Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die antivirale Wirkung von Testsubstanzen gegen bestimmte Schritte des frühen Viruseintritts zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wirtszellen für die Virusinfektion ausgesät werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Virusinfektion und die Behandlung der Testverbindung zu unterschiedlichen Zeiten und Temperaturen durchzuführen.

Als nächstes werden die medikamentös behandelten Inokula weggespült und die Zellen mit Basalmedium überzogen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu inkubieren. Abschließend wird die virale Infektiosität analysiert, um den Einfluss der Testverbindungen auf die frühen viralen Eintrittsschritte der Virusinfektion zu bestimmen.

Zum Beispiel wird ein Luminometer verwendet, um die Luciferase-Aktivität in der Zellsnat durch eine Infektion durch ein Reportervirus zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen stärker auf Mechanismen basierenden Ansatz bei der Identifizierung antiviraler Wirkstoffe ermöglichen kann, insbesondere solcher, die auf den Eintritt von Viren abzielen. Zu Beginn werden zunächst Stammlösungen der Testverbindungen, Trilogiesäure oder CHLA und PUNIC-Kollagen oder PUG in DMSO hergestellt, um Heparin für eine Positivkontrolle in sterilem doppelt destilliertem Wasser aufzulösen, um Wirtszellen für die Assaykultur vorzubereiten.

Humanes Hepatokarzinom, 7,5 HUH Zellen über Nacht in frischem DMAM, ergänzt mit FBS und Antibiotika. Denken Sie daran, während des gesamten Experiments Verfahren der Biosicherheitsstufe zwei zu befolgen, um die Zytotoxizität der Testverbindungen zu testen. Behandeln Sie die Zellen mit steigenden Konzentrationen von CHLA oder PUG von null auf 500 Mikromolare, verdünnt in Basalmedium oder 1 % DMSO als Negativkontrolle, und inkubieren Sie die Zellen dann 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkulturinkubator.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter XT T Assay-Reagenz hinzu und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann ein Mikroplatten-Reader, um die Absorption bei 492 Nanometern mit einer Referenzwellenlänge bei 690 Nanometern zu bestimmen.

Berechnen Sie aus diesen Werten den prozentualen Anteil der Rentabilität mit einer bestimmten Formel. Bestimmen Sie die 50%igen zellulären Zytotoxizitätskonzentrationen für jede Verbindung. Um mit dem Virusinaktivierungstest zu beginnen.

Erste Platte, eine mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Well. In einer 96-Well-Platte werden die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid zur Anheftung für die Infektion inkubiert. Bereiten Sie Gaia-Luciferase-Reporter-markierte Hepatitis-C-Virus- oder HCV-Partikel vor, wie im Textprotokoll angegeben.

Mischen Sie in einem sterilen Röhrchen 100 Mikroliter 100 mikromolare CHLA oder PUG mit 100 Mikrolitern 10 bis zum Viertel. Fokusformeinheiten oder FFU von HCV für eine positive Kontrollmischung. HCV mit Heparin in einer Endkonzentration von 1000 Mikrogramm pro Milliliter.

Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach drei Stunden verdünnen Sie das Virusverbindungsgemisch 50-fach mit 9,8 Millilitern Basalmedium bei Raumtemperatur. Bereiten Sie dann eine neue Virusverbindungsmischung vor und verdünnen Sie diese Mischung sofort in Basalmedium für die Null-Stunden-Inkubationsprobe.

Nach der Entnahme des Inkubationsmediums aus den Zellen werden 100 Mikroliter der verdünnten Virus-Wirkstofflösung pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung zugegeben. Die Lösung enthält nun 10 bis zur zweiten FFU pro Well, inkubieren Sie drei Stunden lang ein 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um eine Virusinfektion der Zellen zu ermöglichen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Virussuspension aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 200 Mikrolitern PBS. Zweimal.

Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in 100 Mikrolitern Basalmedium für die virale Replikation und die Freisetzung des Luciferase-Reporters in den Überstand. Dann das Supernat aus den Kulturen und Mikroröhrchen sammeln und bei 17.000 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Um zelluläre Trümmer zu entfernen, mischen Sie 20 Mikroliter jedes Supernats mit 50 Mikrolitern Gaussi-Luciferase-Assay-Reagenz und messen Sie die Lumineszenz der Luciferase-Reporteraktivität in einem Luminometer.

Gemäß den Herstellerangaben für die Virus-Attachment-Assay-Platte einmal 10 bis zu den vierten Zellen pro Well. In einer 96-Well-Platte und über Nacht inkubieren, um am nächsten Morgen die Zellen zu adhäsieren. Zuerst kühlen Sie die 96-Well-Platte, die die Zellmonoschicht enthält, eine Stunde lang bei vier Grad Celsius ab.

Bereiten Sie die Testverbindungen und die Virusmischung auf Eis vor. Zum Beispiel H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO oder Positivkontroll-HCV-Heparin-Lösungen mit 10 to dem zweiten FFU-Virus. Für jede Behandlung ist das Medium aus den Zellkultur-Wells schonend zu aspirieren.

Geben Sie dann sofort 100 Mikroliter der Mischung aus der Virustestverbindung in dreifache Vertiefungen und achten Sie darauf, die Temperatur nicht zu erhöhen. Inkubieren Sie die Platte in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius für drei Stunden. Viruspartikel heften sich bei vier Grad Celsius an den Zellservice, werden aber nicht verinnerlicht.

Als nächstes aspirierst du die Überstände. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 200 Mikrolitern eiskalt. PBS geben 100 Mikroliter Basalmedium in jede Vertiefung und inkubieren dann 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Schließlich zur Quantifizierung der Freisetzung von Luciferase-Reportern aus den infizierten Zellen. Entnehmen Sie das Supernat aus jeder Probenvertiefung und führen Sie den Gaußschen Luziferase-Assay zur Bestimmung der viralen Fusion und des Eintritts durch. Kühle die Zellkulturplatte eine Stunde lang bei vier Grad Celsius vor.

Nach der Inkubation über Nacht zur Zellanheftung wird das vorhandene Medium aus den Vertiefungen entfernt und die Zellen mit 10 bis dem zweiten F-F-U-H-C-V auf Eis infiziert. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 200 Mikrolitern eiskaltem PBS, um das nicht adhärente Virus zu entfernen.

Behandeln Sie dann auf Eis die Zellen mit den in Basalmedium oder Basalmedium mit 1%DMSO gelösten Testverbindungen als Kontrolle und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Dies ermöglicht die Beurteilung der Testverbindungen beim Viruseintritt, der bei 37 Grad Celsius erfolgt. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die nicht internalisierten Viren zweimal mit 200 Mikrolitern Citratpuffer oder PBS.

Fügen Sie 100 Mikroliter Basalmedium pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie weitere 72 Stunden bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie das Supernat und führen Sie den Gaußschen Luziferase-Assay durch, wie zuvor gezeigt, zum Nachweis des freigesetzten Luciferase-Reporters. Hier sind die Auswirkungen der Testverbindungen auf HCV. Bei der Aktivierung wurde das Virus vor der Infektion null oder drei Stunden lang mit den Testverbindungen inkubiert.

Der prozentuale Anteil der Hemmung der Virusinfektion wird für jede Behandlung aufgetragen. Negativ kontrolliertes DMSO zeigt keine Hemmung. CHLA zeigt eine hohe Hemmung bei Kontakt, sowohl nach einer Null-Stunden-Inkubation als auch nach einer längeren Inkubation von drei Stunden.

Zusätzliche Ergebnisse mit einem weiteren Test. In Anlehnung an dieses allgemeine Versuchsdesign wird gezeigt, dass CHLA und PUG zusätzlich die Infektiosität des humanen Cytomegalievirus oder HCMV in embryonalen Lungenfibroblasten hemmen. Die Wirkung von CHLA und PUG auf die HCV-Bindung ist hier dargestellt.

Zur Erinnerung: Die Zellen wurden mit dem Virus in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindungen bei vier Grad Celsius inkubiert, und dann wurden die ungebundenen Viruszellen bei 37 Grad Celsius für eine Infektion mit dem Virus inkubiert. Die schattierten Balken zeigen die Wirkung von C-H-L-A-P-U-G oder Heparin auf den HCV-Eintritt in die Zellen. Beachten Sie, dass in diesem Fall die Virusanheftung zuerst bei vier Grad Celsius durchgeführt wurde.

Nach der Entfernung des ungebundenen Virus wurden die Zellen mit Testverbindungen bei 37 Grad Celsius für den Viruseintritt inkubiert. In ähnlicher Weise zeigt die Behandlung von embryonalen Lungenfibroblasten mit CHLA oder PUG im Fall von HCMV eine starke Hemmung der Virusanheftung und des Viruseintritts. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Schritte bei der angegebenen Temperatur durchzuführen, was die Genauigkeit der Ergebnisse beeinflusst.