Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von Mycobacterium abscessus In Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Virulenz von Mycobacterium abscessus-Stämmen zu untersuchen und zu vergleichen und die Wechselwirkungen zwischen diesen Bakterien und dem angeborenen Immunsystem des Wirts in vivo anhand von transparenten Zebrafischembryonen zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst ein homogenes bakterielles Inokular vorbereitet wird. Anschließend werden den Embryonen 30 Stunden nach der Befruchtung die Bakteriensuspensionen intravenös injiziert.

Um die Rolle von Makrophagen bei der Infektionskontrolle genauer zu untersuchen, wird zusätzlich ein Lipo-choat-basiertes Injektionsverfahren verwendet, um Makrophagen-depletierte Embryonen zu erzeugen. Schließlich werden die infizierten Embryonen präpariert und mittels Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie abgebildet, um das Fortschreiten der Infektion zu überwachen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, die erzielt werden können, die spezifischen Wechselwirkungen zwischen den fluoreszierenden phagozytischen Zellen und dem M-Abszess, entweder als einzelne Basi oder als Serpentinenstränge in einem transparenten Embryo.

Der Hauptvorteil der Verwendung von Zebrafischen gegenüber anderen Tiermodellen wie Mäusen besteht darin, dass sie es ermöglicht, den Infektionsprozess in Echtzeit spezifisch zu untersuchen und die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Mikrobakterienabszessen und Mikrophagen oder Neutrophilen abzubilden. Dieser Schritt ist ein kritischer Punkt für den nachfolgenden Injektionsdruck im Zebrafisch. Aufgrund der hohen Neigung des rauen Mycobacterium abscessus, große Aggregate zu bilden und Codes zu produzieren, ist daher eine spezifische Behandlung erforderlich, um vor der Mikroinjektion ein homogenes und quantitativ kontrolliertes Inokular herzustellen.

Zur Herstellung von m Abszess werden exponentiell wachsende Kulturen aus 150 Quadratzentimeter großen Gewebekulturflaschen in sterile 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen geerntet und 15 Minuten lang bei 4.000 μg und Raumtemperatur zentrifugiert. Verwenden Sie einen Milliliter Middlebrook sieben H neun, ergänzt mit der OADC-Anreicherung, plus Tween 80, im Folgenden als sieben H neun Medium bezeichnet, um das Pellet und Eloqua zu resuspendieren. 200 Mikroliter der Bakteriensuspensionen in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einer 26-Gauge-Nadel homogenisieren jedes ALI-Quad der Bakteriensuspension 15-mal.

Dann wird mit einem Wasserbad dreimal 10 Sekunden lang beschallt, mit einer Pause von zehn Sekunden. Zwischendurch einen Milliliter sieben H neun, mittel und kurz vortexen, dann bei 100 mal G drei Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie die Mykobakterien, die Überstände enthalten, vorsichtig, um Klumpen zu vermeiden, und ziehen Sie die homogenen Suspensionen in ein steriles 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 4.000 mal G und verwenden Sie 200 Mikroliter sieben H neun Medium, um das Pellet wieder zu suspendieren und das endgültige bakterielle Inokulum zu bewerten. Gemäß dem Textprotokoll Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte schwer zu erlernen sind, da die präzise sanfte Manipulation der Injektion in Zebrafischembryonen unter dem Mikroskop sowie der Erwerb der Mikroinjektionstechnik Zeit erforderte, um die Mikroinjektion von M-Abszess nach etwa 24 Stunden durchzuführen. Nach der Befruchtung oder HPF verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen in eine 100-Millimeter-Petrischale zu hüllen und sie bei 28,5 Grad Celsius zu halten.

Übertragen Sie 30 48 HPF-Embryonen in eine V-förmige Positionierungskammer, die mit 25 Millilitern Fischwasser gefüllt ist, das 270 Milligramm pro Liter Trica enthält, mit einer abgeschnittenen Mikroladerspitze. Legen Sie die Embryonen richtig in die Kanäle, um die Handhabung zu erleichtern. Verwenden Sie PBST mit 0,05 % zwischen 80, um das mikrobakterielle Inokulum auf die gewünschte zu liefernde KBE zu verdünnen, und fügen Sie 10 % Phenolrot hinzu, um die ordnungsgemäße Injektion mit einer Mikroladerspitze zu überprüfen.

Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit fünf bis 10 Mikrolitern des bakteriellen Inokulums. Schließen Sie die Mikroinjektionsnadel an die Halterung eines Mikromanipulators an, der mit dem Injektor verbunden ist, und brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer feinen Pinzette ab. Um einen Öffnungsdurchmesser von fünf bis 10 Mikrometern zu erhalten.

Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen, indem Sie den Mikroinjektionsdruck und die Zeit einstellen. Um das erforderliche Injektionsvolumen zu erhalten, messen Sie dann den Durchmesser eines Tröpfchens, das in das Eigelb eines Embryos ausgestoßen wird, um es in die Kotschvene zu injizieren. Positionieren Sie den Embryo mit der Bauchseite zur Nadel und platzieren Sie die Nadelspitze in der Nähe der Urogenitalöffnung

Und schieben Sie die Spitze der Nadel vorsichtig in den Embryo, bis sie gerade noch die Region der verhätschelten Vene durchbohrt. Geben Sie dann das gewünschte Volumen der Bakteriensuspension ab, in der Regel ein bis drei Nanoliter mit etwa 100 KBE pro Nanoliter. Inkubieren und überwachen Sie die Embryonen gemäß dem Textprotokoll, um Lipo Choate, Depletion von Makrophagen und Embryonen bei 24 HP durchzuführen. Schicksal, die Embryonen, und übertrage sie in eine mit Fischwasser gefüllte Injektionsschale mit Trica.

Richten Sie sie dann mit der Rückenseite nach unten aus. Nach dem Vortexen der liposomenverkapselten Clodronatlösung laden Sie die Mikrokapillarnadel und kalibrieren das Injektionsvolumen. Durchstechen Sie den Bereich der Kotschlervene, wie zuvor gezeigt, und injizieren Sie zwei bis drei Liter Lösung.

Wiederholen Sie die Injektion dreimal. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius und verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um die ordnungsgemäße Erschöpfung der Makrophagen vor der Infektion zu kontrollieren. Wie weiter oben in diesem Video gezeigt, um koloniebildende Einheiten oder KBs zum gewünschten Zeitpunkt aufzuzählen.

Sammeln Sie fünf Embryonen pro Infektionsbedingung und übertragen Sie jeden Embryo in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Kryoanästhesieren Sie die Embryonen durch Inkubation auf Eis für 10 Minuten, nachdem Sie die Embryonen mit 300 bis 500 Milligramm pro Liter eingeschläfert haben. Trica. Waschen Sie die Embryonen mit sterilem Wasser zweimal in einem neuen Röhrchen.

Nachdem Sie Wasser bei 2% Triton X 100 in einem XPBS zu jedem Embryo entfernt haben, verwenden Sie eine 26-Gauge-Nadel, um das Gewebe für eine vollständige Lyse zu homogenisieren. Nach dem Zentrifugieren der Suspension wird ein X-P-B-S-T verwendet, um das Pellet wieder zu suspendieren. Dann Plattenreihenverdünnung des Homogenen auf Middlebrook sieben H 10 OADC.

Ergänzt mit B-B-L-M-G-I-T Panta inkubieren Sie die Platten vier Tage lang bei 30 Grad Celsius, bevor Sie die Kolonien für die Live-Bildgebung der M-Abszessus-Infektion zählen, montieren Sie trica anästhesierte Embryonen bei 1 % niedrigem Schmelzpunkt aros in einer 35-Millimeter-Petrischale mit Glasboden für ein inverses Mikroskop oder einen Einzelkavitäten-Vertiefungsobjektträger für die aufrechte konfokale Mikroskopie. Richten Sie den Embryo in die gewünschte Position aus und bedecken Sie den erstarrten Aros mit Fischwasser, das Trica enthält, um eine fixierte Darstellung der M-Abszessus-Infektion zu ermöglichen. Nachdem Sie die Embryonen eingeschläfert haben, übertragen Sie sie in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fixieren Sie die Embryonen zwei Stunden lang in 4% Paraformaldehyd in einem X-P-B-S-T.

Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Paraform-Aldehyd, indem Sie die Embryonen zweimal 10 Minuten lang mit einem X-P-B-S-T waschen, um die Integrität des Gewebes und die Fluoreszenz nacheinander zu erhalten. Inkubieren Sie die Embryonen in steigenden Konzentrationen von Glycerinlösung für 10 Minuten pro Bedingung. Legen Sie den in 50%iges Glycerin eingebetteten Embryo in eine Betrachtungskammer.

Verwenden Sie schließlich ein Fluoreszenzmikroskop mit einem 10-fach-Objektiv oder ein konfokales Fluoreszenzmikroskop mit 40 x oder 63 x Objektiven für die sequentielle Fluoreszenzerfassung und Transmissionsbildgebung des Embryos. Um die Virulenz von rauen und glatten M-abscessus-Varianten zu untersuchen und zu vergleichen, wurden fluoreszierende Bakterien intravenös in 30 HPFC-kompetente Embryonen injiziert. Im Gegensatz zur glatten Variante induziert die raue Variante eine robustere und tödlichere Infektion mit der Entwicklung von Abszessen im Zentralnervensystem.

Die Unterschiede in der Virulenz wurden entweder durch Aufzählung der KBE oder durch Bestimmung der korrelierten Fluoreszenzpixelzahlen quantifiziert. Dies deutet auf eine höhere bakterielle Belastung für die raue Variante hin. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, kann die Kinetik der Nabelschnurbildung durch Videomikroskopie auf nicht-invasive Weise überwacht und abgebildet werden, was die Neigung der rauen Variante zur extrazellulären Replikation zeigt, wie hier gezeigt. Die Infektion von Makrophagen-depletierten Embryonen mit dem rauen M-Abszess führt zu einem massiven Anstieg der Bakterienbelastung und der Nabelschnurproduktion und zum schnellen Absterben der Larven.

Dies deutet deutlich darauf hin, dass Makrophagen zur Kontrolle der M-Abszessus-Infektion erforderlich sind, um die Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und M-Abszess in Echtzeit zu beobachten. Die transgene Linie EG one M Kirsche, die rot fluoreszierende Makrophagen produziert, kann verwendet werden. Infektionen induzieren eine ausgeprägte Rekrutierung von Makrophagen mit effizienter Phagozytose einzelner Bakterien, während mykobakterielle Stränge eine Strategie darstellen, die durch am-Abszesse entwickelt wurde, um eine Phagozytose nach ihrer Entwicklung zu vermeiden.

Diese Technik ebnete den Weg, um die wichtige Rolle der Kodierung als neuen Mechanismus der Immunevasion zu erforschen. Dank des Zebrafisch-Maulwurfs der Infektion ist es nun möglich, den in vivo-Beitrag von Codes zur Pathogenese von Mycobacterium-Abszessen zu beobachten und zu beschreiben.