Name: Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Kryoschnitt-Mikrodissektion muriner Kolonschleimhaut zur Isolierung von Krypten- und Oberflächenepithelzellen. Diese schnelle Methode ermöglicht Gen- und Proteinexpressionsanalysen mittels Real-time PCR und Western Blot.

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Unterstützt von den National Institutes of Health (DK55679 und DK59888 an A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core des Winship Cancer Institute Comprehensive Cancer Center Grant, P30CA138292, und der Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development Award für C.T.C. und Fellowship Award für A.E.F.

Versuchen verwendeten C57BL / 6-Mäusen, 10 bis 12 Wochen alt sind. Alle Verfahren unter Verwendung von Tieren wurden überprüft und von der Emory University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und wurden nach den National Institutes of Health Kriterien durchgeführt. 1. Versuchsaufbau <ol><li> Einrichten des Kryostaten <ol><li> Äquilibrieren Kryostaten auf -20 ° C, einschließlich der Mikrotomklinge und Spannfutter (äußerst vorsichtig vorgehen, um die Klinge!). </li><li> Füllen Sie eine leere cryomold mit OCT (optimale Schnitt Temperatur-Verbindung) und ins Gleichgewicht zu -20 ° C (~ 30 min). Entfernen Sie die gefrorenen Oktober aus der Form und befestigen Sie es am Spannfutter mit flüssigem Oktober Setzen Sie den Block / Spannfutter im Mikrotom Arm und lassen Sie das OAT 10 min eingestellt. </li><li> Stellen Sie den Kryostaten bis 10 &amp; mgr; m pro Schnitt und Rasur des Office-Block, bis es flach ist. Rücken des Mikrotoms Arm weg von der Klinge um mehrere Zentimeter. An dieser Stelle nicht das Messer oder Spannfutter für den Rest der Erfahrung anzupassen weißBeispiel. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Rasierklingen: Bereiten Sie 2 Rasierklingen pro Probe. Unter Verwendung einer Metallfeile, dumpf die sharped Rand der Blätter. Dann entfernen Sie den Flansch aus Aluminium mit einer Pinzette. </li><li> Pre-Chillen ein Pyrex Gericht oder einer anderen flachen Oberfläche auf Trockeneis. </li><li> Bereiten Sie eine Dissektion Gericht mit 10-15 Dissektion Stifte. A 10 cm Gewebekulturschale mit 50% Silizium gefüllt wird ausreichen. 5 ml Hanks-Puffer bei RT. </li></ol> 2. Präparation der Distal Kolongewebe <ol><li> Platz Mäusen in einer abgedichteten Kammer und einschläfern Mäusen durch Isofluran-Inhalation und Genickbruch, dann sprühen 70% Ethanol auf den Bauch und Brustkorb 12. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des Bauches mit einer Schere und dann ein Einschnitt in die Bauchhöhle aus. Ähnliche Verfahren können hier 12 beschrieben gefunden werden. </li><li> Schneiden Sie den Dickdarm am Rande anal und necken neben der Gekröse, bis der Doppelpunkt ist frei. </li><li> Auszuschneiden einen distalen KolonSegment zwischen 0 und 6 cm vom Anus. Hier ist die Kryptentiefe ~ 150 &amp; mgr; m (siehe Abbildung 1B). Schneiden Sie den Doppelpunkt in Längsrichtung mit einer Schere und die fäkale Inhalt zu entfernen. </li><li> Pin das Gewebe auf die Dissektion Gericht mit der Schleimhautoberfläche nach oben zeigt. Dehnen die Verwendung Gewebedissektion Stifte auf einem Silizium-Gericht in Hanks-Puffer und ruhen lassen für 10 Minuten bei RT (1C). Dies entfernt Falten aus dem Gewebe und erlaubt die Muskelschichten zu entspannen. </li></ol> 3. Montieren Tissue auf dem Kryostat zum Schneiden <ol><li> Schieben einer Rasierklinge unter der gewünschten Gewebebereich und dann abgießen Hanks-Puffer. Einen weiteren hinzufügen Rasierklinge nach oben, so dass ein Sandwich. Schneiden Sie das Gewebesegment und die Stifte zu entfernen. Übertragen Sie die Rasierklinge / Gewebe-Sandwich auf Trockeneis. Lassen Sie das Gewebe einzufrieren (5-10 min, 1D). </li><li> Nehmen Sie den Rasierer / Gewebe Sandwich und lassen Sie ihn leicht, indem Sie einen Finger auf die Oberseite bl wärmenade (Schleimhautseite nach oben. Dieser richtet das Gewebe, so dass die basalen Muskelschichten werden zuerst geschnitten.). Trennen Sie die Sandwich-und schneiden um die Ränder des Gewebesegment. Schneiden Sie ein Gewebesegment rund, 0.5 cm x 1 cm. Randbereiche haben eine Tendenz zu kräuseln, wodurch die Serienschnitte vieler Gewebeschichten. Beachten Sie, dass Überschneiden ist besser als unter Schneiden, so irren auf der Seite der Vorsicht. </li><li> Damit das Gewebe erwärmt, bis das Eis auf der Oberseite des Gewebes zu schmelzen beginnt. An dieser Stelle schnell und sorgfältig drücken das Gewebe in OCT-Block in den Kryostaten. </li><li> Entfernen Sie das Blade, indem Sie einen Finger über die Probe. Die Wärmeübertragung ermöglicht es Ihnen, die Klinge, ohne das Gewebe zu stören zu entfernen. </li><li> Coat das Gewebe mit OAT und ins Gleichgewicht für 5 min. Zuschnitte bei 10 um (1E, F). Sichtprüfung der Abschnitte bis die Krypten zu sehen sind. Platz Abschnitte in ein 1,5 ml Röhrchen oder auf Objektträgern. </li><li> Für die Analyse von mRNA oder Protein, Ort ter Proben in Röhrchen mit 5 Krypta-Basis, 5 Übergangs und 5 Flächenabschnitte pro Röhrchen. Für die RNA-Sammlung 1 ml kommerziellen Isolation-Reagenz und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Zuführen RNA-Reinigung gemß den Herstelleranweisungen. Verwenden 5-10 ug Gesamt-RNA für die cDNA-Generation. </li><li> Zur Proteinreinigung, fügen Sie 0,5 ml kaltem RIPA Lysepuffer (plus Protease-Inhibitoren) je 5 Sektionen. Beschallen 3 mal in einer 70% igen Zyklus, auf Eis. <ol><li> Proben, die SDS-PAGE-Ladepuffer (Laemmli-Puffer) hinzufügen und Inkubation bei 100 ° C für 10 min. Betreff Proben SDS-PAGE und Transfer, dann in 5% Milch / PBS Block 2 Stunden. Western Blot-Analyse durchzuführen, gefolgt von einer Inkubation mit KLF4 Antikörper (1: 500) O / N bei 4 ° C. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Die molekularen Mechanismen in Kolonepithelzellen Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind kaum verstanden. Dies schließt Lücken in unserem Verständnis der zellulären Signalumgebung des Stammzellkompartiments an der Basis der Krypten Kolonepithel. Es besteht auch ein zunehmendes Interesse an der Prozesse, die Enterozyten Differenzierung unterliegen. Zum Beispiel, ein besseres Verständnis der in vivo Differenzierung wird als Benchmark für Studien an der Herstellung von in vitro Primärdarmsysteme 16 ausgerichtet erforderlich. Das obige Verfahren beinhaltet mehrere Schritte, die besondere Maßnahmen erfordern. Erstens, das Entfernen der Ränder um die gefrorenen Gewebesegment (wie in Abschnitt 3.2 diskutiert) als die Geweberänder beim Präparieren und Einfrieren curl erforderlich. Die Nichtbeachtung dieser Kanten Ergebnisse zu bewegen ist eine Mischpopulation von Oberfläche und Krypta Basiszellen. Montage des Gewebes auf einem vorgekühlten, eingeebnet Oktober Block ist auch wichtig. Tseinem Protokoll kann zu anderen Bereichen des distalen Kolons durch Verändern der Anzahl von Abschnitten in jedem Pool angepasst werden. Zum Beispiel, wie in 1B gezeigt, variiert Mukosakryptenbereichs Länge zwischen 150-300 um. Daher wird, wenn die Untersuchung der Bereich zwischen 4 cm 6 cm vom Anus aus, die Anzahl der Abschnitte ist von 15 bis 30. Es ist wichtig erhöht werden, wird dieses Protokoll nicht für das proximale Colon vorgeschlagen (7 cm-9 cm) durch Falten ( plicae obliquae), die in das Lumen zu verlängern macht es unmöglich, getrennte Oberfläche und Krypta-Basiszellen durch Serienschnitt. Serienschnitt Techniken wurden verwendet, um Krypta-Basis zu studieren und Oberfläche epithelialen Zellpopulationen in den Menschen. Fügt jedoch unser Protokoll zusätzliche Schritte, die aufgrund der geringen Größe des Maus-Gewebe erforderlich sind. Wir schlagen vor, dass das obige Protokoll wird für die Untersuchung der Krypta-Basis und Oberfläche epithelialen Zellpopulation in genetisch tractable Maus-Systeme ermöglichen. Tatsächlich vereinigt Abschnitte Yield hochwertiges Protein und RNA geeigneten nachgeschalteten Analyse. Zukünftige Anwendungen könnte die Untersuchung von Zellsignalwege oder Chromatinimmunpräzipitation enthalten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass, wie einige der vorstehend beschriebenen alternativen Verfahren, enthalten die resultierenden Abschnitte eine Mischung von epithelialen und interstitielle Lamina propria Zellen sein. Im Ergebnis ist die hier beschriebene Protokoll stellt eine schnelle, hohe Ausbeute Methode für die Analyse von molekularen Prozessen in räumlich unterschiedlichen Regionen des murinen Colon-Schleimhaut.

Die Colon-Epithel ist ein hoch regenerativer Gewebe, mit Wohnsitz Stammzellen Auffüllen der Gewebe alle paar Tage ein. Dieser Prozess der Regeneration erfordert die Aufrechterhaltung einer proliferativen Stammzellkompartiments. Im Laufe der Zeit können die neu erzeugten Tochterzellen verlieren ihre proliferative Potenzial und wandern zu der luminalen Oberfläche des Darms. Gleichzeitig mit der Migration zu unterscheiden Vorläuferzellen in reife Barriere bildenden Enterozyten oder Schleimhaut produzierenden Becherzellen. Ausfall dieses Differenzierungsprogramms wird angenommen, tragen zur Epithelbarriere beeinträchtigt, wie es in entzündliche Darmerkrankungen und Kolonkrebs 2,3 beobachtet. Studieren der obigen Prozesse werden Methoden zur Isolierung von Krypta-Basis- und Oberflächenzellpopulationen erforderlich. Mehrere Methoden existieren, die jeweils mit einzigartigen Vorteilen und Nachteilen. Aktuelle Verfahren für die Isolierung von intestinalen Epithelzellen schließen CHelating Mittel sowie mechanische Dissoziation, was in der Isolierung des gesamten Krypten Epithellappen oder Einzelzellen, abhängig von den experimentellen Bedingungen 4,5. Dies sind Hochzinsmethoden, noch Änderungen der interzellulären Signalübertragung haben unter diesen Bedingungen, die nicht der nativen Umgebung 6,7 darstellen können gemeldet. Laser Mikrodissektion ermöglicht die Sammlung von Raum unterschiedlichen Material, sondern erreicht mit niedrigem Molekular Ausbeute 8,9. In menschlichen Dickdarmgewebe, haben Serien horizontal Kryoschneiden Methoden entwickelt worden 10. Allerdings sind murine Schleimhautgewebe unerschwinglich klein für die direkte Verwendung dieser Technik. Beim Menschen Darm Krypta Längen (die ferne zwischen der Krypta-Basis und Oberflächenzellen) in den Dickdarm liegt zwischen ~ 100-1000 &amp; mgr; m 11. Bei Mäusen sind crypt Längen zwischen ~ 50-300 &amp; mgr; m (siehe Abbildung 1A). Die geringe Größe der murine Krypten stellt eine Herausforderung für die isolation dieser beiden Zellpopulationen in einem der vorhandenen Protokolle. Wir beschreiben nun eine kostengünstige, High-Yield-Verfahren zur Isolierung von Krypta-Basis und Oberfläche epithelialen Zellpopulation in murinen Dickdarmgewebe. Gewebe in dieser Weise geerntet kann dann durch eine Reihe von Standard-Downstream-Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung, RT-PCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion) oder Western-Blot analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems, Nussloch</td><td>Deutschland CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ real time PCR Detektor</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Form</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Mikrotomklinge mit hohem Profil</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Deutschland</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM Industrieklingen</td><td>Amerikanische Rasierklingen</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silikon-Elastomer-Basis</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g Nadel</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>Pins zum Sezieren</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper KLF4</td><td>Cell Signaling</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper Sekundäres Alexa-Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 Anti-Kaninchen</td></tr><tr><td>Antikörper Sekundäres HRP-Konjugat</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>Kaninchen/Maus</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs ausgewogener Salzpuffer</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl pH 7,4 150 mM NaCl 1 % NP40 0,25 % Na-Desoxycholat-Primer</td></tr><tr><td>TBP 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Primer TBP 5'</td><td></td><td></td> <td>GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td></tr><tr><td>Primer KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Grundierung KLF4</td> 5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT <td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kryoschneiden verfahren zur mikrodissektion von murine kolonschleimhaut

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Das Dickdarmschleimhautgewebe stellt eine lebenswichtige Barriere für luminale Antigene dar. Diese Barriere besteht aus einer Monoschicht aus einfachen säulenförmigen Epithelzellen. Das Dickomepithel wird dynamisch umgedreht und in der Stammzelle, die die Lieberkühn-Krypten enthält, werden Epithelzellen erzeugt. Vorläuferzellen, die in den Kryptenbasen produziert werden, wandern zur luminalen Oberfläche und durchlaufen einen Prozess der zellulären Differenzierung, bevor sie in das Darmlumen abgegeben werden. Um diese Prozesse auf molekularer Ebene zu untersuchen, haben wir eine einfache Methode zur Mikrodissektion von zwei räumlich unterschiedlichen Regionen der Dickdarmschleimhaut entwickelt; die proliferative Kryptenzone und die differenzierten Oberflächenepithelzellen. Unser Ziel ist es, spezifische Krypten- und Oberflächenepithelzellpopulationen aus der Dickdarmschleimhaut der Maus für die Isolierung von RNA und Protein zu isolieren.

Dickdarmgewebeschnitte wurden für die histologische Beurteilung und H &amp; E Färbung 13 verarbeitet. Eine traditionelle Querschnittsansicht der Schleimhaut ist in 2A gesehen. Basal-Bereiche enthalten die Muscularis externa, vor allem der Kreis muscularis besteht. Ausgehend Richtung der Lumen ist die Muscularis mucosa verständlich neben dem Krypta-Basis Epithelzellen, sind Übergangszellen in der Mitte des Gewebes und schließlich Oberfläche Zellpopulationen konfrontiert das Darmlumen. Die hier beschriebene serielle Schnittverfahren unterhält eine Orientierung, so dass die Längs- und Rund muscularis zuerst angetroffen (2B), gefolgt von der Muscularis mucosa (2C). Beachten Sie die Darstellung der Nicht-Muskel interstitieller Zellen in der linken oberen Ecke des Bildes. Für die unten beschriebenen abwärts Analyse werden Muskelabschnitte verworfen. Die folgenden Abschnitte enthalten Epithelzellen und Zwischengewebe (Lamina propria), Mit Krypta-Basiszellen (2D). Bemerke die Abwesenheit eines zentralen Lumens in den meisten der Krypten, die dunkler erscheinen aufgrund der eng gepackten Kernen. Diese Schichten enthalten die proliferative Fach. Die Übergangs Zellen erscheinen als dicht gepackte Drüsen mit prominenten zentralen Lumen (2E). Schließlich Oberfläche Zellpopulationen eine unregelmäßige Struktur mit Bereichen des epithelialen Mono angesehen en face (2F). Serienschnitte, wie oben beschrieben, können auch für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung und konfokale Mikroskopie verarbeitet werden (wie hier 14 beschrieben). 2G zeigt isolierten Krypten fixiert und in 100% Methanol permeabilisiert und anschließend für Kerne (blau) und der Zell-Zell-junction-Protein Zonula gefärbten occludens 1 (ZO-1, grün). In der traditionellen Schnitte Orientierung kann Krypta und Oberflächenzelle gleichzeitig angezeigt werden (Abbildung 2G </strong&gt;). Beachten Sie, dass die ZO-1 junctional Fleck Linien das Lumen des Darm Krypta. Diese Z0-1 Auskleidung des Lumens können auch in serieller Schnittproben von Übergangszellpopulationen zu erkennen ist, in der Mitte der kreisförmigen Drüsen (Figur 2G). Verbesserte ZO-1-Färbung wird in Oberflächenzellpopulationen (2I und J) zu sehen. Mehrere Differenzierungsfaktoren sind bekannt, in einem räumlich-zeitliche Art und Weise entlang der Krypta-zu-Oberfläche-Achse ausgedrückt werden. Dies schließt den Transkriptionsfaktor Kruppel artigen Faktor 4 (KLF4), die dafür bekannt ist, in der Oberflächenzellpopulationen angereichert werden. Mit herkömmlichen Schneideverfahren wird KLF4 in den Kernen der Lumen zugewandte Oberfläche Zellpopulationen (2k) gefunden. Wir haben daher vermutet, dass KLF4 mRNA würden vorwiegend in der Oberflächenzellpopulationen exprimiert werden. Um dies zu testen, wurden Serienschnitte gesammelt und in Oberflächenwasser, Übergangs- und Krypta-Basis Proben gruppiert. Subsequently, RNA wurde mit Trizol Standardextraktion geerntet, mit einer zusätzlichen Reinigung durch RNeasy Säule und DNAse-Behandlung. RNA wurde aus 5 gesammelt aufeinanderfolgende Abschnitte, die zwischen 5-10 ug Gesamt-RNA pro Probe ergab gesammelt. Diese Proben wurden dann auf semi-quantitative Echtzeit-PCR sowohl KLF4 und eines Referenzgens, TATA Box-Bindungsprotein 1 (TBP-1) (2L) 14 unterzogen. Wie in Figur 2L gezeigt ist, nach der Normalisierung zu TBP-1 wurden Oberflächenzellen bis zu 8-fache der KLF4 mRNA, die in Krypta-Zellen exprimiert wird, auszudrücken. In ähnlicher Weise wurden KLF4 Proteinspiegel festgestellt, dass räumliche Regelung entlang der Krypta-Flächenachse aufweisen. Serielle Schnitte wurden wie oben für 20 min bei 4 ° C beschrieben, und dann in Lysepuffer gepoolt. Dies ergab 200-250 ug Protein pro Probe. Proben wurden dann Analyse durch SDS-PAGE (2M) 15 unterzogen. Wie in Fig 2M gezeigt KLF4 protein Ebenen sind dramatisch in Oberflächenzellpopulationen höher. Die obigen Ergebnisse zeigen die Fähigkeit dieses Protokoll, um große Mengen von Oberflächen Krypta Epithelzellen aus dem murinen Kolonschleimhaut isolieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figur 1: (A) schematische Darstellung murine Colon-Mucosa und äußeren Muskelschichten. Unsere Methode zielt darauf ab, diskrete Oberflächenzelle und Krypta-Basiszellpopulationen durch serielle Kryoschneiden (jeweils 10 &amp; mgr; m) zu sammeln. Die äußeren Muskelschichten werden verworfen. (B) Crypt Höhe entlang der Länge des Dickdarms (Abstand zwischen Krypta-Basis und Deckschichten). Datenpunkte zeigen einzelne Krypta Messungen und Symbole zeigen biologischen Wiederholungen (n = 4). (C) Colon Segmente gesammelt, halbiert, und auf einen Silicium Sezieren Gericht festgesteckt. (D) Ein Gewebe segment etwa 3 cm vom Anus zwischen zu Rasierklingen gedrückt wird und das auf Trockeneis gefroren. (E) Das Gewebe wird dann auf eine vorge nivelliert Oktober Block montiert. (F) Kryoschnitte entnommen und visuell untersucht. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Abb. 2: Repräsentative Daten (A) Dickdarmgewebe mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt im Querschnitt, die die kreisförmige muscularis (cm), die Muscularis mucosa (mm), Krypta-Basiszellen, Übergangszellen und Oberflächenzellen. (B - C) Darmmuskelschichten. (D) Crypt-Basiszellen. Bemerke die Abwesenheit eines zentralen Lumens. (E) Transitional-Zellen. (F) Oberflächenzellen. (G) Immunfluoreszenzfärbung von isolierten Kolonkrypten. ZO-1 (grün) und Zellkerne (blau) sind im Querschnitt beobachtet. (HALLO) ZO-1 und Kernfärbung in Übergangs- und Oberflächenzellen. (J) vergrößerte Ansicht ZO-1-Färbung. (K) KLF4 (grün) in Oberflächenzellpopulationen angereichert. (L) Real-time PCR Beurteilung KLF4 mRNA-Spiegel zwischen den drei Kammern. (M) Western Blot-Analyse von Protein KLF4 Niveau in diesen Zellpopulationen.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von räumlich unterschiedlichen murinen Dickdarmepithel-Oberflächenzellen von den darunter liegenden Krypten-Basiszellen.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei räumlich getrennte Bereiche des Kolons mikrodissektiv zu isolieren: die proliferative Kryptenzone und die differenzierten Oberflächenepithelzellen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Mauskolon entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Gewebe zwischen zwei Metallplatten einzufrieren. Anschließend wird das Gewebe auf einen vorher eingeebten OCT-Block montiert. Der letzte Schritt besteht darin, das Gewebe in einem Kryostaten in 10-Mikrometer-Schritten zu schneiden. Abschließend wird mittels Echtzeit-PCR oder Western Blot der Nachweis von Veränderungen in der Gen- und Proteinausprägung erbracht.Der Vorteil unserer Technik liegt darin, dass sie schnell, kostengünstig und ertragreich ist. Unser Verfahren wird von Christian Garner Schmidt, einem Techniker in unserer Gruppe, demonstriert. Alle Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der Emory University geprüft und genehmigt und entsprechend den Kriterien der National Institutes of Health durchgeführt.Nachdem der Kryostat wie üblich eingerichtet wurde, bringen Sie die Klingen und Spannfutter des Kryostats auf ein Gleichgewicht bei minus 20 Grad Celsius. Füllen Sie dann eine leere Kryoform mit dem optimalen Schneidtemperatur-Verbindungsmaterial und bringen Sie diese ebenfalls auf ein Gleichgewicht bei minus 20 Grad Celsius. Dies dauert ungefähr 30 Minuten.Entfernen Sie das gefrorene OCT aus der Form und befestigen Sie es mit flüssigem OCT am Objekttisch. Setzen Sie den Objekttisch in den Mikrotomarm und lassen Sie das OCT 10 Minuten lang aushärten. Stellen Sie den Kryostaten auf 10 Mikrometer pro Schnitt ein und schaben Sie den OCT-Block so lange ab, bis er eben ist; ziehen Sie anschließend den Mikrotomarm um mehrere Zentimeter vom Messer zurück.Bereiten Sie anschließend pro Probe zwei Rasierklingen mit einer Metallfeile vor, indem Sie die scharfe Kante der Klingen abstumpfen. Entfernen Sie dann den Aluminiumflansch mit einer Pinzette. Bereiten Sie eine 10 cm große Zellkulturschale vor, die zu 50 % mit Silikon gefüllt und mit 10 bis 15 Dissektionsnadeln versehen ist.Geben Sie fünf Milliliter Hank’s Puffer mit Raumtemperatur in die Petrischale, nachdem die Maus gemäß genehmigten Methoden euthanasiert und ein distales Kolonsegment zwischen null und sechs Zentimetern vom Anus entfernt wurde. Schneiden Sie mit einer Schere. Öffnen Sie das Kolon longitudinal und entfernen Sie den fäkalen Inhalt.Fixieren Sie das Gewebe mit der Mukosalfläche nach oben in der Silikon-Präparationschale mit Hank's-Puffer mithilfe von Präparationsnadeln. Dehnen Sie das Gewebe mit den Präparationsnadeln aus. Anschließend lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, um Falten aus dem Gewebe zu entfernen und die Muskelschichten entspannen zu lassen.Wenn das Gewebe geruht hat, entfernen Sie alle Stifte bis auf die Endstifte. Führen Sie eine Rasierklinge unter den gewünschten Gewebeschnittabschnitt ein und gießen Sie dann den Hanks-Puffer ab. Fügen Sie eine weitere Rasierklinge oben hinzu, sodass sich eine Art Sandwich ergibt.Schneiden Sie das Gewebestück und entfernen Sie die Endstifte. Überführen Sie das Gewebe-Rasierklingen-Sandwich in Trockeneis. Lassen Sie das Gewebe fünf bis zehn Minuten lang einfrieren.Nehmen Sie das Rasierklingen-Sandwich auf und erwärmen Sie es leicht, indem Sie einen Finger auf die obere Klinge legen. Trennen Sie das Sandwich und schneiden Sie entlang der Ränder des Gewebestücks. Schneiden Sie ein Gewebestück von etwa 0,5 Zentimetern mal einem Zentimeter aus.Lassen Sie das Gewebe so lange erwärmen, bis das Eis auf der Oberfläche des Gewebes zu schmelzen beginnt. Drücken Sie das Gewebe zu diesem Zeitpunkt schnell und vorsichtig in den OCT-Block. Legen Sie im Kryostat einen Finger auf die Probe.Die Wärmeübertragung ermöglicht es Ihnen, die Klinge zu entfernen, ohne das Gewebe zu beschädigen. Überziehen Sie das Gewebe mit OCT und lassen Sie es fünf Minuten lang equilibrieren. Anschließend schneiden Sie Schnitte mit einer Dicke von 10 Mikrometern. Legen Sie die Schnitte auf einen Objektträger und untersuchen Sie sie visuell, bis die Krypten sichtbar sind. Platzieren Sie die Schnitte in 1,5-Milliliter-Röhrchen oder auf Objektträgern. Dieses Bild zeigt kolikales Gewebe, das mit Hämatoxylin-Eosin in klassischem Querschnitt gefärbt ist, wobei die ringförmige Muscularis mit „cm“ gekennzeichnet ist.Die Muscularis mucosa, gekennzeichnet mit MM, die Zellen der Kryptabasis, Übergangszellen und Oberflächenzellen sind deutlich sichtbar. Dieses Bild zeigt die ringförmige Muscularis nach serieller Schnittführung. Wenn wir uns in Richtung der Oberflächenzellen bewegen, ist die Muscularis mucosa zu erkennen. Dieses Bild zeigt mit h und D gefärbte Zellen der Kryptabasis in höherer Vergrößerung. Beachten Sie das Fehlen eines zentralen Lumens. Hier sind Übergangszellen zu sehen, und dieses Bild zeigt die Oberflächenzellen.Die folgenden Bilder zeigen die immunfluoreszenzfarbliche Färbung isolierter kolonaler Krypten für das Protein der Zell-Zell-Verbindung. Soula Occludin eins oder ZO eins erscheint grün, und Kerne, die blau erscheinen, sind im Querschnitt zu sehen. Die Übergangs- und Oberflächenzellen werden hier nach serieller Schnittführung dargestellt.Mehrere Differenzierungsfaktoren werden entlang der Achse der Kryptenoberfläche in räumlich-zeitlicher Weise exprimiert. Dazu gehört der Transkriptionsfaktor Cripple like Factor Four, der in grün dargestellt ist und in Oberflächenzellpopulationen angereichert ist. Bei Betrachtung im Querschnitt ermöglicht die serielle Schnitttechnik die Beurteilung der KLF-vier-mRNA-Spiegel mittels Echtzeit-PCR zwischen den drei Kompartimenten. Schließlich zeigt dieser Western Blot die Spiegel des KLF-vier-Proteins in diesen Zellpopulationen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikrotomschneiden äußerst gefährlich sein kann, daher seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

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Forschung

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Biologie

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik, um ganze Krypten aus dem Dünndarm einer Maus zu isolieren. Die isolierten ganzen Krypten können zur Vermehrung langlebiger und sich selbst erneuernder 3D-Organoide in vitro verwendet werden.

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Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

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Die Myofibroblasten ist ein einfluss Stromazellen des Magen-Darm-Trakt, die wichtige physiologische Prozesse in normalen und Krankheitszustände regelt. Wir beschreiben eine Technik, die für die Isolierung von primären Myofibroblasten aus Maus und menschlichen Dickdarmgewebe, das für die in vitro Experimente verwendet werden können, ermöglicht.

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Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.

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Fehlende Standardisierung für murine Gewebe Verarbeitung reduziert die Qualität der murinen histopathologische Analyse im Vergleich zu menschlichen Exemplare. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur histopathologischen Untersuchung der murinen entzündet und uninflamed Kolon Gewebe auf die Machbarkeit von Robotersystemen routinemäßig verwendet für die Verarbeitung und Einbettung von humanen Proben durchführen.

Verwendung von Robotersystemen zu verarbeiten und Embed-Kolon Murine Proben für histologische Analysen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Induzieren von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und verfolgen Denkwunden in Echtzeit. Zusätzlich werden Methoden zur Herstellung von Geweben für histologische, immunhistochemische und molekulare Analysen des Wundbettes bereitgestellt.

Durchführen von colonoscopic-Guided Pinch Biopsien bei Mäusen und Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen

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Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Erfahren Sie die Kryoschnitt-Mikrodissektion muriner Kolonschleimhaut zur Isolierung von Krypten- und Oberflächenepithelzellen. Diese schnelle Methode ermöglicht Gen- und Proteinexpressionsanalysen mittels Real-time PCR und Western Blot.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

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