Name: Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie, wie NTBC die bakterielle Pyomelanin-Produktion hemmt und die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress erhöht. Diese Methode nutzt Wasserstoffperoxid-Spot-Plates und Mikrotiter-MIC-Tests.

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Die Autoren danken Dara Frank und Carrie Harwood für ihre großzügige Spende von Stämmen. Die Milwaukee Research Foundation der University of Wisconsin hält das Patent Nr. 8,354,451; mit Ansprüchen, die allgemein auf die Behandlung oder Hemmung des Fortschreitens der Infektion eines Mikroorganismus bei einem Patienten durch Verabreichung einer 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase-hemmenden Verbindung, wie z. B. 2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC), gerichtet sind. Erfinder sind Graham Moran und Pang He. Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health (R00-GM083147) unterstützt. Die P. aeruginosa-Transposon-Mutantenbibliothek der University of Washington wird vom NIH P30 DK089507 unterstützt.

1. Herstellung von Kulturmedien, Antibiotika, und 2- [2-Nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexandion (NTBC) <ol><li> Machen LB-Brühe (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl in H 2 O) und Aliquot in angemessenen Mengen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Auf 100 ml LB-Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, 1,5% Agar in H 2 O) in 250 ml-Kolben. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Stellen Sie sicher, dass der Agar wird vor dem Gießen in Platten geschmolzen. HINWEIS: Kolben, die 100 ml LB-Agar-Platten werden 4 ergeben. Die Menge des LB-Agar kann verändert werden, um der Anzahl von Platten für den Assay benötigt entsprechen. </li><li> Machen PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren oder Filtration und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Bereiten Sie die Antibiotika-Stammlösungen für Gentamicin, Kanamycin, eind Tobramycin. <ol><li> Bereiten entsprechenden Antibiotikum stock Konzentrationen für P. aeruginosa-Stämme, die 100 mg / ml Gentamicin, 30 mg / ml Kanamycin und 10 mg / ml Tobramycin. Lösen Sie den Antibiotika in Wasser, Filter zu sterilisieren (0,2 um), und bei 4 ° C. Ändern Sie die Antibiotika und Konzentrationen je nach Bakterium untersucht. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die NTBC Stammlösungen. Auflösen 10 mg NTBC in 400 ul DMSO. Dies ergibt eine Konzentration von 75,9 mM NTBC. Shop NTBC Stammlösungen bei -20 ° C. Tau-Lösungen bei Raumtemperatur nach Bedarf. HINWEIS: Verschiedene Quellen von NTBC haben Unterschiede in der Löslichkeit. Bestimmen Sie das passende Fahrzeug, in dem die NTBC basierend auf den Empfehlungen des Herstellers zu lösen und anpassen Schritt 1.5 entsprechend. </li></ol> 2. NTBC Titrationen von Bakterienstämmen <ol><li> Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme zu testen. 2 ml LB-Brühe zu 16 x 150 mm Teströhrchens (einer pro-Stamm) und zu impfen mit 1 isoliert Kolonie aus jedem Stamm. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Belüftung auf einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator. </li><li> Am folgenden Tag vorzubereiten Titrationen von NTBC in LB-Brühe. Starten Sie mit einem Bereich von 0 bis 900 um NTBC da verschiedene Stämme haben Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber NTBC. <ol><li> 1 ml LB-Medium auf 4 bis 5 Teströhrchen (16 x 150 mm) pro Stamm. </li><li> Fügen Sie den NTBC Stammlösung (75,9 mm), um die Teströhrchen (16 x 150 mm) in einem Bereich von Konzentrationen. Siehe Tabelle 1 für NTBC Konzentrationen und entsprechende Aktienvolumen auf 1 ml LB-Brühe hinzufügen. </li></ol></li><li> Messen Sie die OD600 der Übernachtkulturen. Kulturen vor der Einnahme von OD 600 Lesungen zu beseitigen in den Medien präsent pyomelanin waschen. <ol><li> Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand und keine lose pelletierten Zellen miteine Mikropipette und Resuspendieren der festen Zellpellet in 1 ml LB </li></ol></li><li> Impfen Titration Röhrchen bei OD 600 0.05. Berechnung der Menge der Kultur gewaschen erforderlich, um die Rohre anzuimpfen. HINWEIS: Verwenden Sie die gewaschenen Kulturen für Impfungen seit pyomelanin sollte nicht vorhanden sein. </li><li> Die Titration Rohre etwa 24 h bei 37 ° C inkubieren mit Belüftung unter Verwendung einer Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator. </li><li> Fotografieren Sie die Titration Rohre und vergleichen Pigmentproduktion innerhalb und zwischen den Stämmen, die Menge an NTBC bestimmen, die für MIC und oxidativer Stress-Tests zu verwenden. Verwenden OD 600 Lesungen, die Menge an pyomelanin in zellfreien Kulturüberstand zu bestimmen, und um die Zelldichte zu bestimmen. HINWEIS: Der OD 600-Verhältnis von pyomelanin in Kulturüberstand von Zellen berechnet werden kann, um Unterschiede in pyomelanin Produktion nach Behandlung mit NTBC quantifizieren. </li></ol> 3. Antibiotika Mindest InhibiTory-Konzentration (MIC) Assay in 96-Well-Platten <ol><li> Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC getestet werden. HINWEIS: Dieses Protokoll wird mit dem repräsentativen Niveau von 300 um NTBC beschrieben. Die angemessene Höhe der NTBC verwendet werden in Schritt 2.6 festgelegt. <ol><li> In 300 um NTBC bis 2 ml LB Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB für die kein NTBC Zustand. </li><li> Mit einer sterilen Zahnstocher, zu impfen Rohre mit einem isolierten Bakterienkolonie. Es wird eine Kultur mit NTBC und einer Kultur ohne NTBC für jeden Stamm sein. Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Belüftung mit einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag machen LB + NTBC und LB + DMSO Stammlösungen für die Einrichtung des MIC-Assay. Hinzufügen NTBC bei einer Konzentration von 600 &amp; mgr; M, wie dies zweifach verdünnt, als Impfmaterial zugesetzt werden, wodurch man eine Endkonzentration von 300 uM. <ol><li> Einem antibi testenOhr für einen Stamm, fügen 600 um NTBC bis 2 ml LB und mischen, um den NTBC Stammlösung zu machen. Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB und mischen, die keine NTBC Stammlösung zu machen. Mit diesen Lösungen für die Erstellung Antibiotikum Stammlösungen als auch für den Aufbau der Verdünnungsreihe in 96-Well-Platten. HINWEIS: Die Stammlösung Formulierungen zusätzliche Lösung für Pipettierfehler-Konto zu erhalten. Die Stammlösungen kann nach oben oder unten skaliert, wie abhängig von der Anzahl von Antibiotika und getesteten Stämmen erforderlich. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Antibiotika-Lösungen in den LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen. HINWEIS: Die Konzentration des Antibiotikums in diesen Lösungen sollte das Doppelte der gewünschten Endkonzentration sein. Genug Lösung sollte, um 100 &amp; mgr; l bis vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen übertragen. <ol><li> Bereiten Gentamicin +/- NTBC Stammlösung bei 64 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen Sie 0,288 &amp; mgr; l von Gentamicin Lager (100 mg / ml) auf 450ul LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung. HINWEIS: Die maximale Konzentration von Gentamicin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 32 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Machen Sie das Kanamycin +/- NTBC Stammlösung bei 256 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 3,84 &amp; mgr; l Kanamycin Lager (30 mg / ml) und 450 &amp; mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen. HINWEIS: Die maximale Konzentration von Kanamycin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 128 ug / ml. </li><li> Bereiten Tobramycin +/- NTBC Stammlösung bei 8 &amp; mgr; g / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 0,36 &amp; mgr; l von Tobramycin Lager (10 mg / ml) und 450 &amp; mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen. HINWEIS: Für P. aeruginosa PAO1, die maximale Konzentration von Tobramycin beträgt 4 &amp; mgr; g / ml. HINWEIS: Die Antibiotika und Konzentrationen eingestellt, damit das Bakterium getestet werden kann. </li></ol></li><li> Füge 100 ul je 2x Antibiotikalösung zu vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Legen Sie diese Lösungen in der Reihe A. Für example sollte Gentamycin in den A1 bis A4 platziert werden sollte Kanamycin in A5 bis A8 angeordnet werden und Tobramycin sollte A9 bis A12 gelegt werden. Siehe 1A für ein Schaltbild einer 96-Well-Platte einzurichten. HINWEIS: Mehrere Antibiotika kann in einer Platte getestet werden, aber nur ein Stamm sollte pro Platte getestet, um das Risiko einer Kreuzkontamination von anderen Stämmen zu beseitigen. </li><li> In 50 ul der LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung, um Zeilen B bis H der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass eine Platte LB + NTBC und eine Platte LB + DMSO. Siehe 1A. <ol><li> Verwenden Sie LB + NTBC für die Antibiotika in LB + NTBC. Verwenden Sie LB + DMSO für die Antibiotika in LB + DMSO. </li></ol></li><li> Mit einer Mikroführen zweifachen Reihenverdünnungen der Antibiotika durch die Übertragung von 50 ul der Lösung von Reihe zu Reihe A B. Mischen Sie die Lösung, ändern Sie die Pipettenspitzen, und übertragen Sie 50 ul der Lösung von Reihe B C. Wiederholen Sie zum zu rudern die remaining Zeilen. Nach Verdünnen Reihe G, entfernen Sie 50 ul der Lösung aus dieser Reihe und entsorgen. Verwenden Reihe H als ohne Antibiotika-Steuerung für das Bakterienwachstum. Siehe Abbildung 1B. HINWEIS: Jedes der gut in den Reihen A bis G enthält nun 50 ul von Antibiotika in LB + NTBC oder LB + DMSO bei 2X die endgültige gewünschte Konzentration. Row H enthält LB + NTBC oder LB + DMSO ohne Antibiotika. </li><li> Messen Sie die OD600 der Übernachtkulturen. Alle Kulturen vor der Einnahme von OD 600 Lesungen in den Medien präsent pyomelanin beseitigen waschen. <ol><li> Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und Zellpellet in 1 ml LB </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Übernachtkulturen zu 2.75x10 5 CFU / ml in LB. HINWEIS: Es sei angenommen, dass eine OD 600-Einheit ist das Äquivalent von 1x10 &amp; sup9; CFU / ml von P. aeruginosa. OD, um CFU / ml Umwandlungen können d werdenifferent in anderen Bakterien. </li><li> Dann werden 50 ul der verdünnten Bakterienkultur zu dem geeigneten gut. HINWEIS: Kulturen in NTBC wachsen sollten an die Vertiefungen, die NTBC und Kulturen in DMSO wachsen sollten an die Vertiefungen, die DMSO hinzugefügt werden, hinzugefügt werden. Siehe Abbildung 1B. <ol><li> In Bakterien drei Brunnen für jeden Stamm und Antibiotikakonzentration. Dann werden 50 ul LB dem vierten gut, um als Kontrolle für die bakterielle Kontaminierung zu handeln. Siehe Abbildung 1B. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um die Brunnen zu impfen. Sicher, dass die Pipettenspitzen sich in der Nähe der Boden der Vertiefungen beim Hinzufügen Inokulum um eine Kontamination benachbarter Vertiefungen zu verhindern. HINWEIS: Durch Hinzufügen Bakterienkultur in die Vertiefungen wird der Antibiotikum und NTBC Konzentrationen zu verdünnen zweifach. </li></ol></li><li> Decken Sie die 96-Well-Platten mit Parafilm und Inkubation etwa 24 Stunden bei 37 ° C. Inkubieren Platten mit 96 Vertiefungen statisch in einem Luft Inkubator. </li><li> Untersuchendie Platten für das Bakterienwachstum in den Vertiefungen. Die MHK ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums in der kein Bakterienwachstum wird für alle drei Wiederholungen jedes Stammes gesehen. <ol><li> Optisch prüfen Sie die Platte für das Wachstum oder lesen unter Verwendung eines Plattenlesegerät-Set bis zu einer OD 600. </li></ol></li></ol> 4. Spot-Platten-Assay für die oxidative Stressreaktion <ol><li> Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC wie in Schritt 3.1 beschrieben, getestet werden. </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten LB-Agarplatten, die H 2 O 2 als oxidative Stressor. Eine Reihe von H 2 O 2 -Konzentrationen von 0 auf 1 mM ist ein guter Ausgangspunkt. <ol><li> Schmelzen Sie die LB-Agar-Kolben. Kühles Medium auf etwa 50 ° C bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzuzufügen H 2 O 2 direkt an den gekühlten Medien in den gewünschten Konzentrationen. Swirl Flaschen zu mischen. Siehe Tabelle 2 für die Konzentration von H 2 O 2und Volumina konzentrierter H 2 O 2 zu. Diese Werte beziehen sich auf 100 ml LB-Agar basiert. </li><li> Platten gießen unmittelbar nach Zugabe von H 2 O 2 und Flamm der Oberfläche, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt 4 Platten pro 100 ml LB-Agar. Markieren die Platten mit dem H 2 O 2 -Konzentration. </li><li> Legen Sie die Platten in einer biologischen Flow-Haube mit dem Lüfter läuft für 30 Minuten unbedeckt, um überschüssige Feuchtigkeit aus den Platten zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie die Platten am selben Tag sie hergestellt werden. Bei Nichtbeachtung kann zu inkonsistenten Daten führen. HINWEIS: Oxidativer Stressfaktoren wie Paraquat für H 2 O 2 in diesem Test ausgewechselt werden. Die für andere oxidative Stressoren verwendeten Konzentrationen kann anders als die für H 2 O 2 verwendet wird. </li></ol></li><li> Waschen Sie und Messen der OD 600 der Übernacht-Kulturen wie in Schritt 3.7 beschrieben. </li><li> Normalisieren die OD 600 von der ganzen Nacht cultures auf den niedrigsten Wert für die Menge der Stämme getestet. P. aeruginosa hat im allgemeinen eine OD 600 von etwa 2,5, wenn über Nacht in LB + NTBC oder LB + DMSO gewachsen. <ol><li> Bestimmung der Kulturvolumen benötigt wird, um die Kultur auf die niedrigste OD 600 in einem Gesamtvolumen von 1 ml zu verdünnen. Zum Beispiel, wenn eine Kultur eine OD 600 von 3 und der niedrigste OD 600 für die Menge der Stämme ist 2.5, die folgende Rechnung aus: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert werden. </li><li> Berechnung der Menge an LB + NTBC (300 uM) oder LB + DMSO benötigt, um das Kulturvolumen auf 1 ml zu bringen. Zum Beispiel in Schritt 4.4.1 wird die Menge an LB + NTBC oder LB + DMSO zu der Kultur gegeben wäre 0,167 ml (1 ml Gesamtvolumen - 0.833 ml Kultur) sein. Machen Stammlösungen LB + NTBC und LB + DMSO für diese Verdünnungen auf der Basis des zum Verdünnen aller Stämme benötigte Volumen zu verwenden. </li><li> Mischen Sie die Kultur und LB + NTBC oder LB + DMSO durch Vortexen. </li></ol></li><li> Kulturen in einer konstanten Konzentration von NTBC oder DMSO zu erhalten, auszuführen zehnfache serielle Verdünnungen der normalisierten Übernachtkulturen in PBS + NTBC oder PBS + DMSO. <ol><li> Machen Stammlösungen von PBS + NTBC und PBS + DMSO. Für einen Satz von Verdünnungen für einen Stamm, mix 300 um NTBC oder eine gleichwertige Menge von DMSO mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 720 &amp; mgr; l zu ergeben. Skalieren Sie diese Aktien nach oben oder unten, je nachdem, wie viele Stämme getestet. </li><li> Label-Mikrozentrifugenröhrchen für 10 -1 bis 10 -7 Verdünnungsreihen. Werden 90 &amp; mgr; l PBS + NTBC oder PBS + DMSO in die entsprechenden Tuben. Verwenden PBS + NTBC für die Stämme in LB + NTBC gewachsen und benutzen PBS + DMSO für die Stämme in LB + DMSO gewachsen. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l der Kultur in die entsprechende 10 -1 Verdünnungsröhrchen. Vortexen und übertragen 10 ul der 10 -1 Verdünnung auf 10 -2 Verdünnungsröhrchen. Wiederholen, bis alle Verdünnungen wurden perfoRMED. Ändern Pipettenspitzen zwischen Verdünnungen. </li></ol></li><li> Spot 5 ul der 10 -3 bis 10 -7 Verdünnungen auf LB + H 2 O 2 Platten in doppelter Ausführung für jeden Stamm. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, wenn Flecken überzogen von den meisten zu verdünnen, um mindestens verdünnter (10 -7 bis 10 -3). Nicht kippen oder neigen Sie die Platte, bis die Flüssigkeit in die Platte getrocknet. </li><li> Die Platten für 24-48 h bei 37 ° C (Luftinkubator) in Abhängigkeit von der Belastung. HINWEIS: P. aeruginosa PAO1 wird recht großen Kolonien auf LB nach 24 Stunden Inkubation haben. Stämmen inkubieren, bis sie Kolonien etwa die gleiche Größe wie PAO1. </li><li> Fotografieren Sie die Platten unter Verwendung einer CCD-Kamera über einem transluminator. Bearbeiten Sie optional die Fotos für Kontrast und Ernte auf die gleiche Größe. Zählen die Anzahl der Kolonien in jedem Spot zu Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress zu bestimmen. </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die in diesem Protokoll beschriebene NTBC-Titrationsmethode ermöglicht es dem Benutzer zu bestimmen, ob NTBC die Pyomelaninproduktion in Bakterien reduzieren oder eliminieren kann, und die erforderliche Konzentration von NTBC zu bestimmen. Der wichtigste Schritt im NTBC-Titrationsassay ist die Bestimmung des Bereichs der NTBC-Konzentrationen, die im Assay verwendet werden sollen. Verschiedene Stämme von P. aeruginosa sind unterschiedlich empfindlich gegenüber NTBC, und Laborstämme können empfindlicher auf NTBC r...

Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives Bakterium, das eine Vielzahl von Pigmenten produziert, einschließlich Pyomelanin, ein rotbraunes Pigment, das Schutz vor oxidativem Stress1-4 bietet und eine Vielzahl von Verbindungen bindet, einschließlich Aminoglykosid-Antibiotika5-7. Die Pyomelaninproduktion wird durch einen Defekt im Tyrosin-Katabolismus-Signalweg4,8 verursacht, entweder durch Deletionen oder Mutationen des Gens, das für die Homogentisat-1,2-Dioxygenase (HmgA)1,9 kodiert, oder durch Ungleichgewichte in den verschiedenen Enzymen des Signalwegs10. Homogentisat reichert sich aufgrund der Inaktivierung von HmgA an und wird sezerniert und oxidiert, um Pyomelanin11 zu bilden. Die Produktion von Pyomelanin kann dosisabhängig durch Behandlung mit dem Herbizid 2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC)12, das die 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (Hpd) im Tyrosin-Katabolismus-Signalweg13 hemmt, aufgehoben oder reduziert werden. Hpd wird für die Bildung von Homogentisat und damit von Pyomelaninbenötigt 11. 
Wir beschreiben detailliert drei Techniken, die in unseren Studien zur NTBC-Behandlung von Pyomelanin-produzierenden Stämmen von P. aeruginosa wichtig waren. Zu diesen Techniken gehören die Titration von NTBC zur Bestimmung der Konzentrationen, die die Pyomelaninproduktion in Labor- und klinischen Pyomelanin-produzierenden Stämmen aufheben oder reduzieren, die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) von Antibiotika, wenn Bakterien mit NTBC behandelt werden, und die daraus resultierende Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress bei NTBC-Behandlung.
Der von uns entwickelte Titrationsassay dient zwei Zwecken. Zunächst kann der Benutzer mit dem Assay feststellen, ob und in welchen Konzentrationen NTBC die Pyomelaninproduktion in dem untersuchten Bakterium aufheben oder reduzieren kann. Dies ermöglicht es dem Anwender, die Empfindlichkeit gegenüber NTBC zu bestimmen, da verschiedene Bakterienstämme unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber dieser Verbindung aufweisen können, wie bei P. aeruginosa12 beobachtet. Zweitens ermöglicht der NTBC-Titrationsassay dem Benutzer, die geeignete Konzentration von NTBC zu bestimmen, um sie in nachfolgenden Assays, wie z. B. Antibiotika-MIC und oxidativen Stressreaktionsassays, zu verwenden, wenn das Ziel darin besteht, die Pyomelaninproduktion abzuschaffen oder zu reduzieren und die Auswirkungen der Pigmentreduktion zu bestimmen. 
Der Titrationsassay funktioniert, weil ein sichtbarer Unterschied in der Pyomelaninproduktion bei Stämmen zu sehen ist, die mit NTBC behandelt wurden, und die Unterschiede in der Pyomelaninproduktion dosisabhängig sind12. Darüber hinaus kann diese Technik auf die Untersuchung anderer Verbindungen angewendet werden, die die Pigmentproduktion in Bakterien eliminieren oder verbessern können.
Antibiotika-MICs werden verwendet, um die Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antibiotika zu bestimmen. Es gibt mehrere Methoden zur Bestimmung von MICs, einschließlich Agar-Verdünnungsplatten und Bouillonverdünnungen14. Bouillonverdünnungen können in kleinen Reagenzgläsern oder in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Das hierin beschriebene Mikrotiterplattenverfahren zur MHK-Bestimmung ermöglicht es dem Benutzer, eine breite Palette von Antibiotika mit einem Minimum an Ressourcen zu testen. Der Assay bietet sowohl Reproduzierbarkeit als auch Flexibilität bei der Anzahl der mit dieser Methode getesteten Antibiotika und Stämme. Darüber hinaus kann der Benutzer durch die Einbeziehung von NTBC in den Assay feststellen, ob die Eliminierung oder Verringerung der Pyomelaninproduktion die Antibiotikaempfindlichkeit bei Bakterien, die Pyomelanin produzieren, verändert.
Die bakterielle Reaktion auf oxidativen Stress kann auf verschiedene Arten getestet werden. Die gebräuchlichsten beschriebenen Methoden sind entweder lebensfähige Keimzahlen von Bakterien, die über einen bestimmten Zeitraum oxidativem Stress ausgesetzt waren1 oder Disk-Diffusionsassays mit oxidativem Stress15. Diese Methoden neigen dazu, hohe Konzentrationen oxidativer Stressoren zu verwenden, um die Auswirkungen von oxidativem Stress in Bakterien zu untersuchen, und die Ergebnisse können zwischen biologischen Replikaten sehr unterschiedlich sein. Der Viable Count Assay verwendet tendenziell auch mehr Agarplatten als die anderen Methoden. Der von uns beschriebene Spot-Platten-Assay verwendet niedrige Konzentrationen von H2O2 und ermöglicht es dem Benutzer, die oxidative Stressantwort mehrerer Stämme mit einem Minimum an Platten zu testen. Der Assay ist auch zwischen technischen und biologischen Replikaten konsistent reproduzierbar. Da Pyomelanin an der Resistenz gegen oxidativen Stress beteiligt ist, ermöglicht die Einbeziehung von NTBC in den Assay dem Anwender, die Auswirkungen der Eliminierung der Pyomelaninproduktion auf die Resistenz gegen oxidativen Stress zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Auch Nitisinon genannt. Löslich in DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 Gew.-% in H2O.&nbsp; Stabilisiert.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>Löslich in H2O.&nbsp; Filter sterilisieren.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Löslich in H2O.&nbsp; Filter sterilisieren.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Löslich in H2O.&nbsp; Filter sterilisieren.</td></tr></tbody></table>

verfahren zur inhibierung bakterielle pyomelanin produktion und bestimmen der entsprechenden erhöhung der empfindlichkeit gegenüber oxidativem stress

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin ist ein extrazelluläres rot-braunes Pigment, das von mehreren Bakterien- und Pilzarten produziert wird. Dieses Pigment stammt aus dem Tyrosin-Katabolismus und trägt zu einer erhöhten Resistenz gegen oxidativen Stress bei. Die Pyomelaninproduktion in Pseudomonas aeruginosa wird durch die Behandlung mit 2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC) dosisabhängig reduziert. Wir beschreiben eine Titrationsmethode, bei der mehrere Konzentrationen von NTBC verwendet werden, um die Konzentration des Arzneimittels zu bestimmen, das die Pyomelaninproduktion in Bakterien reduziert oder aufhebt. Die Titrationsmethode hat ein leicht quantifizierbares Ergebnis, eine sichtbare Verringerung der Pigmentproduktion bei steigenden Wirkstoffkonzentrationen. Wir beschreiben auch eine Mikrotiterplattenmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika in Bakterien. Diese Methode verbraucht ein Minimum an Ressourcen und kann leicht skaliert werden, um mehrere Antibiotika in einer Mikrotiterplatte auf einen Bakterienstamm zu testen. Der MHK-Assay kann angepasst werden, um die Auswirkungen von nicht-antibiotischen Verbindungen auf das Bakterienwachstum bei bestimmten Konzentrationen zu testen. Schließlich beschreiben wir eine Methode zum Testen der bakteriellen Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress, indem H2O2 in Agarplatten eingebaut und mehrere Verdünnungen von Bakterien auf den Platten aufgespürt werden. Die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress wird durch eine Verringerung der Koloniezahl und -größe für die verschiedenen Verdünnungen auf Platten, die H2O2 enthalten, im Vergleich zu einer Kontrolle ohne H2O2 angezeigt. Der oxidative Stress-Spotplatten-Assay verwendet ein Minimum an Ressourcen und geringe Konzentrationen von H2O2. Wichtig ist, dass es auch eine gute Reproduzierbarkeit aufweist. Dieser Spotplatten-Assay könnte angepasst werden, um die bakterielle Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Verbindungen zu testen, indem die Verbindungen in Agarplatten eingebaut und das resultierende Bakterienwachstum charakterisiert wird.

NTBC Titrationen Die NTBC Titrationen wurden verwendet, um festzustellen, ob NTBC konnte pyomelanin in P. reduzieren aeruginosa, und auch die Konzentration von NTBC, die eliminiert oder reduziert pyomelanin Produktion für die Verwendung in weiteren Assays identifizieren. Es können Variationen in der Höhe der pyomelanin in verschiedenen Replikationen hergestellt sein, aber allgemeine Trends konstant bleiben. Die NTBC Titrationsassay könnte auch modifiziert werden, um andere ...

Die bakterielle Pyomelaninproduktion führt zu einer erhöhten Resistenz gegen oxidativen Stress und Virulenz. Wir berichten über Techniken, die zur Bestimmung der Hemmung der Pyomelaninproduktion und zur Untersuchung der daraus resultierenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress bei Bakterien sowie zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika eingesetzt werden können.

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Die allgemeinen Ziele der folgenden Experimente bestehen darin, die Wirkungen von NTBC auf die Produktion von P. mein und die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress sowie die minimalen Hemmkonzentrationen von Antibiotika, also die Mics, zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem NTBC Bakterienkulturen zugesetzt wird, um die Konzentration zu ermitteln, die die Produktion von p Melanin verringert, was der zweite Schritt ist. Bakterienkulturen werden mit NTBC und Antibiotika behandelt, wodurch der Anwender feststellen kann, ob die Behandlung mit NTBC einen Einfluss auf die minimalen Hemmkonzentrationen der Antibiotika (Mics) hat.Kulturen, die mit NTPC behandelt wurden, werden anschließend Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress nach NTPC-Behandlung zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung genischer Bakterien mit NTPC zu einer Verringerung der Pigmentproduktion führt und gleichzeitig die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress erhöht, während keine Wirkung auf den antibiotischen MIC-Wert festzustellen ist, basierend jeweils auf Spot-Platten zur Beurteilung der Antwort auf oxidativen Stress und mikrotiterplattenbasierten MIC-Assays. Der Hauptvorteil der Oxidativer-Stress-Spot-Platten-Technik gegenüber etablierten Methoden wie Keimzahlermittlung oder Scheiben-Diffusions-Assays besteht darin, dass niedrigere Konzentrationen an Wasserstoffperoxid verwendet werden können, im Gegensatz zu den hohen Konzentrationen, die bei anderen Assays notwendig sind. In der Regel haben Personen, die neu in unserer Methode zur Bestimmung von antibiotischen MIC-Werten sind, Schwierigkeiten, da eine ungenaue Pipettier-Technik die Variabilität zwischen den Wiederholungen erhöht.Diese Variabilität kann es schwierig machen, den Wirkstoff genau zu bestimmen. MIC Einen Tag vor dem MIC-Assay. Bereiten Sie Kulturen der zu testenden Stämme in LB mit und ohne vor.Zwei zwei Nitro, vier Trior Ethylbenzoyl ein drei Cyclohexan-Dion oder NTBC. Diese Demonstration verwendet eine repräsentative Konzentration von 300 Mikromolar NTBC. Die Titrationmethode zur Bestimmung der geeigneten Konzentration von NTBC ist im Protokolltext beschrieben: Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung am folgenden Tag.Stellen Sie LB mit NTBC und LB mit DMSO als Stammlösungen für den MIC-Test her, um ein Antibiotikum an einem Stamm zu testen, wobei 600 Mikromolar NTBC zu zwei Millilitern LB gegeben und gemischt werden. Zur Herstellung der NTBC-Stammlösung: NTBC wird in einer Konzentration von 600 Mikromolar zugegeben, da es verdünnt wird, wenn der Inokulum hinzugefügt wird.Um eine Endkonzentration von 300 Mikromolar zu erreichen, geben Sie ein äquivalentes Volumen des Fahrzeugs DMSO zu zwei Millilitern LB hinzu und mischen Sie, um die NO-NTBC-Masterlösung herzustellen. Diese beiden Masterlösungen werden verwendet, um Antibiotikastammlösungen herzustellen sowie um die Verdünnungsreihen in 96-Well-Platten aufzusetzen. Bereiten Sie anschließend die Antibiotikalösungen in den LB-plus-NTBC- oder LB-plus-DMSO-Masterlösungen vor.Stellen Sie die Gentamycin-Plus-oder-Minus-NTBC-Stammlösung bei 64 Mikrogramm pro Milliliter her. Bereiten Sie die Kanamycin-Plus-oder-Minus-NTBC-Stammlösung bei 256 Mikrogramm pro Milliliter vor. Bereiten Sie die Tobramycin-Plus-oder-Minus-NTB-Stammlösung bei acht Mikrogramm pro Milliliter vor.Nachdem die beiden Antibiotikalösungen hergestellt wurden, je 100 Mikroliter jeder Antibiotikalösung in vier Vertiefungen einer 96-Loch-Platte in Reihe A geben. Zum Beispiel sollte Gentamicin in A1 bis A4, Kanamycin in A5 bis A8 und Tobramycin in A9 bis A12 gegeben werden. 50 Mikroliter der LB-plus-NTBC- oder LB-plus-DMSO-Masterlösung zu den Reihen B bis H der 96-Loch-Platte hinzufügen; sicherstellen, dass eine Platte LB plus NTBC und eine Platte LB plus DMSO enthält. Mit einem Mikropipettiergerät zweifache serielle Verdünnungen der Antibiotika durchführen, indem 50 Mikroliter der Lösung von Reihe A nach Reihe B übertragen werden. Die Lösung mischen, die Pipettenspitzen wechseln und 50 Mikroliter der Lösung von Reihe B nach Reihe C übertragen. Dies für die verbleibenden Reihen wiederholen, nachdem Reihe G verdünnt wurde. 50 Mikroliter der Lösung aus dieser Reihe entfernen und verwerfen.Verwenden Sie Reihe H als Kontrolle ohne Antibiotikum für das bakterielle Wachstum. Entnehmen Sie die Übernachtkulturen, nachdem Sie alle Kulturen gewaschen haben, um Lanin im Medium zu entfernen, messen Sie den OD 600 der Kulturen und verdünnen Sie die Übernachtkulturen in LB unter Verwendung eines Mehrkanal-Mikropipettiersystems.Fügen Sie 50 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur in die entsprechenden Vertiefungen hinzu. Geben Sie Bakterien in drei Vertiefungen für jeden Stamm und jede Antibiotikakonzentration. Fügen Sie 50 Mikroliter LB in die vierte Vertiefung hinzu, um als Kontrolle für bakterielle Kontamination zu dienen.Bedecken Sie die 96-Well-Platten mit Perfil und inkubieren Sie sie am folgenden Tag etwa 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Platten visuell auf bakterielles Wachstum in den Vertiefungen. Die MIC ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums, bei der für alle drei Wiederholungen jedes Stammes kein bakterielles Wachstum zu erkennen ist.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie Übernachtkulturen der zu testenden Stämme in LB mit und ohne NTBC wie am folgenden Tag zuvor gezeigt vor. Bereiten Sie LB-APLs mit Wasserstoffperoxid als oxidativen Stressor vor. Erwärmen Sie zunächst die LB-Agarflaschen zum Schmelzen und kühlen Sie das Medium auf etwa 50 Grad Celsius bei Raumtemperatur ab.Fügen Sie anschließend Wasserstoffperoxid direkt in das abgekühlte Medium in den gewünschten Konzentrationen hinzu. Schwenken Sie den Kolben, um eine Reihe von Wasserstoffperoxid-Konzentrationen von null bis eins Millimolar zu mischen, was ein guter Ausgangspunkt ist.Gießen Sie die Platten sofort ein und flammen Sie die Oberfläche ab, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt vier Platten pro 100 Milliliter LB-Agar. Kennzeichnen Sie die Platten mit der Wasserstoffperoxidkonzentration.Stellen Sie die Platten unbedeckt in eine biologische Sicherheitswerkbank mit laufendem Gebläse für 30 Minuten, um überschüssige Feuchtigkeit aus den Platten zu entfernen. Die Platten sollten am selben Tag verwendet werden. Während die Platten trocknen, werden sie vorbereitet, gewaschen und vermessen.Der OD 600 der Übernachtkulturen wird normalisiert, indem der OD 600 aller Übernachtkulturen auf den niedrigsten Wert der getesteten Stämme eingestellt wird. Dazu bestimmen Sie das Volumen an Kultur, das benötigt wird, um die Kultur auf den niedrigsten OD 600 in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter zu verdünnen. Wenn beispielsweise eine Kultur einen OD 600 von drei aufweist und der niedrigste OD 600 der Stämme 2,5 beträgt, führen Sie die folgende Berechnung durch, die 0,833 Milliliter als erforderliches Kulturvolumen ergibt. Geben Sie 0,833 Milliliter Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Berechnen Sie anschließend die Menge an LB plus NTBC oder LB plus DMSO, die benötigt wird, um das Kulturvolumen auf einen Milliliter aufzufüllen. In diesem Beispiel wären das 0,167 Milliliter. Vortexen Sie die Mischung, um die Kulturen in einer konstanten Konzentration an NTBC oder DMSO zu halten. Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der normalisierten Übernachtkulturen in PBS plus NTBC oder PBS plus DMSO durch. Stellen Sie Stammlösungen von PBS plus NTBC und PBS plus DMSO her, und skalieren Sie diese je nach Anzahl der zu testenden Stämme entsprechend hoch oder herunter. Für einen Satz Verdünnungen pro Stamm mischen Sie 300 Mikromolar NTBC oder ein äquivalentes Volumen DMSO mit PBS, sodass ein Gesamtvolumen von 720 Mikrolitern entsteht. Geben Sie 90 Mikroliter PBS plus NTBC oder PBS plus DMSO in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen, die für die seriellen Verdünnungen von 10⁻¹ bis 10⁻⁷ beschriftet sind.Geben Sie 10 Mikroliter Kultur in das entsprechende Verdünnungsrohr für die 10 hoch minus eins-Verdünnung, mischen Sie durch Vortexen und übertragen Sie 10 Mikroliter der 10 hoch minus eins-Verdünnung in das 10 hoch minus zwei-Verdünnungsrohr. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Verdünnungen und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Verdünnungen durchgeführt wurden. Geben Sie jeweils fünf Mikroliter der 10 hoch minus drei- bis 10 hoch minus sieben-Verdünnung dupliziert auf LV-Platten mit Wasserstoffperoxid. Verwenden Sie für jeden Stamm eine eigene Pipettenspitze. Wenn die Proben von der am stärksten verdünnten zur am wenigsten verdünnten Konzentration aufgebracht werden, kippen oder neigen Sie die Platte nicht, bis die Flüssigkeit vollständig in die Platte eingezogen ist. Inkubieren Sie die Platten je nach Stamm 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius.Sobald Kolonien guter Größe erschienen sind, fotografieren Sie die Platten mit einer CCD-Kamera über einem Transilluminator. NTBC-Titrationen wurden verwendet, um zu bestimmen, ob NTBC die p-Melaninproduktion in p aerogen reduzieren konnte, und um die Konzentration von NTBC zu identifizieren, die die p-Melaninproduktion eliminiert oder reduziert, für den Einsatz in weiteren Assays, wie hier gezeigt. NTBC reduzierte die PY-Melaninproduktion dosisabhängig in p-Melanin-bildenden Stämmen, hatte jedoch keinen Effekt auf die Pigmentproduktion in Stämmen, die kein p-Melanin produzieren.Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse des MIC-Tests für verschiedene *P. aeruginosa*-Stämme, die mit und ohne NTBC sowie verschiedenen Antibiotika behandelt wurden. Die MICs wurden als die niedrigste Konzentration des Antibiotikums erfasst, die das bakterielle Wachstum hemmte. Die Behandlung mit NDBC hatte keinen Einfluss auf die MICs der getesteten Stämme gegenüber den Antibiotika. Ein Spot-Platten-Assay zur Überprüfung der oxidativen Stressantwort wurde mit *P. aeruginosa*-Melanin-bildenden und nicht Melanin-bildenden Stämmen durchgeführt, die mit und ohne NDBC behandelt wurden.Die Platte mit null Millimolar Wasserstoffperoxid zeigte, dass alle Stämme korrekt verdünnt wurden, und es wurde eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress beobachtet, wenn PIO-Melanin produzierende Bakterien mit NTBC behandelt wurden. Stämme, die kein PIO-Melanin produzieren, waren empfindlicher gegenüber oxidativem Stress als Stämme, die p-Melanin produzieren. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Auswirkungen der NTBC-Behandlung auf die PIO-Melanin-Produktion untersucht, indem man die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress und Antibiotika-MICs testet.

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Spot-Plate-Assay, der auf die Bewertung der oxidativen Stressreaktionen von Bakterienstämmen zugeschnitten ist. Einige Stämme produzieren Pyomelanin, ein antioxidatives Pigment. Umgekehrt weisen Stämme, die mit einem Testmittel behandelt wurden, was zu einer verminderten Pyomelaninproduktion führte, eine erhöhte Anfälligkeit für oxidativen Stress auf, was zu einer verminderten Zellviabilität im Vergleich zu Pyomelanin-produzierenden Stämmen führte.

Ein Spot-Plate-Assay zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen in Bakterienstämmen

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Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress (Video) | JoVE Journal

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

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