Name: Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung antiviraler Verbindungen durch ein frühes Virus-Eindringungs-Assay mit Luciferase-Reporter-Viren. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Wirkstoffen, die spezifische Schritte der viralen Eintrittsphase hemmen.

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Diese Studie wird mit Mitteln des Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) und des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3) unterstützt.

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren, die Zellkultur und Virusinfektion sind in zertifizierten biologischen Sicherheit Hauben, die für die Sicherheitsstufe der Proben entsprechende gehandhabt werden durchgeführt. Für den Zweck der Beschreibung der Protokolle wird Gaussia-Luciferase-Reporter-markierten HCV als Modellvirus 32 benutzt. Im Zusammenhang mit den repräsentativen Ergebnissen, sind die Verbindungen chebulagic Säure (CHLA) und Punicalagin (PUG) als Kandidaten Virostatika, die virale Glycoprotein Wechselwirkungen mit Zelloberflächen Glycosaminoglycane Target während der frühen viralen Eintritt Stufen 31 verwendet. Heparin, das dafür bekannt ist, mit der Eingabe von vielen Viren 30,31,33,34 eingreifen, wird als positive Kontrolle der Behandlung in diesem Kontext verwendet wird. Für grundlegende Hintergrund Virologie Techniken Vermehrung von Viren, die Bestimmung der Virustiter und die Expression von infektiösen Dosis in plaquebildenden Einheiten (PFU), Fokus-bildenden Einheiten (FFU) oder Multiplizität der Infektion (MOI) ist, worin Re der Leserübertragen auf Bezugs 35. Der vorherigen Beispiele und Viren in den repräsentativen gezeigten Ergebnisse verwendet optimierten Bedingungen wird der Leser auf die in Tabelle 1, 1A und 2A aufgeführten Referenzen 30-32,36-39 sowie Einzelheiten bezeichnet. 1. Zellkultur, Compound Vorbereitung, und die Verbindung Zytotoxizität <ol><li> Wachsen die jeweilige Zelllinie für die Virusinfektion zu analysierende System (Tabelle 1). Für HCV, wachsen die Huh-7,5-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 200 U / ml Penicillin G, 200 ug / ml Streptomycin und 0,5 ug / ml Amphotericin B. </li><li> Bereiten Sie die Testverbindungen und Kontrollen unter Verwendung ihres jeweiligen Lösemittel: beispielsweise aufzulösen CHLA und PUG in Dimethylsulfoxid (DMSO); vorzubereiten Heparin in sterilem doppelt destilliertem Wasser. Für alle nachfolgenden Verdünnungen verwenden Kulturmedien. Hinweis: Die endgültige concentRation von DMSO in der Testverbindung Behandlungen ist weniger als 1% in den Experimenten; 1% DMSO als ein negativer Kontrollbehandlung in den Tests zum Vergleich eingeschlossen. </li><li> Bestimmung der Zytotoxizität der Testverbindungen (zB CHLA und PUG) auf die Zellen für die Virusinfektion durch die Verwendung eines Zell-Lebensfähigkeit Bestimmen Reagens wie XTT (2,3-Bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) carbonyl] -2H-tetrazolium Hydroxid): <ol><li> Für HCV, Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten. </li><li> Gelten DMSO-Kontrolle (1%) oder steigenden Konzentrationen der Testverbindungen CHLA und PUG (ex. 0, 10, 50, 100, und 500 &amp; mgr; M) zu den Kulturvertiefungen in dreifacher Ausführung. </li><li> Bei 37 ° C für 72 Stunden und wirf dann das Medium in der Platte und waschen Sie die Zellen mit 200 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zweimal. </li><li> 100 l assaying Lösung aus dem XTT-basierte in vitro-Toxikologie-Assay-Kit, um jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für weitere 3 h auf XTT ermöglichen Formazan-Produktion. </li><li> Die Optische mit einem Mikroplattenleser bei einer Testwellenlänge von 492 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm. </li><li> Der prozentuale Anteil der überlebenden Zellen nach der folgenden Formel: Zelllebensfähigkeit (%) = An / Wie × 100%, wobei &#39;An&#39; und &#39;Wie&#39; beziehen sich auf die Absorption der Testverbindungen und die Lösungsmittelkontrolle (ex 1% DMSO. ) Behandlungen sind. Bestimmung der Konzentration von 50% zelluläre Zytotoxizität (CC 50) der Testverbindungen aus einer analytischen Software wie GraphPad Prism nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li></ol> 2. Auslesen der Virusinfektion Hinweis: Das Auslesen der Virusinfektion hängt von der Virus-System verwendet und können Methoden wie Plaque-Assays oder mea beinhaltensuring Reporter Signale von Reporter-markierten Viren. Methode für das Erfassen Reporter-HCV-Infektion auf der Basis der Luciferase-Reporteraktivität wird nachstehend beschrieben. <ol><li> Sammeln der Überstände aus den infizierten Vertiefungen und Klärung bei 17.000 xg in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Mix 20 ul Testüberstand wurde in 50 ul Luciferase-Substrat aus der Gaussia-Luciferase-Assay-Kits und direkt mit einem Luminometer gemessen nach den Angaben des Herstellers. </li><li> Auszudrücken HCV Infektiosität als log 10 der relativen Lichteinheiten (RLU) zum Bestimmen virale Inhibition (%) und die Berechnung der 50% effektive Konzentration (EC 50) der Testverbindungen gegen die HCV-Infektion unter Verwendung von Algorithmen von GraphPad Prism Software gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 3. Vireninaktivierung Assay Hinweis: Beispiele für Inkubationszeit und Virusdosis für verschiedene Viren einwieder in 1A aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus kann auch durch Erhöhung der MOI / PFU getestet werden. <ol><li> Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten. </li><li> Inkubieren Sie die Testverbindungen oder Kontrollen (Endkonzentrationen: CHLA = 50 &amp; mgr; M; PUG = 50 &amp; mgr; M; Heparin = 1.000 ug / ml; DMSO = 1%) mit den HCV-Partikel bei 37 ° C (1A, &quot;Long-Term &#39; ) in einem Verhältnis 1: 1. Beispielsweise auf einen 100 &amp; mgr; Virusinokulum enthaltend 1 x 10 4 FFU wird mit 100 ul einer 100 uM CHLA Arbeitsverdünnung; Dies ergibt CHLA Behandlung bei einer Endkonzentration von 50 uM. </li><li> Verdünnt das virus-Wirkstoff-Mischung &quot;sub-therapeutische&quot; (unwirksam) Konzentration der Testverbindungen. Zum Beispiel ist die unwirksame Konzentration CHLA und PUG gegen HCV bei 1 &amp; mgr; M 31; deshalbdies erfordert eine 50-fache Verdünnung des Virus-Wirkstoff-Mischung, die mit 9,8 ml Basalmedium (Zellkulturmedium mit 2% FBS) erreicht werden kann. Anmerkung: Die Verdünnung auf subtherapeutische Konzentration verhindert erhebliche Wechselwirkung zwischen der Testverbindungen und der Oberfläche der Wirtszelle und ermöglicht die Untersuchung der Wirkung der Behandlung auf den zellfreien Virionen. Beachten Sie, dass diese Verdünnung hängt von der antivirale Dosis-Antwort der Testverbindungen gegen die insbesondere virale Infektion und vor der Durchführung dieses bestimmten Test 31 ermittelt. </li><li> Zum Vergleich, mischen das Virus mit den Testverbindungen und sofort zu verdünnen (kein Inkubationszeit), um Unter therapeutische Konzentration vor der Infektion (1A, &quot;Short-Term). </li><li> Zugabe von 100 ul der verdünnten HCV-Wirkstoff-Mischung auf die Huh-7,5 Zellmonolayer (die Virusmenge ist nun auf 1 x 10 2 FFU; final MOI = 0,01) und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C viral, damitAdsorption. </li><li> Nach der Infektion, entfernen Sie die Inokula verdünnt und vorsichtig waschen die Vertiefungen zweimal mit 200 ul PBS. Hinweis: Führen Sie die wäscht vorsichtig, um zu vermeiden, heben Sie die Zellen. </li><li> Gelten 100 ul Basalmedium in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 72 Std. </li><li> Analyse des resultierenden Infektion durch Untersuchung des Überstandes auf Luciferase-Aktivität wie in &#39;2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion. </li></ol> 4. Viral Befestigung Assay Hinweis: Beispiele für Inkubationszeit und Virusdosis für verschiedene Viren sind in 2A aufgeführt, &quot;Anhang&quot;. Höhere Konzentrationen des Virus kann auch durch Erhöhung der MOI / PFU getestet werden. <ol><li> Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten. </li><li> Pre-Chill die Zellmonoschichten in Platten bei 4 ° C for 1 Std. </li><li> Co-Behandlung der Zellen mit HCV Inokulum (MOI = 0,01) und die Testverbindungen oder Kontrollen (Endkonzentrationen: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; Heparin = 1,000 &amp; mgr; g / ml; DMSO = 1%) bei 4 ° C für 3 Std. Zum Beispiel, um eine 90 &amp; mgr; l Virusinokulum mit 1 x 10 2 FFU, fügen Sie 10 ul einer 500 uM CHLA Arbeitsverdünnung; Dies ergibt CHLA Behandlung bei einer Endkonzentration von 50 uM und eine Infektion durch HCV bei MOI = 0,01 auf der Zell-Monoschicht. Hinweis: Es ist wichtig, für die Durchführung des Experiments bei 4 ° C, da es eine Virusbindung, sondern schließt Eintrag, der am effizientesten bei 37 ° C auftritt. Führen die Zugabe des Virus und die Testverbindungen auf Eis und der anschließenden Inkubation in einem 4ºC Kühlraum, um sicherzustellen, dass die Temperatur auf 4 ° C gehalten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sich leicht die Zellmonoschicht mit 200 ul eiskaltem PBS zweimal. Hinweis: Führen Sie die wäscht vorsichtig, um zu vermeiden, heben Sie die Zellen &lt;./ li&gt; <li> Gelten 100 ul Basalmedium in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 72 Std. </li><li> Analyse des resultierenden Infektion durch Untersuchung des Überstandes auf Luciferase-Aktivität wie in &#39;2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion. </li></ol> 5. Viral Entry / Fusion Assay Hinweis: Beispiel für Inkubationszeiten und Virusdosis für verschiedene Viren sind in 2A &#39;Entry / Fusion &quot;aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus kann auch durch Erhöhung der MOI / PFU getestet werden. <ol><li> Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten. </li><li> Pre-Chill die Zellmonoschichten in Platten bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Infizieren die Zellen mit HCV (MOI = 0,01) bei 4 ° C für 3 Stunden. Verwenden Sie beispielsweise eine 100 ul Virusinokulum mit 1 x 10 2 FFU. Hinweis: Führen Sie die addition des viralen Inokulum auf Eis und der anschließenden Inkubation in einem 4ºC Kühlraum, die Temperatur auf 4 ° C, die die virale Bindung jedoch keine Ausgabe ermöglicht aufrechtzuerhalten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sich leicht die Zellmonoschichten zweimal mit 200 ul eiskaltem PBS. Hinweis: Führen Sie die wäscht vorsichtig, um zu vermeiden, heben Sie die Zellen. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit den Testverbindungen oder Kontrollen (Endkonzentrationen: CHLA = 50 &amp; mgr; M; PUG = 50 &amp; mgr; M; Heparin = 1.000 ug / ml; DMSO = 1%) und bei 37 ° C für 3 Stunden. Fügen Sie beispielsweise 10 &amp; mgr; l einer 500 &amp; mgr; M CHLA Arbeitsverdünnung auf 90 ul Medium, zu mischen und zu behandeln, die Brunnen; Dies ergibt CHLA Behandlung bei einer Endkonzentration von 50 uM. Hinweis: Der Wechsel von 4 ° C bis 37 ° C ermöglicht nun den Viruseintritt / Fusion Veranstaltung und ermöglicht somit Beurteilung der Testverbindungen &quot;-Effekt an diesem Schritt. </li><li> Saugen Sie das Arzneimittel enthaltende Überstand und entfernen Sie nicht internalisiertextrazellulären Viren durch Waschen mit 200 ul Citratpuffer (50 mM Natriumcitrat, 4 mM Kaliumchlorid, pH 3.0) oder PBS. Gelten 100 ul des Grundmediums vor der Inkubation bei 37 ° C für 72 Std. </li><li> Analyse des resultierenden Infektion durch Untersuchung des Überstandes auf Luciferase-Aktivität wie in &#39;2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

In diesem Bericht wurden die Methoden zur Identifizierung und Bewertung antiviraler Wirkstoffe beschrieben, die auf einem mechanistischen Ansatz zur Dissektion der frühen viralen Eintrittsereignisse basieren. Insbesondere ermöglichten uns die Assays, die Wirkung von Testverbindungen auf freie Viruspartikel, die Virusanheftung und den Viruseintritt/die Virusfusion zu untersuchen. Es wurden kritische Schritte eingeleitet, um die Wirkung des Arzneimittels auf das spezifische Stadium des frühen Viruseintritts eindeutig zu bewerten. Beim "Virusinaktivierungs-Assay" verhindert beispielsweise die Verdünnung des Virus-Wirkstoff-Gemisches auf eine subtherapeutische Konzentration eine signifikante Wechselwirkung zwischen der Prüfsubstanz und der Wirtszelloberfläche, indem das Arzneimittel "titriert" wird. Dies stellt sicher, dass die beobachtete hemmende Wirkung auf die nachfolgende Infektion der Wirtszelle auf eine direkte Wechselwirkung zwischen der Prüfsubstanz und den zellfreien Virionen zurückzuführen ist und nicht auf eine Wirkung der Prüfsubstanz auf die Wirtszellmembran oder membranassoziierte Moleküle, einschließlich viraler Rezeptoren30. In ähnlicher Weise ist die Temperaturverschiebung zwischen 4 °C (die die Virusbindung, aber nicht den Eintritt des Virus ermöglicht) und 37 °C (die den Viruseintritt/die Virusfusion erleichtert) im "Viral Attachment Assay" und "Viral Entry/Fusion Assay" entscheidend, um die Wirkung der Testverbindung auf jedes dieser spezifischen Ereignisse zu bestimmen. Dies ist aufgrund der Temperaturempfindlichkeit der behüllten Viren während dieser Schritte in der Infektionmöglich 24-29. Es ist daher wichtig, dass die Assays bei der angegebenen Temperatur durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Zum Beispiel, indem man das Experiment auf Eis durchführt, um es bei 4 °C zu halten, und indem man die Probe direkt in einen 37 °C Inkubator für die Temperaturverschiebung legt. Darüber hinaus trägt die Verwendung von negativen (z. B. DMSO-Lösungsmittel für die Arzneimittelzubereitung) und positiven (z. B. Heparinbehandlung) Kontrollen dazu bei, die Genauigkeit der Assays weiter zu bestimmen. Der Nutzen und die Anwendbarkeit solcher Methoden wurden in vielen antiviralen Studien nachgewiesen26,30,31,40,41. Es ist zu beachten, dass Heparin zwar als Kontrolle für alle drei Assays im Kontext der repräsentativen Ergebnisse enthalten ist, aber in der Regel die anfängliche Virusbindung und nicht den anschließenden Fusions-/Eintrittsschritt blockiert (wie in den Daten in Abbildung 2 dargestellt). Es könnten auch zusätzliche Kontrollen verwendet werden, wie z. B. neutralisierende Antikörper, die gegen das Virus gerichtet sind (für den Virusinaktivierungsassay), Antikörper, die die Zelloberflächenrezeptoren für das Virus maskieren (für den viralen Attachment-Assay) und Membranfusionshemmer (für den viralen Fusions-/Eintrittsassay). 
Die in diesem Bericht beschriebenen Assays, die spezifisch für die frühen Stadien der Virusinfektion sind, sind im Hinblick auf die Anwendung als sekundäre Tests nützlich, um den Wirkmechanismus von Arzneimittelkandidaten aus primären Screenings zu charakterisieren, die typischerweise auf die Virusinfektion breiter abzielen. Alternativ könnten sie auch in primäre Screens eingebaut werden, wenn man speziell nach Inhibitoren des frühen Viruseintritts sucht, einschließlich Virusinaktivierungsmitteln, viralen Attachment-Antagonisten und Inhibitoren des Viruseintritts/der Virusfusion. In diesem Fall ermöglicht ihr Einsatz eine gezieltere und präzisere Screening-Analyse zur Identifizierung von mechanismusspezifischen antiviralen Kandidaten, was wiederum die nachgelagerte Arzneimittelentwicklung beschleunigen würde. 
Die Verwendung zellbasierter Assays zur Identifizierung antiviraler Wirkstoffe bietet mehrere wichtige Vorteile im Vergleich zu biochemischen Assays, einschließlich der Aufdeckung potenzieller Off-Target-Effekte (wie Zytotoxizität) und der Erhöhung der physiologischen Relevanz für die Bioaktivität der Testmittel42. Diese Fragen sind wichtige Überlegungen für die Entscheidung, ob ein Wirkstoffkandidat für die Fortsetzung in nachfolgenden Phasen der Arzneimittelentwicklung von Wert ist. In ähnlicher Weise ermöglichen die in diesem Bericht beschriebenen frühen Viruseintritts-spezifischen Assays die Untersuchung der Arzneimittelwirkung auf das unterschiedliche virale Eintrittsstadium auf zellulärer Ebene und insbesondere im Kontext einer authentischen Virusinfektion in vitro. Die Ergebnisse solcher Assays würden daher dazu beitragen, die antivirale Wirksamkeit der Testsubstanzen besser vorherzusagen und potenziell unerwünschte Off-Target-Effekte gegen die Wirtszelle zu identifizieren. Eine mögliche Einschränkung besteht jedoch darin, dass ein in vitro zellbasierter Assay den tatsächlichen in vivo Eintrittsschritt im Zusammenhang mit einer natürlichen Virusinfektion möglicherweise nicht vollständig widerspiegelt. Nichtsdestotrotz dienen die in diesem Protokoll vorgestellten Assays als analytische Plattform für die mechanismusbasierte Identifizierung und Bewertung neuartiger antiviraler Wirkstoffe.
Die Entwicklung von Reporterviren oder Reporterzellsystemen zur Quantifizierung des Ausmaßes der Virusinfektion hat das zellbasierte Screening und die Bewertung antiviraler Wirkstoffe erheblich erleichtert. Beispiele hierfür sind die Verwendung von rekombinanten Viren, die ein Reportergen tragen, oder mittels rekombinanter menschlicher Zelllinien, die ein Reportergen enthalten, das von dem spezifischen Viruspromotorgesteuert wird 31,43. In diesem Bericht kann die Infektion durch Luciferase-markiertes HCV leicht überwacht werden, indem das Reportersignal quantifiziert wird, was die Datenanalyse erleichtert. Durch die Einbeziehung dieser nützlichen reporterbasierten Werkzeuge können die hier beschriebenen frühen Viruseintrittsassays im Wesentlichen in das Hochdurchsatzformat für das mechanismusbasierte Screening kleiner Molekülbibliotheken angepasst werden.
Abschließend wurde ein Protokoll für Assays zur Dissektion des frühen Viruseintritts als Mittel zur Identifizierung und Bewertung mechanismusspezifischer antiviraler Verbindungen beschrieben. Solche Assays wären nützlich für die Entdeckung neuartiger Antagonisten/Inhibitoren für den Viruseintritt und würden dazu beitragen, den Anwendungsbereich antiviraler Wirkstoffe für die Entwicklung als prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen zu erweitern.

Virusinfektionen sind eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und eine wesentliche Ursache für epidemische Krankheiten, Morbidität und Todesfälle weltweit. Zu den spezifischen Methoden der Kontrolle von Virusinfektionen gehören die Entwicklung von Impfstoffen und antivirale Therapien. Während sich die Impfstoffbemühungen bei der Immunisierung gegen mehrere Viren als erfolgreich erwiesen haben, gibt es bei vielen viralen Krankheitserregern keinen schützenden Impfstoff, darunter das Dengue-Virus (DENV), das humane Cytomegalievirus (HCMV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das humane Immundefizienzvirus (HIV) und das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV)1-5. Virostatika hingegen spielen eine wichtige Rolle bei der Behandlung dieser Virusinfektionen, wenn prophylaktische Impfstoffe nicht verfügbar sind. Bisher stehen jedoch nur wenige zugelassene und kostengünstige antivirale Medikamente zur Verfügung, verglichen mit der Anzahl der viralen Krankheitserreger, die die öffentliche Gesundheit bedrohen. Noch wichtiger ist, dass die Situation aufgrund der Zunahme des weltweiten Reiseverkehrs und der raschen Urbanisierung durch das Risiko von Epidemieausbrüchen durch neu auftretende/wieder auftretende Virusinfektionen verschärft wird, die in nicht-indigene Gebiete eingeschleppt werden6. Jüngste Ausbrüche, die durch das Virus des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS), Influenzaviren (H1N1, H5N1, H3N2 und H7N9), DENV, das West-Nil-Virus (WNV), das Masernvirus (MV), das Virus des Middle East Respiratory Syndrome (MERS) und das Ebola-Virus6-12 verursacht wurden, gehören zu den Beispielen, die die Notwendigkeit der Entwicklung von antiviralen Medikamenten widerspiegeln, wenn Immunisierungen und/oder Therapeutika nicht verfügbar sind. Darüber hinaus besteht immer ein potenzielles Risiko, bei den derzeit eingesetzten antiviralen Medikamenten arzneimittelresistente Infektionen zu erzeugen. Daher ist die kontinuierliche Entwicklung und Erweiterung des Anwendungsbereichs von antiviralen Medikamenten auf diese neu auftretenden/wieder auftretenden Virusinfektionen notwendig, um bessere Managementstrategien bereitzustellen und die öffentliche Gesundheit zu schützen.
Die meisten antiviralen Therapien bestehen aus direkt wirkenden antiviralen Medikamenten (DAAs), die auf ein spezifisches virales Protein oder einen Cofaktor abzielen, der wichtige Schritte im viralen Lebenszyklus vermittelt. Zum Beispiel hemmt das Nukleosidanalogon Aciclovir die Herpesvirus-DNA-Polymerase, die Proteaseinhibitoren Boceprevir und Telaprevir antagonisieren das HCV NS3, und Oseltamivir und Zanamivir sind Neuraminidasehemmer, die die Freisetzung von Influenzaviruspartikeln aus infizierten Zellen blockieren13-15. Es gibt jedoch nur sehr wenige zugelassene Viruseintrittsinhibitoren, darunter Enfuvirtid, das auf HIV gp41 abzielt, um die Fusion zu verhindern, und Maraviroc, das den HIV-Co-Rezeptor CCR5 blockiert und dadurch den Eintritt des Virus verhindert16. Die Erforschung neuartiger Antagonisten/Inhibitoren für den Viruseintritt könnte dazu beitragen, zusätzliche Therapeutika für den prophylaktischen oder therapeutischen Einsatz bereitzustellen, z. B. in Kombination mit anderen Virostatika mit einem anderen Wirkmechanismus zur besseren Behandlung von Virusinfektionen17-19. 
Die Identifizierung von Virostatika kann ein strukturgesteuertes Wirkstoffdesign und eine auf dem Screening von Wirkstoffkandidaten basierende Strategie beinhalten. Verfahren zur Beurteilung der antiviralen Aktivität von Prüfmitteln umfassen biochemische Assays der enzymatischen Aktivität und die Bewertung durch zellbasierte Systeme20-23. In zellbasierten Systemen kann der virale Lebenszyklus in verschiedene Infektionsstadien unterteilt werden, wie z. B. Eintrittsereignisse (Anheftung, Fusion, Enthüllung), die Replikationsphase (virale Genomreplikation und Proteintranslation) und den Virionenausgang (Assemblierung, Reifung und Freisetzung). Da die Assays angepasst werden können, um jedes spezifische Stadium mit verschiedenen Werkzeugen und Methoden zu untersuchen, ermöglicht dieser Ansatz die Identifizierung/Untersuchung potenzieller antiviraler Wirkstoffkandidaten mit einem spezifischen Wirkmechanismus, der auf das jeweilige analysierte Stadium abzielt. Um beispielsweise die Wirkung des Arzneimittels spezifisch auf die freien Viruspartikel vor der Bindung an die Wirtszelle zu analysieren, kann ein "viraler Inaktivierungsassay" durchgeführt werden. Bei diesem Assay wird das Virus mit dem Testmedikament inkubieren gelassen und dann verdünnt, um das Medikament auszutitrieren, bevor es eine Zellmonoschicht infiziert. Zusätzliche Schritte wie die Anheftung des Virus und die Eintritts-/Fusionsstadien können ebenfalls einzeln analysiert werden, indem die Temperatur während der Infektion verschoben wird. Bei vielen behüllten Viren wird der Viruseintritt/die Virusfusion an der Wirtszellmembran bei 37 °C stark erleichtert, ist aber bei 4 °C typischerweise ausgeschlossen, was die Virusbindung24-29 nicht beeinflusst. Schließlich könnte der Einsatz von Reporterviren oder Zellsystemen diese Studien erleichtern und eine Hochdurchsatzanalyse ermöglichen.
Wir haben zuvor den zellbasierten Ansatz verwendet und den frühen Eintritt verschiedener behüllter Viren für die Untersuchung antiviraler Wirkstoffe analysiert, die möglicherweise den Viruseintritt antagonisieren30,31. Hierin werden die verschiedenen verwendeten Verfahren, einschließlich der viralen Inaktivierung, der viralen Bindung und der Viruseintritts-/Fusionsassays, beschrieben.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>In-vitro-Toxikologie-Assay-Kit, XTT-basiertes</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat, Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

frühe das eindringen des virus-assays für die ermittlung und bewertung von antiviralen verbindungen

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Zellbasierte Systeme sind nützlich für die Entdeckung von antiviralen Wirkstoffen. Die Analyse des viralen Lebenszyklus, insbesondere der frühen Eintrittsstadien, ermöglicht einen mechanistischen Ansatz zur Identifizierung und Bewertung von antiviralen Wirkstoffen, die auf bestimmte Schritte des Viruseintritts abzielen. In diesem Bericht werden die Methoden zur Untersuchung der viralen Inaktivierung, der viralen Bindung und des Viruseintritts/der viralen Fusion als antivirale Assays für solche Zwecke beschrieben, wobei das Hepatitis-C-Virus als Modell verwendet wird. Diese Assays sollten nützlich sein, um neuartige Antagonisten/Inhibitoren für den frühen Viruseintritt zu entdecken und den Anwendungsbereich antiviraler Wirkstoffkandidaten für die weitere Arzneimittelentwicklung zu erweitern.

In Abbildung 1 wurde die &quot;Virus-Inaktivierung Test&quot; durchgeführt, um zu prüfen, ob zwei bestimmte natürliche Verbindungen CHLA und PUG könnten die verschiedenen umhüllten Viren in zellfreien Zustand zu inaktivieren und zu verhindern nachfolgende Infektion. Die Zytotoxizität und antivirale Dosis-Antwort dieser Verbindungen vor der Durchführung der mechanistische Studie 31 bestimmt. Die Viren wurden mit den Testverbindungen vorbehandelt und anschließend die Virus-Wirkstoff-Mischungen wurden zu subtherapeutischen Konzentrationen vor der Impfung auf die jeweilige Zellmonoschicht für jede Virus-System verdünnt. Wie in 1 gezeigt, sowohl CHLA und PUG schienen mit den zellfreien Virionen interagieren, was irreversible Effekte, die die Zell-Monoschicht von der nachfolgenden Infektion geschützt. Die beiden Testverbindungen erreicht eine nahezu 100% ige Hemmung gegen HCMV, HCV und DENV-2, während eine 60 bis 80% Block wurde gegen MV und RSV beobachtet. Diese Ergebnisse suggest, dass CHLA und PUG haben direkten Einfluss auf diese freie Viruspartikel durch Inaktivierung von ihnen und zur Neutralisierung ihrer Infektiosität. In 2 wurden die Befestigung und Ein- / Fusion-Assays durchgeführt, um die Wirkung von CHLA und PUG gegen diesen frühen Viruseintritt bezogene Ereignisse von HCMV, HCV, DENV-2, MV und RSV erkunden. Sowohl CHLA und PUG wirksam verhindert die Bindung der untersuchten Viren auf die jeweilige Wirtszelle, wie durch Hemmung auf die resultierende Virusinfektion (Abbildung 2, &quot;Anhänge&quot;: hellgraue Balken) gezeigt. Die inhibitorische Wirkung auf die Virus Befestigung von beiden Verbindungen war ähnlich gegen HCMV (2B), HCV (2C), DENV-2 (2D) und RSV (2F), im Bereich von 90 - 100%. Andererseits erschien PUG wirksamer als CHLA gegen MV Bindung (2E) zu sein, wobei der Hemmungsrate von twO-Verbindungen zwischen 50 - 80%. Die Kontrollbehandlung Heparin, von dem bekannt ist, um den Eintritt von vielen Viren, inhibierte auch die Anbringung von HCMV, DENV-2, RSV, ad MV blockieren, war aber weniger wirksam gegen HCV. Die darauf folgende &#39;Viruseintritt / Fusionstest &quot;untersucht, ob CHLA und PUG während der Viruseintritt / Schmelzphase behielten ihre Aktivität (Abbildung 2,&quot; Entry / Fusion &quot;: dunkelgraue Balken). Auch hier sowohl CHLA und PUG wurden beobachtet, um das Eindringen des Virus / Fusionsschritt der untersuchten Viren (2B - F) wirksam zu beeinträchtigen, was zu einer 50 bis 90% schützende Wirkung auf die jeweilige Zellmonolayer. Heparin auch potent gehemmt Eintrag / Fusion in DENV-2 und RSV-Infektionen, war aber gegen HCMV, HCV, und MV (&lt;40% ige Hemmung im Durchschnitt) weniger wirksam. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Zellen-Art </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td> Huh-7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Wirtszelltyp für die virale Infektion der Zelltyp für jeden der repräsentativen Ergebnisse beschriebenen viralen Infektionssystem verwendet wird, angegeben. Weitere Einzelheiten zu den Zellen in Referenz 31 gefunden werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> Abbildung 1. Inaktivierung von Virusinfektionen durch die Testverbindungen CHLA und PUG Verschiedene Viren wurden mit den Testverbindungen für einen langen Zeitraum behandelt werden. (1,5 inkubiert - 3 Stunden vor der Titration, hellgraue Balken) oder kurzen Zeitraum (sofort verdünnt; dunkelgrau bar) bei 37 ° C, bevor eine Verdünnung auf subtherapeutischen Konzentrationention und anschließender Analyse der Infektion auf den jeweiligen Wirtszellen. (A) Schematische Darstellung des Experiments (links dargestellt) mit der endgültigen Viruskonzentration (PFU / Vertiefung oder MOI), Langzeit-Virus-Medikament Inkubationszeit (i), und anschließender Inkubation (ii) angegeben für jedes Virus in der Tabelle auf der rechten Seite. Die Analysen für (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, und (F) RSV in jedem zusätzlichen Platte angezeigt. Ergebnisse werden mit dem DMSO negative Kontrolle Behandlung für Virusinfektion und die gezeigten Daten wurden die Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus drei unabhängigen Experimenten aufgetragen sind. Diese Zahl hat sich von Referenz 31 modifiziert worden ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> Abbildung 2. Evaluierung von antiviralen Aktivitäten der Testverbindungen CHLA und PUG Viren Befestigung und Ein- / Fusion. (A) Die experimentelle Vorgehensweise, Viruskonzentration (PFU / Vertiefung oder MOI), und der Zeitpunkt der Zugabe und die Behandlung mit den Testverbindungen (i, ii, iii) für jedes Virus in den Schemata und den zugehörigen Tabellen dargestellt. In Virusanheftung Analyse (hellgraue Balken) Monoschichten aus verschiedenen Zelltypen wurden bei 4 ° C für 1 h vorgekühlt, wobei die jeweiligen Viren und Testverbindungen dann mitbehandelt bei 4 ° C (1,5 - 3 h, i) vor dem Waschen die Inokulate und die Testverbindungen für die anschließende Inkubation (37 ° C, ii) und Prüfung der Virusinfektion. In virus entry / Schmelzanalyse (dunkelgraue Balken), wurden ausgesät Zellmonoschichten vorgekühlte bei 4 ° C für 1 Stunde und dann mit den entsprechenden Viren bei 4 ° C für 1,5 in Frage gestellt - 3 h (i). Zellen wurden danngewaschen und mit den Testverbindungen für eine weitere Inkubationsperiode (ii), während der die Temperatur auf 37 ° C verschoben, um das Eindringen des Virus / Fusionsereignis erleichtern behandelt. Am Ende der Inkubation wurden die extrazellulären Viren entweder durch Citratpuffer (pH 3.0) oder PBS Waschschritten entfernt und die Zellen wurden für weitere Analyse der Virus-Infektion inkubiert (iii). Ergebnisse für (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, und (F) RSV in jedem zusätzlichen Platte angezeigt. Daten werden gegen die DMSO negative Kontrolle Behandlung einer Virusinfektion, aufgetragen und werden als Mittel ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl hat sich von Referenz 31 modifiziert worden ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das spezifische Schritte des Viruseintritts untersucht, um neuartige antivirale Wirkstoffe zu identifizieren und zu bewerten.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die antivirale Wirkung von Testverbindungen gegenüber bestimmten Schritten des frühen Virus-Eintritts zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wirtszellen für die Virusinfektion ausgesät werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Virusinfektion sowie die Behandlung mit den Testverbindungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Temperaturen durchzuführen.Anschließend werden die mit dem Wirkstoff behandelten Inokula abgewaschen und die Zellen mit Basalmedium überlagert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu inkubieren. Schließlich wird die virale Infektiosität analysiert, um den Einfluss der Testverbindungen auf die frühen Eintrittsschritte der Virusinfektion zu bestimmen.Beispielsweise wird ein Luminometer verwendet, um die Luciferase-Aktivität in der Zellprobe nach Infektion mit einem Reportervirus zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen mechanismenbasierteren Ansatz bei der Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen ermöglichen kann, insbesondere solcher, die die virale Eintrittsphase targeten. Zunächst bereiten Sie Stammlösungen der Testverbindungen, Trilologsäure oder CHLA und PUNIC-Kollagen oder PUG in DMSO sowie Heparin als positiven Kontrollansatz in steriler, doppelt destillierter Wasser vor, um die Wirtszellen für den Assay anzukultivieren.Menschliche Hepatokarzinomzellen, HUH 7.5 Zellen, über Nacht in frischem DMEM, ergänzt mit FBS und Antibiotika. Beachten Sie, dass während des gesamten Experiments Biosicherheitsstufe zwei beachtet werden muss, um die Zytotoxizität der Testverbindungen zu untersuchen. Behandeln Sie die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen von CHLA oder PUG von null bis 500 µM, verdünnt in Basalmedium, oder mit 1 % DMSO als negativer Kontrolle, und inkubieren Sie die Zellen anschließend 72 Stunden bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter XT T-Assay-Reagenz hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Bestimmen Sie dann mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts die Absorption bei 492 Nanometern mit einer Referenzwellenlänge bei 690 Nanometern.Berechnen Sie den Prozentsatz der Vitalität anhand einer gegebenen Formel aus diesen Werten. Bestimmen Sie die 50 % zelluläre Zytotoxizität-Konzentrationen für jede Verbindung. Beginnen Sie mit dem Virus-Inaktivierungs-Assay.Erste Platte, einmal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen in einer 96-Loch-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um die Anheftung für die Infektion zu ermöglichen. Bereiten Sie Gaia-Luciferase-Reporter-markierte Hepatitis-C-Virus- oder HCV-Partikel gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll vor.In einem sterilen Reagenzglas 100 Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung von CHLA oder PUG mit 100 Mikrolitern eines HCV-Viruspräparats mit einer Konzentration von 104 Focus-forming units (FFU) mischen, um eine positive Kontrolle herzustellen. HCV mit Heparin auf eine Endkonzentration von 1000 Mikrogramm pro Milliliter versetzen.Bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang inkubieren. Nach drei Stunden die Virusvermischung 50-fach mit 9,8 Milliliter Basalmedium bei Raumtemperatur verdünnen. Danach eine neue Virusvermischung herstellen und diese sofort für die Inkubationsprobe zur Zeitnull in Basalmedium verdünnen.Nachdem das Inkubationsmedium von den Zellen entfernt wurde, 100 Mikroliter der verdünnten Virus-Wirkstoff-Lösung pro Vertiefung im Dreifachansatz hinzufügen. Die Lösung enthält nun 10 zur zweiten FFU pro Vertiefung; bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid drei Stunden lang inkubieren, um die virale Infektion der Zellen zu ermöglichen. Nach der Inkubation die virale Suspension von den Vertiefungen entfernen und die Zellen vorsichtig zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS waschen.Inkubieren Sie die Zellen für 72 Stunden in 100 Mikroliter Basalmedium, um die virale Replikation und die Freisetzung des Luciferase-Reporters in den Überstand zu ermöglichen. Sammeln Sie anschließend den Überstand aus den Kulturen und Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie ihn fünf Minuten bei 17.000 × g und vier Grad Celsius. Um zelluläre Trümmer zu entfernen, mischen Sie 20 Mikroliter jedes Überstands mit 50 Mikroliter Gaussia-Luciferase-Assay-Reagenz und messen Sie die Lumineszenz der Luciferase-Reporteraktivität in einem Luminometer.Gemäß den Herstelleranweisungen für die Virus-Bindungs-Assay-Platte: eine mal zehn hoch vier Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-Platte, über Nacht inkubieren, um die Zelladhäsion am nächsten Morgen zu ermöglichen. Zuerst die 96-Loch-Platte mit der Zellmonoschicht eine Stunde lang bei vier Grad Celsius abkühlen.Bereiten Sie die Testverbindungen und das Virusgemisch auf Eis vor. Zum Beispiel H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1 % DMSO oder positive Kontrolle HCV Heparin-Lösungen mit 10² FFU Virus. Für jede Behandlung saugt man vorsichtig das Medium aus den Zellkulturvertiefungen ab.Anschießend sofort 100 Mikroliter der Virus-Testsubstanzen-Mischung in dreifach besetzten Vertiefungen hinzufügen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Temperatur nicht ansteigt. Die Platte drei Stunden lang in einem Kühlschrank, der auf vier Grad Celsius gehalten wird, inkubieren. Die Viruspartikel binden an der Zelloberfläche bei vier Grad Celsius, werden jedoch nicht internalisiert.Als Nächstes die Überstände abpipettieren. Die Zellen vorsichtig zweimal mit je 200 µL eiskaltem PBS waschen, 100 µL Basalmedium in jede Vertiefung geben und dann 72 Stunden bei 37 °C inkubieren.Abschließend, um die Freisetzung des Luciferase-Reporters aus den infizierten Zellen zu quantifizieren: Sammeln Sie das Überstandmedium aus jedem Probenwell und führen Sie den Gaussian-Luciferase-Assay zur Bestimmung der viralen Fusion und des Eintritts durch. Kühlen Sie die Zellkulturplatte vorab eine Stunde lang auf vier Grad Celsius ab.Nach der Übernacht-Inkubation zur Zellanheftung entfernen Sie das vorhandene Medium aus den Vertiefungen und infizieren die Zellen mit 10 hoch 2 FFU-HCV auf Eis. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit je 200 Mikrolitern eiskalter PBS, um nicht angehefteten Virus zu entfernen.Anschließend die Zellen auf Eis mit den in Basalmedium oder Basalmedium mit 1 % DMSO als Kontrolle gelösten Testsubstanzen behandeln und die Platte drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dadurch lässt sich der Einfluss der Testsubstanzen auf den viralen Eintritt, der bei 37 Grad Celsius erfolgt, bewerten. Das Medium absaugen und die nicht internalisierten Viren zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern Zitratpuffer oder PBS waschen.Gegeben Sie 100 µL Basalmedium pro Mulde hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C weitere 72 Stunden. Sammeln Sie den Überstand und führen Sie den Gaussian-Luciferase-Assay wie zuvor zur Detektion des freigesetzten Luciferase-Reporters durch. Hier sind die Wirkungen der Testsubstanzen auf HCV dargestellt. Bei der Aktivierung wurde das Virus vor der Infektion drei oder null Stunden lang mit den Testsubstanzen inkubiert.Der Prozentsatz der Hemmung der Virusinfektion wird für jede Behandlung dargestellt. Die negative Kontrolle mit DMSO zeigt keine Hemmung. CHLA weist bereits unmittelbar nach Kontakt sowie nach der längeren Inkubation von drei Stunden eine starke Hemmung auf.Zusätzliche Ergebnisse mit einem weiteren Test. Die Verbindung PUG ist hier dargestellt, wobei dieses allgemeine experimentelle Design angepasst wurde; CHLA und PUG zeigen zudem eine Hemmung der Infektiosität des humanen Cytomegalovirus oder HCMV in embryonalen Lungenfibroblasten. Die Wirkung von CHLA und PUG auf die HCV-Anheftung ist hier dargestellt.Beachten Sie, dass die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit der Testsubstanzen bei vier Grad Celsius mit dem Virus inkubiert wurden und anschließend, nach Entfernung der nicht gebundenen Viruspartikel, zur Infektion mit dem Virus bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden. Die schattierten Balken zeigen die Wirkung von C-H-L-A-P-U-G oder Heparin auf den HCV-Eintritt in die Zellen. Beachten Sie, dass in diesem Fall die virale Anheftung zunächst bei vier Grad Celsius durchgeführt wurde.Danach wurden die Zellen nach Entfernung des nicht gebundenen Virus bei 37 Grad Celsius mit Testsubstanzen inkubiert, um den viralen Eintritt zu untersuchen. Ebenso zeigt bei HCMV die Infektion embryonaler Lungenfibroblasten nach Behandlung mit CHLA oder PUG eine starke Hemmung der viralen Anheftung und des viralen Eintritts. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Schritte bei der angegebenen Temperatur durchzuführen, da dies die Genauigkeit der Ergebnisse beeinflusst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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