Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die funktionelle Regeneration intraspinaler Verbindungen in organotypischen Rückenmarks-Cokulturen mit Hilfe von Mehrelektrodenarrays, sogenannten Meas, zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zwei transversale Rückenmarksschnitte nebeneinander an Messwerten kultiviert werden, um intraspinale Verbindungen zwischen verschiedenen Rückenmarkssegmenten nachzuahmen. In vitro wachsen die Scheiben und verschmelzen innerhalb weniger Tage in vitro entlang der einander gegenüberliegenden Seiten.

Als zweiter Schritt. Die Läsionen werden in der Kultur nach unterschiedlichen Zeitrahmen durchgeführt, was zu einer vollständigen Trennung der Scheiben führt. Anschließend werden die Kulturen für mindestens zwei Wochen im Inkubator belassen.

Um den spinalen Netzwerken Zeit zur Regeneration zu geben, zeigen die Aktivitätsausbrüche zwischen den beiden Schnitten, dass Kulturen, die in jungem Alter läsioniert wurden, ein hohes Potenzial zur funktionellen Regeneration aufweisen, während diese Fähigkeit in Kulturen, die in späteren Jahren läsioniert wurden, deutlich reduziert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Schnitten, die auf Membranen, dissoziierten Kulturen oder in BSAs kultiviert werden, besteht darin, dass die Kombination von Ergon-typischen Kulturen mit Multi-Elektroden-Arrays es uns ermöglicht, funktionelle Aspekte der Regeneration in der Mikroumgebung des Rückenmarks mit direktem experimentellen Zugang zu bewerten. Um mit der Herstellung oder dem Kauf von vorgefertigten Multi-Elektroden-Arrays wie dem hier gezeigten zu beginnen, Sterilisieren Sie die Multi-Elektroden-Arrays, indem Sie sie 30 Sekunden lang zweimal in 100 % Ethanol, einmal in 70 % Ethanol und dann zweimal in destilliertem Wasser spülen. Nach dem Trocknen geben Sie 10 bis 12 Arrays in eine Petrischale aus Glas und schließen Sie den Deckel, nachdem Sie die Arrays 20 Minuten lang bei 120 Grad Celsius autoklaviert haben.

Legen Sie jedes Multi-Elektroden-Array in eine separate sterile 35-Millimeter-Petrischale. Nehmen Sie eine abgekühlte Pipette aus dem Gefrierschrank. Verwenden Sie es, um 150 Mikroliter gekühlte extrazelluläre Matrix-Beschichtungslösung auf die Elektrode zu geben.

Schließen Sie den Deckel der Petrischale und inkubieren Sie das Array eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie nach ca. 10 Minuten die Elektroden auf Luftblasen und entfernen Sie diese vorsichtig mit einem mit Gummi überzogenen Spatel. Überprüfen Sie gegebenenfalls, ob alle Blasen verschwunden sind.

Saugen Sie anschließend die Beschichtungslösung an. Waschen Sie den Löscher mit einem Medium, das für pränatale und embryonale Neuronen optimiert ist, und spülen Sie sie dann zweimal mit destilliertem, sterilem Wasser aus. Lassen Sie sie nach dem Spülen bei Raumtemperatur trocknen.

Unmittelbar nach der Entnahme aus der Mutter werden die enthaupteten E 14-Rattenembryonen in eine Petrischale überführt, die mit steriler, gekühlter Waschlösung gefüllt ist. Führen Sie einen vollständigen Querschnitt mit einem Skalpell über den Hintergliedmaßen und einen weiteren über den vier Gliedmaßen durch und entfernen Sie die Gliedmaßen vom Körper. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt in der Frontebene, um die Eingeweide vom Rückenteil zu trennen, das das Rückenmark enthält.

Übertragen Sie dann die Rückenteile, die das Rückenmark enthalten, nacheinander auf eine Montagescheibe. Schneiden Sie die Nabelschnur mit einem Gewebehacker in einer Dicke von 225 bis 250 Mikrometern ab. Geben Sie dann einen Tropfen Waschlösung auf das gehackte Taschentuch und geben Sie die Scheiben in 35 Millimeter x 10 Millimeter große Petrischale, die mit steriler gekühlter Waschlösung gefüllt sind.

Präpariere das Rückenmark von jeglichem verbleibenden Gewebe auf jedem der Schnitte. Achten Sie darauf, dass die Spinalganglien befestigt bleiben. Übertragen Sie die Scheiben in eine 35 Millimeter x 10 Millimeter große Petrischale, die mit steriler gekühlter Waschlösung gefüllt ist.

Anschließend die Scheiben eine Stunde bei vier Grad Celsius ruhen lassen. Legen Sie eine Petrischale mit einem beschichteten Mikroelektrodenarray unter ein Stereomikroskop. Bringen Sie das Array in den Fokus und in die Mitte.

Ein sechs Mikroliter großes Tröpfchen Hühnerplasma auf dem Elektrodenarray. Schieben Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig zwei Rückenmarksabschnitte mit ihrer ventralen Größe zueinander in das Plasmatröpfchen. Als nächstes bei acht Mikrolitern Thrombin um das Hühnerplasma-Tröpfchen.

Mischen und verteilen Sie dann mit der Pipettenspitze vorsichtig die Mischung aus Hühnchen, Plasma und Thrombin. Kurz bevor das Hühnerplasma-Thrombin-Gemisch zu fadenziehend wird und zu gerinnen beginnt, saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab, verschließen Sie dann die Petrischale und stellen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Stellen Sie die Kammer für etwa eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 10 Mikroliter Nährmedium in die Probe.

Verschließen Sie die Petrischale und stellen Sie sie für weitere 45 Minuten in den Inkubator. Legen Sie dann jede der Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppen in ein Rollenrohr und fügen Sie drei Milliliter Nährmedium hinzu. Schließen Sie den Deckel fest und setzen Sie das Rollrohr in die Rolltrommel ein.

Drehen Sie die Trommel mit ein bis zwei UVP M im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer sterilen Pinzette mit Gummispitze. Entfernen Sie die Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppen aus dem Rollenrohr und legen Sie sie unter einem Stereomikroskop in eine Petrischale. Bringen Sie das Gewebe in den Fokus und vergewissern Sie sich, dass die beiden Scheiben verschmolzen sind.

Halten Sie dann die Baugruppe ruhig und platzieren Sie eine Skalpellklinge in der Rille des Mehrelektrodenarrays. In der Nähe der Gewebescheiben. Halten Sie das Skalpell eher waagerecht und heben Sie dann den Skalpellgriff nach oben.

Lassen Sie die Skalpellklinge jedoch so in der Rille des Arrays bleiben, dass die Klinge von der Basis bis zur Spitze rollt und das Gewebe durchschneidet und die Rille bedeckt. Trennen Sie ggf. Gewebereste mit einer 25-Gauge-Nadelspitze, arbeiten Sie nur im Bereich innerhalb der Rille und berühren Sie nicht die zarten Kanten. Setzen Sie die Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppen wieder in das Rollrohr ein und geben Sie drei Milliliter frisches Nährmedium zu den Kulturen.

Setzen Sie dann das Rollrohr wieder auf die Rolltrommel im Inkubator bei 37 Grad Celsius. Montieren Sie eine Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppe in einer Aufnahmekammer und tragen Sie etwa 500 Mikroliter extrazelluläre Lösung auf das Array auf. Montieren Sie dann die Baugruppe auf das Mikroskop.

Warten Sie 10 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat, und zeichnen Sie dann 10 Minuten lang die grundlegende spontane Aktivität jeder der Aktivitätserkennungselektroden auf. Wiederholen Sie die Aufnahmen insgesamt zweimal, um stabile extrazelluläre Bedingungen zu gewährleisten. Tauschen Sie die extrazelluläre Lösung nach jeder Aufnahmesitzung aus, falls gewünscht.

Enthemmen Sie das Netzwerk durch Auftragen einer extrazellulären Lösung, die ein Mikromolar von strikt neun und 10 Mikromolar Gazin enthält, und warten Sie mindestens zwei Minuten, bevor Sie die elektrische Aktivität aufzeichnen, um das Potenzial für eine funktionelle Wiederherstellung der aus dem Rückenmark von E 14 Rattenembryonen gewonnenen Cokulturen zu untersuchen. Die Läsionen wurden in einem Zeitfenster von acht bis 28 Tagen in vitro durchgeführt. Zwei bis drei Wochen später wurde die spontane neuronale Aktivität aufgezeichnet.

Mit dem Multi-Elektroden-Array werden die Rohdaten dann in Rasterdiagramme umgewandelt, gefolgt von Netzwerkaktivitätsdiagrammen, um die Gesamtaktivität separat pro Seite in jeder Schicht zu visualisieren. Die spontane Aktivität ist in der Regel in Schüben organisiert, hier zeigen sich unter Enthemmungslosigkeit, Scheiben, die in jungen Jahren getrennt wurden, erscheinen hier als funktionell verbunden. Diejenigen, die in einem höheren Alter getrennt wurden, erscheinen jedoch asynchron.

Anhand dieser Informationen kann die Anzahl der synchronisierten Bursts zwischen Slices in verschiedenen Altersstufen bestimmt und visualisiert werden, wie hier gezeigt. Andere Methoden, wie z.B. die immunhistochemische Färbung, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Zelltypen zur funktionellen Verbindung zwischen den beiden spinalen Quartscheiben beitragen.