Name: Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie die Isolation mitochondrialer Fraktionen aus Drosophila melanogaster mittels Differentialzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion subtiler metabolischer Veränderungen in vivo.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Adelphi University Faculty Development Grant und das Grant R15GM113156 von NIGMS, das an EVC vergeben wurde, das Grant R01GM067862 von NIGMS und das Grant R01AG027849 von NIA an DMR.

1. Reagenzien und Lösungen <ol><li> Vorbereitung der Fliege Essen und Medien <ol><li> Wärme fly Inhaltsstoffe 11% Zucker, 2% autolysierte Hefe, 5,2% Maismehl, Agar 0,79% w / v in Wasser in einer Heizplatte bei 90 ° C eingestellt. Rühren regelmäßig, bis eine homogene leicht dichte Mischung erhalten wird. Bereiten Sie ein Endvolumen von 550 ml Fliege Nahrung für insgesamt 100 Fläschchen mit 5 ml Essen Fliegen in jedem. </li><li> Von der Wärmequelle zu entfernen, gelegentlich umrühren, bis das Essen kühlt auf 80 ° C abgekühlt und 0,2% tegosept-Methyl-4-hydroxybenzoat in 95% Ethanol gelöst. </li><li> Teilen Sie die Lebensmittel in zwei gleiche Volumina. Hinzuzufügen 1,1 ml 50 mM Rapamycin in Ethanol zu einem Volumen gelöst und 1,1 ml Ethanol zu dem Teil des Films. Rühren Sie die Rapamycin und die Ethanollösungen in das Lebensmittel. Seien Sie sicher, dass die Temperatur fällt auf 50 ° C, bevor Drogen. </li></ol></li><li> Isolierungspuffer <ol><li> Bereiten Sie 500 ml Isolationspuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 10 mM 3- (N &lt;/ em&gt; morpholino) propansulfonsäure (MOPS) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)] in Wasser. </li><li> Den pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid. Der anfängliche pH-Wert sauer sein. </li><li> Verwenden Sterilfilter Vorratsflaschen mit 0,22 um Porengröße, um Lösung zu sterilisieren, und speichern Sie sie bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Wash Buffer <ol><li> Vorbereitung 500 ml Waschpuffer [225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM Tris HCl und 5 mM KH 2 PO 4] in Wasser. </li><li> Den pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid. Der anfängliche pH-Wert sauer sein. </li><li> Verwenden Sterilfilter Vorratsflaschen mit 0,22 um Porengröße, um Lösung zu sterilisieren, und speichern Sie sie bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Durchführung der Aufzucht der Drosophila-Stämmen <ol><li> Um Larvendichte während der Entwicklung zu steuern, legen Sie 25 Paare von Eltern zu einer Kulturflasche und es ihnen ermöglichen, um Eier für 48 Stunden lag. </li> &lt;li&gt; Eltern entfernen nach 48 h auf Eierdichte zu regulieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 unter Verwendung des Schwellen F1-Nachkommen, also zwei Generationen von dieser Dichtesteuerung erreicht wird. </li><li> Zu den Erwachsenen zu sammeln, zu betäuben die Fliegen unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) und separatem nach Geschlecht. <ol><li> Verwenden Sie eine einzige Stufenregler geliefert reinen CO 2 von einem hohen Druck Tank bei einem kontinuierlichen Fluss von 5 psi. Um statische Elektrizität zu vermeiden, Kunststoffschlauch, um das CO 2 in einen 500 ml Saugflasche mit Wasser zu katalysieren. </li><li> Verwenden Sie einen Gummistopfen mit einem Loch, um den Kolben zu versiegeln. Verwenden Sie Kunststoffschlauch, um die seitliche Öffnung des Kolbens zu einer CO 2-Pad zu verbinden. </li><li> Legen Sie die Fliegen in der Unterlage für nicht mehr als 10-15 Minuten. Lassen Sie sich von der Anästhesie während 24 Stunden zu erholen, bevor Sie sie in experimentellen Bedingungen. </li></ol></li><li> Um genügend Metaboliten für mitochondriale angereicherten Fraktionen zu erzeugen, verwenden Sie 300 Fliegen je Probe. Hier verwenden Weibchen, aber gender kann in anderen Experimenten abweichen. Übertragen Sie 150 Fliegen auf einen hausgemachten 1 L Demographie Käfig. Ermöglichen den Zugang zu 5 ml Fliege Essen in einem Fläschchen. </li><li> Übertragen Sie die verbleibenden 150 Fliegen auf einen anderen 1 L Käfig. Käfige übervölkern nicht mit mehr als 150 Fliegen. </li><li> Verwenden Sie sechs Parallelproben pro Versuchsbedingung. Seit gesamte tierische Extrakte liefern weitere Stoffwechselprodukte, zu erzeugen 1 Probe von Voll Tier isoliert, übertragen 50 weibliche fliegt in einem Käfig. Wie für die mitochondriale Isolate, verwenden sechs Parallelproben pro Versuchsbedingung. </li><li> Ort Käfigen bei 25 ° C mit dem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit. </li><li> Für Frischnahrungs alle 2 oder 3 Tage in einem Fläschchen mit 5 ml von Lebensmitteln, um die Lebensmittelqualität aufrecht zu erhalten. </li><li> Pflegen Fliegen auf Nahrung für 10 Tage. Dieser Schritt wird für die Rapamycin-Behandlung 7 notwendig. Andere Behandlungen oder Bedingungen unterscheiden. </li></ol> 3. Isolierung der mitochondrialen Fraktionen <ol><li> Dump fliegt von einem Käfig (150 Linie) in eineGlas-Dounce-Homogenisator mit Teflon mit 1 ml gekühltem Isolationspuffer gefüllt. </li><li> Homogenisieren, indem Sie den Stößel nach oben und unten für 15 Schlägen. Halten Sie den Mörtel auf Eis, um Mitochondrien intakt zu halten. </li><li> Übertragungs Homogenisat in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Nehmen den Überstand und zentrifugieren bei 6.000 × g für 10 min bei 4 ° C für Mitochondrien zu bereichern. </li><li> Da der Überstand enthält die cytosolische Fraktion, den Überstand verwerfen oder verwenden sie für alternative Experimente. Das Pellet in 300 ul Waschpuffer. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,5 für den zweiten Käfig. Kombinieren Sie die resuspendierten Pellets beider Käfige in einer Tieftemperatur-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 6000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und Flash-einfrieren das Pellet in flüssigem Stickstoff. </li><li> Bewahren Sie die mitochondriale angereicherten Fraktionen bei -80 ° C oder niedriger Temperatur. <ol><li> Alternativ können für ganze Tiervorgereitung, legen Sie die Erwachsenen in einer Tieftemperatur-Mikrozentrifugenröhrchen. Flash-einfrieren Die Durchstechflasche im flüssigen Stickstoff und speichern Erwachsenen bei -80 ° C oder niedriger Temperatur. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
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<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: 1) die Aufzucht genug Fliegen in reichlich Platz. Es ist sehr wichtig, um die Demographie Käfigen mit mehr als 150 Fliegen je nicht übervölkern; 2) Veränderung der Lebensmittel der Käfige häufig Nahrungskonkurrenz und Ernährungs Stress zu vermeiden; und 3) die Beibehaltung aller Proben bei 4 ° C, um die Integrität während der Isolierung der mitochondrialen Fraktion zu gewährleisten. Es wird auch empfohlen, den Isolationspuffer, der Waschpuffer und das Glas-Dounce-Homoge...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, angereicherten mitochondriale Fraktionen, die genug mitochondrialen Metaboliten für Metabolomics-Studien mit Drosophila melanogaster Ausbeute zu entwickeln. Nach unserer Erfahrung Metabolomics-Analyse unter Verwendung von Vollzellextraktionsverfahren sind nicht imstande, subtile mitochondrialen Stoffwechselveränderungen in Drosophila zu erkennen. , Mitochondriale Fraktionierung vor der Metabolomics-Analyse erhöht jedoch die Empfindlichkeit auf der mitochondrialen Metaboliten Verschiebungen zu identifizieren. Mitochondrien sind Organellen zur Bereitstellung 90% der Energie, die Zellen brauchen für die normale Funktion 1 verantwortlich. In den letzten Jahren hat man erkannt, dass Mitochondrien spielen in zellulären und organismischen Funktion eine viel dynamischere Rolle als nur die Herstellung Adenosintriphosphat (ATP) und sind nun als Knotenpunkte für die Regulierung der metabolischen Homöostase 2,3 angesetzt. Mitochondrien sind das Ergebnis eine endosymbiontische Verfahren, bei dem distinct mikrobiellen Linien verschmolzen ~ Vor 1500000000 Jahre 4. Als Mitochondrien in wahre Organellen entwickelt wurden Gene aus der Endosymbionten in der entstehenden Kerngenom integriert. Bei Tieren heute sind ca. 1500 mitochondriale Proteine ​​kerncodierten während 37 Gene in der mtDNA, von denen 13 kodieren mitochondriale Proteine, die Untereinheiten der Enzymkomplexe der oxidativen Phosphorylierung 5 bleibt. Die Koordinierung zwischen den Mitochondrien und Kernfächer benötigt wird, um die ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien zu halten. Mit den hier beschriebenen Methoden konnten wir mitochondriale Stoffwechselveränderungen in Drosophila, die von Manipulation der Abstimmung zwischen mitochondrialer und nuklearer Genome führen zu erkennen. Wir verwendeten einen Stamm von Drosophila, in der mtDNA von ihrer Schwesterarten D. simulans wurde an einem einzigen D. platziert melanogaster Kern Hintergrund 6. Diese &#39;gestört&#39; mitonuclearGenotyp wurde auf die &quot;native&quot;, oder co-entwickelt mitonuclear Genotyp D. Vergleich melanogaster, die dasselbe Kerngenom mit seiner nativen D. melanogaster mtDNA. Die D. melanogaster und D. simulans mtDNAs unterscheiden sich um ~ 100 Aminosäuren und&gt; 500 auch Substitutionen, die mitonuclear Kommunikations 7,8 beeinflussen. Wir erzeugten gesamten Fliegenextrakten und mitochondriale angereicherte Extrakte Metabolit Verschiebungen als Reaktion auf pharmakologische Stress zu studieren. Hier zeigen wir, dass bei der Verwendung der mitochondrialen angereicherten Fraktionen wir erkennen ausgeprägte Veränderungen in der mitochondrialen Metaboliten zwischen dem nativen, co-entwickelt Genotyp tragenden D. melanogaster mtDNAs und die aufgebrochenen Genotyp tragen D. simulans mtDNA. Im Gegensatz dazu sind die Stoffwechselveränderungen zwischen diesen beiden Genotypen subtile Verwendung normaler Verfahren, die gesamte fly Extrakt zu verwenden. Daher, sofern diese Methode einen Weg, um zu verstehen, wie mtDNAs vermitteln mitochondrialen VeränderungenReaktion auf verschiedene Medikamente.

<table><tbody><tr><td>0,2 % Tegosept-Methyl-4-hydroxybenzoat</td>, <td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr>, <tr><td>Saccharose</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>S9378</td><td></td></tr>, <tr><td>3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Pads zur Betäubung von Fliegen</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L Käfig</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L Käfigdeckel</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>ein Glas-Teflon-Homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>LC Laboratorien&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Porin</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Tubulin</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Pad</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>Filterflasche</td><td>enasco</td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>Gummistopfen</td><td>enasco</td><td>S08512M</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der mitochondrial angereicherten fraktionen für die stoffwechselanalyse in<em&gt; drosophila</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Da Mitochondrien eine Rolle im Aminosäurestoffwechsel, im Kohlenhydratstoffwechsel und in der Fettsäureoxidation spielen, beeinträchtigen Defekte in der mitochondrialen Funktion oft das Leben derjenigen, die an diesen komplexen Krankheiten leiden. Die Erkennung von mitochondrialen metabolischen Veränderungen ist entscheidend für das Verständnis mitochondrialer Erkrankungen und mitochondrialer Reaktionen auf pharmakologische Wirkstoffe. Obwohl der mitochondriale Stoffwechsel den Kern der Stoffwechselregulation bildet, kann der Nachweis subtiler Veränderungen im mitochondrialen Stoffwechsel durch die Überrepräsentation anderer zytosolischer Metaboliten behindert werden, die durch Extraktionen aus dem gesamten Organismus oder ganzem Gewebe gewonnen wurden. 
Hier beschreiben wir eine Isolationsmethode, die ausgeprägte mitochondriale metabolische Veränderungen in Drosophila feststellte, die zwischen Ganzfliegen- und mitochondrial angereicherten Präparaten unterschieden wurden. Um die Sensitivität dieser Methode zu veranschaulichen, verwendeten wir eine Gruppe von Drosophila, die genetisch unterschiedliche mitochondriale DNAs (mtDNA) beherbergen, und setzten sie dem Medikament Rapamycin aus. Mit dieser Methode konnten wir zeigen, dass Rapamycin den mitochondrialen Metabolismus in Abhängigkeit vom mitochondrialen Genotyp verändert. Diese Veränderungen sind jedoch in Metabolomik-Studien viel deutlicher, wenn Metaboliten aus mitochondrial angereicherten Fraktionen extrahiert wurden. Im Gegensatz dazu wurden in ganzen Gewebeextrakten Stoffwechselveränderungen, die durch den Wirkstoff Rapamycin vermittelt wurden, nur unabhängig von mtDNAs nachgewiesen.

Verwendung des Protokolls oben erläutert, metabolomic Analyse führten wir auf die mitochondriale angereicherten Fraktionen und ganzen Tierextrakten, um die Wirkung des Medikaments auf Rapamycin abweichenden mtDNAs 7 testen. Wir lieferten 200 uM von Rapamycin durch Lösen des Arzneistoffs in der Flug Nahrung. Fliegen wurden Rapamycin für 10 Tage ausgesetzt. Stoffwechselprodukte aus Vollfliegenextrakten und von mitochondrialen Extrakte wurden mit Hilfe der Gaschromatographie...

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels und der Homöostase. Subtile Veränderungen im mitochondrialen Stoffwechsel, die die Physiologie des Organismus beeinflussen, könnten in Metabolomik-Studien des gesamten Organismus schwer zu erkennen sein. Hier beschreiben wir eine Isolationsmethode, die den Nachweis subtiler metabolischer Verschiebungen bei Drosophila melanogaster verbessert.

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, angereicherte mitochondriale Fraktionen zu gewinnen, die ausreichend mitochondriale Metaboliten für metabolomische Untersuchungen unter Verwendung von Drosophila melanogaster liefern. Dies wird erreicht, indem zunächst eine ausreichende Menge an Fliegen gezüchtet wird, um genügend Metaboliten für die anzureichernden mitochondrialen Fraktionen zu erhalten. Im zweiten Schritt werden die Fliegen in einem Glas-Teflon-Downton-Homogenisator homogenisiert, wodurch die Zellmembran zerkleinert wird, ohne die Integrität der Mitochondrien zu schädigen.Anschließend werden die Homogenate einer Differenzzentrifugation unterzogen, um angereicherte mitochondriale Proben zu gewinnen. Die Ergebnisse zeigen, dass mit diesem Protokoll deutliche mitochondriale Stoffwechselveränderungen nachgewiesen wurden, die bei einer ausschließlich auf ganzheitlicher Metabolomanalyse basierenden Untersuchung von mitochondrial angereicherten Fraktionen und Gesamtextrakten aus Tieren nicht erfasst wurden. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens im Vergleich zur Metabolomanalyse ganzer Fliegen liegt darin, dass die Isolierung von Mitochondrien vor der metabolomischen Analyse eine erhöhte Empfindlichkeit und einen besseren Nachweis von Veränderungen im mitochondrialen Metabolitenprofil ermöglicht.Um das Experiment zu beginnen, erhitzen Sie die Futtermittelzutaten für die Fliegen auf einem Heizgerät auf 90 Grad Celsius. Rühren Sie die Mischung regelmäßig um, bis sie homogen und leicht dickflüssig ist. Nehmen Sie das Futter von der Wärmequelle und rühren Sie gelegentlich weiter, wenn das Futter auf 80 Grad Celsius abgekühlt ist, und geben Sie dann 0,2 % TE Decept Methyl 4-Hydroxybenzoat, gelöst in 95 % Ethanol, hinzu. Danach teilen Sie das Futter in zwei gleiche Volumina auf.Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Nahrung auf 50 Grad Celsius abgesunken ist, und rühren Sie 1,1 Milliliter 50 Millimolar Rapamycin, gelöst in Ethanol, in ein Volumen und 1,1 Milliliter unbehandeltes Ethanol in das zweite Volumen ein. Zum Sammeln der erwachsenen Tiere verwenden Sie einen Einstufenregler, um reines Kohlendioxid aus einem Hochdrucktank zuzuführen. Bei einem kontinuierlichen Durchfluss von fünf PS vermeide ich statische Elektrizität, indem ich ein Plastikrohr verwende, um das Kohlendioxid in einen 500-Milliliter-Filterkolben mit Schlauchleitung zu leiten, wodurch das Kohlendioxid durch Wasser gebubbelt wird.Verwenden Sie dazu einen Gummistopfen mit einem Loch, um den Kolben abzudichten. Verbinden Sie einen Kunststoffschlauch vom seitlichen Anschluss des Kolbens mit einem Kohlendioxid-Pad, um die Larvaldichte während der Entwicklung zu kontrollieren. Geben Sie 25 Elternpaare in eine Kulturfalsche und lassen Sie sie 48 Stunden lang Eier legen.Entfernen Sie anschließend die Elterntiere, um die Eisdichte zu regulieren, und wiederholen Sie diese Schritte mit den schlüpfenden F1-Nachkommen, um zwei Generationen lang diese Dichtekontrolle aufrechtzuerhalten. Nach zwei Generationen unter dichtegekontrollten Bedingungen werden die Fliegen nach Geschlecht getrennt und für nicht länger als 10 bis 15 Minuten auf das Polster gelegt. Lassen Sie die Fliegen 24 Stunden lang von der Anästhesie genesen, bevor Sie sie den experimentellen Bedingungen aussetzen.Weisen Sie 300 Fliegen pro Probe zu, um ausreichend Metaboliten für mitochondrienangereicherte Fraktionen zu gewinnen. Überführen Sie 150 Fliegen in einen selbstgebauten Ein-Liter-Käfig. Überführen Sie anschließend die verbleibenden 150 Fliegen in einen separaten Ein-Liter-Käfig und überbevölkern Sie die Käfige nicht mit mehr als 150 Fliegen.Verwenden Sie sechs Proben pro experimenteller Bedingung und stellen Sie die Käfige bei 25 Grad Celsius in einen 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel, um die Drosophila-Zucht abzuschließen. Stellen Sie den Fliegen alle zwei bis drei Tage frisches Futter in einem Vial mit fünf Milliliter Nahrung zur Verfügung, um die Nahrungsqualität insgesamt über 10 Tage aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie die Isolierung, indem Sie die Fliegen aus einem Käfig in einen Glas-Teflon-Down-Homogenisator geben, der mit einem Milliliter gekühltem Isolationspuffer gefüllt ist.Als Nächstes etwas Mörtel auf Eis geben, um die Mitochondrien intakt zu halten, und die Fliegen mit 15 Stößen homogenisieren. Unter Vermeidung von Drehbewegungen mit dem Pistill das Homogenat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und das Röhrchen fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit 300 × g zentrifugieren. Den Überstand in ein anderes Röhrchen überführen und den Überstand zehn Minuten bei vier Grad Celsius mit 6.000 × g zentrifugieren, um die Mitochondrien anzureichern.Nach der Zentrifugation das Überstand, der die zytoplasmatische Fraktion enthält, verwerfen. Das Pellet durch Auf- und Abpipettieren in 300 Mikrolitern Waschpuffer resuspendieren. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte vorsichtig für das zweite Käfiggyroskop.Anschließend die resuspendierten Pellets beider Käfige in einem kryogenen Mikrozentrifugenröhrchen vereinigen und die vereinigten Pellets bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 6.000 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in flüssigem Stickstoff schnell einfrieren. Die mitochondrienangereicherten Fraktionen schließlich bei minus 80 Grad Celsius lagern.Dieses Western Blot zeigt eine Anreicherung des mitochondrialen Membrantransportproteins Poin, das als Indikator für die effektive Trennung von Mitochondrien in mitochondrialen Fraktionen dient. Das Poin-Protein ist in zytoplasmatischen Fraktionen nicht nachweisbar, während das Tubulin-Protein, ein zytoplasmatisches Mikrotubulinprotein, in der mitochondrialen Fraktion nicht detektiert wird, was die minimale Kontamination mit zytoplasmatischen Proteinen belegt. Hauptkomponentenanalysen (PCA) wurden unter Verwendung der Werte erstellt, die aus der Massenspektrometrie-Analyse stammen, die auf die Bradford-Proteinkonzentration normalisiert, logarithmisch transformiert und mit minimal beobachteten Werten für jede Verbindung bereinigt wurden.PCA-Diagramme wurden unter Verwendung vollständiger Metabolitprofile erstellt. Profile aus nativen und veränderten Fliegenstämmen, bei denen unterschiedliche mitochondriale DNA-Metaboliten mit einem standardmäßigen Gesamtfliegen-Extrakt erhalten wurden, können miteinander verglichen werden. Ein PCA-Diagramm von Metaboliten in mitochondrial angereicherten Extrakten zeigt, dass sich die Metabolitprofile aus dem Gesamtpräparat entlang der zweiten Hauptkomponentenachse trennen und die Hauptwirkungen der Rapamycin-Behandlung widerspiegeln. Zwischen den alternativen mtDNA-Genotypen bestehen nur geringfügige Unterschiede.Im Gegensatz dazu zeigt sich bei den Metabolitenprofilen aus mitochondrial angereicherten Extrakten eine Trennung zwischen dem nativen M-mtDNA-Genotyp auf normalem Futter und den anderen drei Proben, dem nativen mtDNA auf Rapamycin sowie dem alternativen mtDNA entweder auf normalem oder auf Rapamycin-Futter. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung des alternativen mtDNA die Metabolitenprofile in ähnlicher Weise verändert wie die Behandlung mit Rapamycin. Während der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig und wird empfohlen, alle Ansätze am selben Tag durchzuführen, um die Variabilität zwischen den Wiederholungen zu verringern.Ich empfehle, einen Plan im Voraus vorzubereiten, die Reagenzgläser zu beschriften und die Wartezeiten zwischen den Wiederholungen zu dokumentieren, um die Qualität unserer Probenpräparation zu verbessern.

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung in Drosophila Melanogaster Larven und adulten Gehirn. Eine metabolische Analyzer ist eine angepasste und optimierte Protokoll genutzt. Micro-Gewebe Fesseln waren sind ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls entworfen und speziell für den Einsatz in dieser Analyse erstellt.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

In dieser Arbeit stellen wir ein hochauflösendes Respirometrie-Protokoll zur Analyse der Bioenergetik in PINK1 B9-Null-mutierten Fruchtfliegen vor. Die Methode verwendet das SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Lernen Sie die Isolation mitochondrialer Fraktionen aus Drosophila melanogaster mittels Differentialzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion subtiler metabolischer Veränderungen in vivo.

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in

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