Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die antivirale Wirkung von Testverbindungen gegenüber bestimmten Schritten des frühen Virus-Eintritts zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wirtszellen für die Virusinfektion ausgesät werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Virusinfektion sowie die Behandlung mit den Testverbindungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Temperaturen durchzuführen.

Anschließend werden die mit dem Wirkstoff behandelten Inokula abgewaschen und die Zellen mit Basalmedium überlagert. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen zu inkubieren. Schließlich wird die virale Infektiosität analysiert, um den Einfluss der Testverbindungen auf die frühen Eintrittsschritte der Virusinfektion zu bestimmen.

Beispielsweise wird ein Luminometer verwendet, um die Luciferase-Aktivität in der Zellprobe nach Infektion mit einem Reportervirus zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen mechanismenbasierteren Ansatz bei der Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen ermöglichen kann, insbesondere solcher, die die virale Eintrittsphase targeten. Zunächst bereiten Sie Stammlösungen der Testverbindungen, Trilologsäure oder CHLA und PUNIC-Kollagen oder PUG in DMSO sowie Heparin als positiven Kontrollansatz in steriler, doppelt destillierter Wasser vor, um die Wirtszellen für den Assay anzukultivieren.

Menschliche Hepatokarzinomzellen, HUH 7.5 Zellen, über Nacht in frischem DMEM, ergänzt mit FBS und Antibiotika. Beachten Sie, dass während des gesamten Experiments Biosicherheitsstufe zwei beachtet werden muss, um die Zytotoxizität der Testverbindungen zu untersuchen. Behandeln Sie die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen von CHLA oder PUG von null bis 500 µM, verdünnt in Basalmedium, oder mit 1 % DMSO als negativer Kontrolle, und inkubieren Sie die Zellen anschließend 72 Stunden bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter XT T-Assay-Reagenz hinzu und inkubieren Sie drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Bestimmen Sie dann mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts die Absorption bei 492 Nanometern mit einer Referenzwellenlänge bei 690 Nanometern.

Berechnen Sie den Prozentsatz der Vitalität anhand einer gegebenen Formel aus diesen Werten. Bestimmen Sie die 50 % zelluläre Zytotoxizität-Konzentrationen für jede Verbindung. Beginnen Sie mit dem Virus-Inaktivierungs-Assay.

Erste Platte, einmal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen in einer 96-Loch-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um die Anheftung für die Infektion zu ermöglichen. Bereiten Sie Gaia-Luciferase-Reporter-markierte Hepatitis-C-Virus- oder HCV-Partikel gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll vor.

In einem sterilen Reagenzglas 100 Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung von CHLA oder PUG mit 100 Mikrolitern eines HCV-Viruspräparats mit einer Konzentration von 104 Focus-forming units (FFU) mischen, um eine positive Kontrolle herzustellen. HCV mit Heparin auf eine Endkonzentration von 1000 Mikrogramm pro Milliliter versetzen.

Bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang inkubieren. Nach drei Stunden die Virusvermischung 50-fach mit 9,8 Milliliter Basalmedium bei Raumtemperatur verdünnen. Danach eine neue Virusvermischung herstellen und diese sofort für die Inkubationsprobe zur Zeitnull in Basalmedium verdünnen.

Nachdem das Inkubationsmedium von den Zellen entfernt wurde, 100 Mikroliter der verdünnten Virus-Wirkstoff-Lösung pro Vertiefung im Dreifachansatz hinzufügen. Die Lösung enthält nun 10 zur zweiten FFU pro Vertiefung; bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid drei Stunden lang inkubieren, um die virale Infektion der Zellen zu ermöglichen. Nach der Inkubation die virale Suspension von den Vertiefungen entfernen und die Zellen vorsichtig zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS waschen.

Inkubieren Sie die Zellen für 72 Stunden in 100 Mikroliter Basalmedium, um die virale Replikation und die Freisetzung des Luciferase-Reporters in den Überstand zu ermöglichen. Sammeln Sie anschließend den Überstand aus den Kulturen und Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie ihn fünf Minuten bei 17.000 × g und vier Grad Celsius. Um zelluläre Trümmer zu entfernen, mischen Sie 20 Mikroliter jedes Überstands mit 50 Mikroliter Gaussia-Luciferase-Assay-Reagenz und messen Sie die Lumineszenz der Luciferase-Reporteraktivität in einem Luminometer.

Gemäß den Herstelleranweisungen für die Virus-Bindungs-Assay-Platte: eine mal zehn hoch vier Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-Platte, über Nacht inkubieren, um die Zelladhäsion am nächsten Morgen zu ermöglichen. Zuerst die 96-Loch-Platte mit der Zellmonoschicht eine Stunde lang bei vier Grad Celsius abkühlen.

Bereiten Sie die Testverbindungen und das Virusgemisch auf Eis vor. Zum Beispiel H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1 % DMSO oder positive Kontrolle HCV Heparin-Lösungen mit 10² FFU Virus. Für jede Behandlung saugt man vorsichtig das Medium aus den Zellkulturvertiefungen ab.

Anschießend sofort 100 Mikroliter der Virus-Testsubstanzen-Mischung in dreifach besetzten Vertiefungen hinzufügen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Temperatur nicht ansteigt. Die Platte drei Stunden lang in einem Kühlschrank, der auf vier Grad Celsius gehalten wird, inkubieren. Die Viruspartikel binden an der Zelloberfläche bei vier Grad Celsius, werden jedoch nicht internalisiert.

Als Nächstes die Überstände abpipettieren. Die Zellen vorsichtig zweimal mit je 200 µL eiskaltem PBS waschen, 100 µL Basalmedium in jede Vertiefung geben und dann 72 Stunden bei 37 °C inkubieren.

Abschließend, um die Freisetzung des Luciferase-Reporters aus den infizierten Zellen zu quantifizieren: Sammeln Sie das Überstandmedium aus jedem Probenwell und führen Sie den Gaussian-Luciferase-Assay zur Bestimmung der viralen Fusion und des Eintritts durch. Kühlen Sie die Zellkulturplatte vorab eine Stunde lang auf vier Grad Celsius ab.

Nach der Übernacht-Inkubation zur Zellanheftung entfernen Sie das vorhandene Medium aus den Vertiefungen und infizieren die Zellen mit 10 hoch 2 FFU-HCV auf Eis. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit je 200 Mikrolitern eiskalter PBS, um nicht angehefteten Virus zu entfernen.

Anschließend die Zellen auf Eis mit den in Basalmedium oder Basalmedium mit 1 % DMSO als Kontrolle gelösten Testsubstanzen behandeln und die Platte drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dadurch lässt sich der Einfluss der Testsubstanzen auf den viralen Eintritt, der bei 37 Grad Celsius erfolgt, bewerten. Das Medium absaugen und die nicht internalisierten Viren zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern Zitratpuffer oder PBS waschen.

Gegeben Sie 100 µL Basalmedium pro Mulde hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C weitere 72 Stunden. Sammeln Sie den Überstand und führen Sie den Gaussian-Luciferase-Assay wie zuvor zur Detektion des freigesetzten Luciferase-Reporters durch. Hier sind die Wirkungen der Testsubstanzen auf HCV dargestellt. Bei der Aktivierung wurde das Virus vor der Infektion drei oder null Stunden lang mit den Testsubstanzen inkubiert.

Der Prozentsatz der Hemmung der Virusinfektion wird für jede Behandlung dargestellt. Die negative Kontrolle mit DMSO zeigt keine Hemmung. CHLA weist bereits unmittelbar nach Kontakt sowie nach der längeren Inkubation von drei Stunden eine starke Hemmung auf.

Zusätzliche Ergebnisse mit einem weiteren Test. Die Verbindung PUG ist hier dargestellt, wobei dieses allgemeine experimentelle Design angepasst wurde; CHLA und PUG zeigen zudem eine Hemmung der Infektiosität des humanen Cytomegalovirus oder HCMV in embryonalen Lungenfibroblasten. Die Wirkung von CHLA und PUG auf die HCV-Anheftung ist hier dargestellt.

Beachten Sie, dass die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit der Testsubstanzen bei vier Grad Celsius mit dem Virus inkubiert wurden und anschließend, nach Entfernung der nicht gebundenen Viruspartikel, zur Infektion mit dem Virus bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden. Die schattierten Balken zeigen die Wirkung von C-H-L-A-P-U-G oder Heparin auf den HCV-Eintritt in die Zellen. Beachten Sie, dass in diesem Fall die virale Anheftung zunächst bei vier Grad Celsius durchgeführt wurde.

Danach wurden die Zellen nach Entfernung des nicht gebundenen Virus bei 37 Grad Celsius mit Testsubstanzen inkubiert, um den viralen Eintritt zu untersuchen. Ebenso zeigt bei HCMV die Infektion embryonaler Lungenfibroblasten nach Behandlung mit CHLA oder PUG eine starke Hemmung der viralen Anheftung und des viralen Eintritts. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Schritte bei der angegebenen Temperatur durchzuführen, da dies die Genauigkeit der Ergebnisse beeinflusst.