Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, angereicherte mitochondriale Fraktionen zu gewinnen, die ausreichend mitochondriale Metaboliten für metabolomische Untersuchungen unter Verwendung von Drosophila melanogaster liefern. Dies wird erreicht, indem zunächst eine ausreichende Menge an Fliegen gezüchtet wird, um genügend Metaboliten für die anzureichernden mitochondrialen Fraktionen zu erhalten. Im zweiten Schritt werden die Fliegen in einem Glas-Teflon-Downton-Homogenisator homogenisiert, wodurch die Zellmembran zerkleinert wird, ohne die Integrität der Mitochondrien zu schädigen.

Anschließend werden die Homogenate einer Differenzzentrifugation unterzogen, um angereicherte mitochondriale Proben zu gewinnen. Die Ergebnisse zeigen, dass mit diesem Protokoll deutliche mitochondriale Stoffwechselveränderungen nachgewiesen wurden, die bei einer ausschließlich auf ganzheitlicher Metabolomanalyse basierenden Untersuchung von mitochondrial angereicherten Fraktionen und Gesamtextrakten aus Tieren nicht erfasst wurden. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens im Vergleich zur Metabolomanalyse ganzer Fliegen liegt darin, dass die Isolierung von Mitochondrien vor der metabolomischen Analyse eine erhöhte Empfindlichkeit und einen besseren Nachweis von Veränderungen im mitochondrialen Metabolitenprofil ermöglicht.

Um das Experiment zu beginnen, erhitzen Sie die Futtermittelzutaten für die Fliegen auf einem Heizgerät auf 90 Grad Celsius. Rühren Sie die Mischung regelmäßig um, bis sie homogen und leicht dickflüssig ist. Nehmen Sie das Futter von der Wärmequelle und rühren Sie gelegentlich weiter, wenn das Futter auf 80 Grad Celsius abgekühlt ist, und geben Sie dann 0,2 % TE Decept Methyl 4-Hydroxybenzoat, gelöst in 95 % Ethanol, hinzu. Danach teilen Sie das Futter in zwei gleiche Volumina auf.

Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Nahrung auf 50 Grad Celsius abgesunken ist, und rühren Sie 1,1 Milliliter 50 Millimolar Rapamycin, gelöst in Ethanol, in ein Volumen und 1,1 Milliliter unbehandeltes Ethanol in das zweite Volumen ein. Zum Sammeln der erwachsenen Tiere verwenden Sie einen Einstufenregler, um reines Kohlendioxid aus einem Hochdrucktank zuzuführen. Bei einem kontinuierlichen Durchfluss von fünf PS vermeide ich statische Elektrizität, indem ich ein Plastikrohr verwende, um das Kohlendioxid in einen 500-Milliliter-Filterkolben mit Schlauchleitung zu leiten, wodurch das Kohlendioxid durch Wasser gebubbelt wird.

Verwenden Sie dazu einen Gummistopfen mit einem Loch, um den Kolben abzudichten. Verbinden Sie einen Kunststoffschlauch vom seitlichen Anschluss des Kolbens mit einem Kohlendioxid-Pad, um die Larvaldichte während der Entwicklung zu kontrollieren. Geben Sie 25 Elternpaare in eine Kulturfalsche und lassen Sie sie 48 Stunden lang Eier legen.

Entfernen Sie anschließend die Elterntiere, um die Eisdichte zu regulieren, und wiederholen Sie diese Schritte mit den schlüpfenden F1-Nachkommen, um zwei Generationen lang diese Dichtekontrolle aufrechtzuerhalten. Nach zwei Generationen unter dichtegekontrollten Bedingungen werden die Fliegen nach Geschlecht getrennt und für nicht länger als 10 bis 15 Minuten auf das Polster gelegt. Lassen Sie die Fliegen 24 Stunden lang von der Anästhesie genesen, bevor Sie sie den experimentellen Bedingungen aussetzen.

Weisen Sie 300 Fliegen pro Probe zu, um ausreichend Metaboliten für mitochondrienangereicherte Fraktionen zu gewinnen. Überführen Sie 150 Fliegen in einen selbstgebauten Ein-Liter-Käfig. Überführen Sie anschließend die verbleibenden 150 Fliegen in einen separaten Ein-Liter-Käfig und überbevölkern Sie die Käfige nicht mit mehr als 150 Fliegen.

Verwenden Sie sechs Proben pro experimenteller Bedingung und stellen Sie die Käfige bei 25 Grad Celsius in einen 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel, um die Drosophila-Zucht abzuschließen. Stellen Sie den Fliegen alle zwei bis drei Tage frisches Futter in einem Vial mit fünf Milliliter Nahrung zur Verfügung, um die Nahrungsqualität insgesamt über 10 Tage aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie die Isolierung, indem Sie die Fliegen aus einem Käfig in einen Glas-Teflon-Down-Homogenisator geben, der mit einem Milliliter gekühltem Isolationspuffer gefüllt ist.

Als Nächstes etwas Mörtel auf Eis geben, um die Mitochondrien intakt zu halten, und die Fliegen mit 15 Stößen homogenisieren. Unter Vermeidung von Drehbewegungen mit dem Pistill das Homogenat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und das Röhrchen fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit 300 × g zentrifugieren. Den Überstand in ein anderes Röhrchen überführen und den Überstand zehn Minuten bei vier Grad Celsius mit 6.000 × g zentrifugieren, um die Mitochondrien anzureichern.

Nach der Zentrifugation das Überstand, der die zytoplasmatische Fraktion enthält, verwerfen. Das Pellet durch Auf- und Abpipettieren in 300 Mikrolitern Waschpuffer resuspendieren. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte vorsichtig für das zweite Käfiggyroskop.

Anschließend die resuspendierten Pellets beider Käfige in einem kryogenen Mikrozentrifugenröhrchen vereinigen und die vereinigten Pellets bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 6.000 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in flüssigem Stickstoff schnell einfrieren. Die mitochondrienangereicherten Fraktionen schließlich bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Dieses Western Blot zeigt eine Anreicherung des mitochondrialen Membrantransportproteins Poin, das als Indikator für die effektive Trennung von Mitochondrien in mitochondrialen Fraktionen dient. Das Poin-Protein ist in zytoplasmatischen Fraktionen nicht nachweisbar, während das Tubulin-Protein, ein zytoplasmatisches Mikrotubulinprotein, in der mitochondrialen Fraktion nicht detektiert wird, was die minimale Kontamination mit zytoplasmatischen Proteinen belegt. Hauptkomponentenanalysen (PCA) wurden unter Verwendung der Werte erstellt, die aus der Massenspektrometrie-Analyse stammen, die auf die Bradford-Proteinkonzentration normalisiert, logarithmisch transformiert und mit minimal beobachteten Werten für jede Verbindung bereinigt wurden.

PCA-Diagramme wurden unter Verwendung vollständiger Metabolitprofile erstellt. Profile aus nativen und veränderten Fliegenstämmen, bei denen unterschiedliche mitochondriale DNA-Metaboliten mit einem standardmäßigen Gesamtfliegen-Extrakt erhalten wurden, können miteinander verglichen werden. Ein PCA-Diagramm von Metaboliten in mitochondrial angereicherten Extrakten zeigt, dass sich die Metabolitprofile aus dem Gesamtpräparat entlang der zweiten Hauptkomponentenachse trennen und die Hauptwirkungen der Rapamycin-Behandlung widerspiegeln. Zwischen den alternativen mtDNA-Genotypen bestehen nur geringfügige Unterschiede.

Im Gegensatz dazu zeigt sich bei den Metabolitenprofilen aus mitochondrial angereicherten Extrakten eine Trennung zwischen dem nativen M-mtDNA-Genotyp auf normalem Futter und den anderen drei Proben, dem nativen mtDNA auf Rapamycin sowie dem alternativen mtDNA entweder auf normalem oder auf Rapamycin-Futter. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung des alternativen mtDNA die Metabolitenprofile in ähnlicher Weise verändert wie die Behandlung mit Rapamycin. Während der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig und wird empfohlen, alle Ansätze am selben Tag durchzuführen, um die Variabilität zwischen den Wiederholungen zu verringern.

Ich empfehle, einen Plan im Voraus vorzubereiten, die Reagenzgläser zu beschriften und die Wartezeiten zwischen den Wiederholungen zu dokumentieren, um die Qualität unserer Probenpräparation zu verbessern.