Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei räumlich getrennte Bereiche des Kolons mikrodissektiv zu isolieren: die proliferative Kryptenzone und die differenzierten Oberflächenepithelzellen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Mauskolon entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Gewebe zwischen zwei Metallplatten einzufrieren.

Anschließend wird das Gewebe auf einen vorher eingeebten OCT-Block montiert. Der letzte Schritt besteht darin, das Gewebe in einem Kryostaten in 10-Mikrometer-Schritten zu schneiden. Abschließend wird mittels Echtzeit-PCR oder Western Blot der Nachweis von Veränderungen in der Gen- und Proteinausprägung erbracht.

Der Vorteil unserer Technik liegt darin, dass sie schnell, kostengünstig und ertragreich ist. Unser Verfahren wird von Christian Garner Schmidt, einem Techniker in unserer Gruppe, demonstriert. Alle Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der Emory University geprüft und genehmigt und entsprechend den Kriterien der National Institutes of Health durchgeführt.

Nachdem der Kryostat wie üblich eingerichtet wurde, bringen Sie die Klingen und Spannfutter des Kryostats auf ein Gleichgewicht bei minus 20 Grad Celsius. Füllen Sie dann eine leere Kryoform mit dem optimalen Schneidtemperatur-Verbindungsmaterial und bringen Sie diese ebenfalls auf ein Gleichgewicht bei minus 20 Grad Celsius. Dies dauert ungefähr 30 Minuten.

Entfernen Sie das gefrorene OCT aus der Form und befestigen Sie es mit flüssigem OCT am Objekttisch. Setzen Sie den Objekttisch in den Mikrotomarm und lassen Sie das OCT 10 Minuten lang aushärten. Stellen Sie den Kryostaten auf 10 Mikrometer pro Schnitt ein und schaben Sie den OCT-Block so lange ab, bis er eben ist; ziehen Sie anschließend den Mikrotomarm um mehrere Zentimeter vom Messer zurück.

Bereiten Sie anschließend pro Probe zwei Rasierklingen mit einer Metallfeile vor, indem Sie die scharfe Kante der Klingen abstumpfen. Entfernen Sie dann den Aluminiumflansch mit einer Pinzette. Bereiten Sie eine 10 cm große Zellkulturschale vor, die zu 50 % mit Silikon gefüllt und mit 10 bis 15 Dissektionsnadeln versehen ist.

Geben Sie fünf Milliliter Hank’s Puffer mit Raumtemperatur in die Petrischale, nachdem die Maus gemäß genehmigten Methoden euthanasiert und ein distales Kolonsegment zwischen null und sechs Zentimetern vom Anus entfernt wurde. Schneiden Sie mit einer Schere. Öffnen Sie das Kolon longitudinal und entfernen Sie den fäkalen Inhalt.

Fixieren Sie das Gewebe mit der Mukosalfläche nach oben in der Silikon-Präparationschale mit Hank's-Puffer mithilfe von Präparationsnadeln. Dehnen Sie das Gewebe mit den Präparationsnadeln aus. Anschließend lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, um Falten aus dem Gewebe zu entfernen und die Muskelschichten entspannen zu lassen.

Wenn das Gewebe geruht hat, entfernen Sie alle Stifte bis auf die Endstifte. Führen Sie eine Rasierklinge unter den gewünschten Gewebeschnittabschnitt ein und gießen Sie dann den Hanks-Puffer ab. Fügen Sie eine weitere Rasierklinge oben hinzu, sodass sich eine Art Sandwich ergibt.

Schneiden Sie das Gewebestück und entfernen Sie die Endstifte. Überführen Sie das Gewebe-Rasierklingen-Sandwich in Trockeneis. Lassen Sie das Gewebe fünf bis zehn Minuten lang einfrieren.

Nehmen Sie das Rasierklingen-Sandwich auf und erwärmen Sie es leicht, indem Sie einen Finger auf die obere Klinge legen. Trennen Sie das Sandwich und schneiden Sie entlang der Ränder des Gewebestücks. Schneiden Sie ein Gewebestück von etwa 0,5 Zentimetern mal einem Zentimeter aus.

Lassen Sie das Gewebe so lange erwärmen, bis das Eis auf der Oberfläche des Gewebes zu schmelzen beginnt. Drücken Sie das Gewebe zu diesem Zeitpunkt schnell und vorsichtig in den OCT-Block. Legen Sie im Kryostat einen Finger auf die Probe.

Die Wärmeübertragung ermöglicht es Ihnen, die Klinge zu entfernen, ohne das Gewebe zu beschädigen. Überziehen Sie das Gewebe mit OCT und lassen Sie es fünf Minuten lang equilibrieren. Anschließend schneiden Sie Schnitte mit einer Dicke von 10 Mikrometern.

Legen Sie die Schnitte auf einen Objektträger und untersuchen Sie sie visuell, bis die Krypten sichtbar sind. Platzieren Sie die Schnitte in 1,5-Milliliter-Röhrchen oder auf Objektträgern. Dieses Bild zeigt kolikales Gewebe, das mit Hämatoxylin-Eosin in klassischem Querschnitt gefärbt ist, wobei die ringförmige Muscularis mit „cm“ gekennzeichnet ist.

Die Muscularis mucosa, gekennzeichnet mit MM, die Zellen der Kryptabasis, Übergangszellen und Oberflächenzellen sind deutlich sichtbar. Dieses Bild zeigt die ringförmige Muscularis nach serieller Schnittführung. Wenn wir uns in Richtung der Oberflächenzellen bewegen, ist die Muscularis mucosa zu erkennen.

Dieses Bild zeigt mit h und D gefärbte Zellen der Kryptabasis in höherer Vergrößerung. Beachten Sie das Fehlen eines zentralen Lumens. Hier sind Übergangszellen zu sehen, und dieses Bild zeigt die Oberflächenzellen.

Die folgenden Bilder zeigen die immunfluoreszenzfarbliche Färbung isolierter kolonaler Krypten für das Protein der Zell-Zell-Verbindung. Soula Occludin eins oder ZO eins erscheint grün, und Kerne, die blau erscheinen, sind im Querschnitt zu sehen. Die Übergangs- und Oberflächenzellen werden hier nach serieller Schnittführung dargestellt.

Mehrere Differenzierungsfaktoren werden entlang der Achse der Kryptenoberfläche in räumlich-zeitlicher Weise exprimiert. Dazu gehört der Transkriptionsfaktor Cripple like Factor Four, der in grün dargestellt ist und in Oberflächenzellpopulationen angereichert ist. Bei Betrachtung im Querschnitt ermöglicht die serielle Schnitttechnik die Beurteilung der KLF-vier-mRNA-Spiegel mittels Echtzeit-PCR zwischen den drei Kompartimenten. Schließlich zeigt dieser Western Blot die Spiegel des KLF-vier-Proteins in diesen Zellpopulationen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikrotomschneiden äußerst gefährlich sein kann, daher seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.