kontrolle für bakterielle Kontamination zu dienen.

Bedecken Sie die 96-Well-Platten mit Perfil und inkubieren Sie sie am folgenden Tag etwa 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Platten visuell auf bakterielles Wachstum in den Vertiefungen. Die MIC ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums, bei der für alle drei Wiederholungen jedes Stammes kein bakterielles Wachstum zu erkennen ist.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie Übernachtkulturen der zu testenden Stämme in LB mit und ohne NTBC wie am folgenden Tag zuvor gezeigt vor. Bereiten Sie LB-APLs mit Wasserstoffperoxid als oxidativen Stressor vor. Erwärmen Sie zunächst die LB-Agarflaschen zum Schmelzen und kühlen Sie das Medium auf etwa 50 Grad Celsius bei Raumtemperatur ab.

Fügen Sie anschließend Wasserstoffperoxid direkt in das abgekühlte Medium in den gewünschten Konzentrationen hinzu. Schwenken Sie den Kolben, um eine Reihe von Wasserstoffperoxid-Konzentrationen von null bis eins Millimolar zu mischen, was ein guter Ausgangspunkt ist.

Gießen Sie die Platten sofort ein und flammen Sie die Oberfläche ab, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt vier Platten pro 100 Milliliter LB-Agar. Kennzeichnen Sie die Platten mit der Wasserstoffperoxidkonzentration.

Stellen Sie die Platten unbedeckt in eine biologische Sicherheitswerkbank mit laufendem Gebläse für 30 Minuten, um überschüssige Feuchtigkeit aus den Platten zu entfernen. Die Platten sollten am selben Tag verwendet werden. Während die Platten trocknen, werden sie vorbereitet, gewaschen und vermessen.

Der OD 600 der Übernachtkulturen wird normalisiert, indem der OD 600 aller Übernachtkulturen auf den niedrigsten Wert der getesteten Stämme eingestellt wird. Dazu bestimmen Sie das Volumen an Kultur, das benötigt wird, um die Kultur auf den niedrigsten OD 600 in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter zu verdünnen. Wenn beispielsweise eine Kultur einen OD 600 von drei aufweist und der niedrigste OD 600 der Stämme 2,5 beträgt, führen Sie die folgende Berechnung durch, die 0,833 Milliliter als erforderliches Kulturvolumen ergibt. Geben Sie 0,833 Milliliter Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Berechnen Sie anschließend die Menge an LB plus NTBC oder LB plus DMSO, die benötigt wird, um das Kulturvolumen auf einen Milliliter aufzufüllen. In diesem Beispiel wären das 0,167 Milliliter. Vortexen Sie die Mischung, um die Kulturen in einer konstanten Konzentration an NTBC oder DMSO zu halten. Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der normalisierten Übernachtkulturen in PBS plus NTBC oder PBS plus DMSO durch. Stellen Sie Stammlösungen von PBS plus NTBC und PBS plus DMSO her, und skalieren Sie diese je nach Anzahl der zu testenden Stämme entsprechend hoch oder herunter. Für einen Satz Verdünnungen pro Stamm mischen Sie 300 Mikromolar NTBC oder ein äquivalentes Volumen DMSO mit PBS, sodass ein Gesamtvolumen von 720 Mikrolitern entsteht. Geben Sie 90 Mikroliter PBS plus NTBC oder PBS plus DMSO in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen, die für die seriellen Verdünnungen von 10⁻¹ bis 10⁻⁷ beschriftet sind.

Geben Sie 10 Mikroliter Kultur in das entsprechende Verdünnungsrohr für die 10 hoch minus eins-Verdünnung, mischen Sie durch Vortexen und übertragen Sie 10 Mikroliter der 10 hoch minus eins-Verdünnung in das 10 hoch minus zwei-Verdünnungsrohr. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Verdünnungen und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Verdünnungen durchgeführt wurden. Geben Sie jeweils fünf Mikroliter der 10 hoch minus drei- bis 10 hoch minus sieben-Verdünnung dupliziert auf LV-Platten mit Wasserstoffperoxid.

Verwenden Sie für jeden Stamm eine eigene Pipettenspitze. Wenn die Proben von der am stärksten verdünnten zur am wenigsten verdünnten Konzentration aufgebracht werden, kippen oder neigen Sie die Platte nicht, bis die Flüssigkeit vollständig in die Platte eingezogen ist. Inkubieren Sie die Platten je nach Stamm 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Sobald Kolonien guter Größe erschienen sind, fotografieren Sie die Platten mit einer CCD-Kamera über einem Transilluminator. NTBC-Titrationen wurden verwendet, um zu bestimmen, ob NTBC die p-Melaninproduktion in p aerogen reduzieren konnte, und um die Konzentration von NTBC zu identifizieren, die die p-Melaninproduktion eliminiert oder reduziert, für den Einsatz in weiteren Assays, wie hier gezeigt. NTBC reduzierte die PY-Melaninproduktion dosisabhängig in p-Melanin-bildenden Stämmen, hatte jedoch keinen Effekt auf die Pigmentproduktion in Stämmen, die kein p-Melanin produzieren.

Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse des MIC-Tests für verschiedene *P. aeruginosa*-Stämme, die mit und ohne NTBC sowie verschiedenen Antibiotika behandelt wurden. Die MICs wurden als die niedrigste Konzentration des Antibiotikums erfasst, die das bakterielle Wachstum hemmte. Die Behandlung mit NDBC hatte keinen Einfluss auf die MICs der getesteten Stämme gegenüber den Antibiotika. Ein Spot-Platten-Assay zur Überprüfung der oxidativen Stressantwort wurde mit *P. aeruginosa*-Melanin-bildenden und nicht Melanin-bildenden Stämmen durchgeführt, die mit und ohne NDBC behandelt wurden.

Die Platte mit null Millimolar Wasserstoffperoxid zeigte, dass alle Stämme korrekt verdünnt wurden, und es wurde eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress beobachtet, wenn PIO-Melanin produzierende Bakterien mit NTBC behandelt wurden. Stämme, die kein PIO-Melanin produzieren, waren empfindlicher gegenüber oxidativem Stress als Stämme, die p-Melanin produzieren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Auswirkungen der NTBC-Behandlung auf die PIO-Melanin-Produktion untersucht, indem man die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress und Antibiotika-MICs testet.