Schnelle In-situ- Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle in C two-Hybridisierung an paraformaldehyd-präfixiertem Hirngewebe durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Hirngewebeabschnitte dehydriert und die Schnitte mit den Reagenzien eins, zwei und drei vor der Behandlung behandelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Schnitte mit primären Oligonukleotidsonden und dann mit zweiten, dritten und vierten Sonden zu hybridisieren.

Fügen Sie als Nächstes ein schnelles rotes Substrat hinzu, um die Ziel-RNA nachzuweisen. Der letzte Schritt besteht darin, den Pegel der mRNA-Signale mit der Image J-Software zu quantifizieren. Letztendlich können Veränderungen in der RNA-Genexpression durch den Vergleich der Versuchs- und Kontrollgruppe erhalten werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie relativ einfach und kostengünstig reproduzierbar ist und weniger als zwei Tage dauert. Diese Arbeit wurde von mir und John Jay Lenan von der Ross University School of Veterinary Medicine und Jean Soza und RU Tao vom College of Medicine der Florida Atlantic University entwickelt. Bei diesem Verfahren entnimmt sie bei der Dehydrierung vier Objektträger aus Objektträgerboxen, die im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Ordnen Sie die Abschnitte den Tests P-P-I-B-D-A-P-B und HT zu, markieren Sie zwei A-Gene und beschriften Sie diese mit einem Kugelschreiber. Tauchen Sie die Objektträger anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 100%igen Alkohol. Trocknen Sie dann die Objektträger fünf Minuten lang im Abzug für die Vorbehandlung, pipettieren Sie 20 Mikroliter der Vorbehandlung, ein Reagenz auf jeden Abschnitt, legen Sie die Objektträger auf eine Gestellschiene in einer Feuchtigkeitsschale.

Schütteln Sie die Feuchtigkeitsschale auf einem horizontalen Shaker 10 Minuten lang vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit. Waschen Sie die Objektträger dann zweimal zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Objektträger in ein 1000-Milliliter-Becherglas, in dem sich 450 Milliliter des Vorbehandlungs-Zwei-Reagenzes befinden.

Kochen Sie anschließend die Objektträger insgesamt fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius, um die RNA-Struktur wiederherzustellen. Waschen Sie die Objektträger danach zweimal jeweils zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser. Legen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in 100%igen Alkohol.

Trocknen Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang. Zeichnen Sie im Abzug mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um den ausgewählten Bereich im Gewebeschnitt. Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter der drei Reagenzien der Vorbehandlung in jeden ausgewählten Bereich, um die Sondenpenetration zu erhöhen, und decken Sie die Feuchtigkeitsschale mit einem Deckel ab.

Stellen Sie dann das Blech in den Hybridisierungsofen, der mit einem horizontalen Schüttler ausgestattet ist. Stellen Sie die Ofentemperatur auf 40 Grad Celsius ein und schütteln Sie das Blech vorsichtig 30 Minuten lang. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal jeweils zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser. Pipettieren Sie in diesem Schritt 10 Mikroliter P-P-I-B-D-A-P-B oder HTR zwei A Sonde auf die ausgewählten Bereiche.

Decken Sie dann die Feuchtigkeitsschale mit einem Deckel ab, um ein Verdampfen des Reagenzes zu verhindern. Schütteln Sie die Objektträger auf dem horizontalen Schüttler vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit, während Sie sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius im Ofen inkubieren. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal jeweils zwei Minuten lang mit Waschpuffer und pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes auf jeden ausgewählten Bereich.

Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten. Waschen Sie dann die Objektträger zweimal zweimal mit Waschpuffer für jeweils zwei Minuten, pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Waschen Sie danach die Objektträger zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer. Pipettieren Sie jedes Mal 10 Mikroliter des Amplifikationsmittels drei Reagenz auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten.

Waschen Sie die Objektträger dann zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer. Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikations-Vier-Reagenzes auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer. Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsmittels fünf Reagenz auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Rutschen anschließend zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer. Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsmittels sechs Reagenz auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Objektträger dann erneut zweimal mit Waschpuffer für jeweils zwei Minuten. Pipettieren Sie nun 10 Mikroliter des roten Reagenzes in jeden ausgewählten Bereich, legen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur in die Feuchtigkeitsschale auf dem horizontalen Shaker und schütteln Sie sie 10 Minuten lang sanft bei niedriger Geschwindigkeit. Waschen Sie die Objektträger dann zweimal 10 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.

Trocknen Sie die Objektträger jedes Mal bei 60 Grad Celsius im Ofen für 15 Minuten. Legen Sie danach die Objektträger für fünf Minuten in Xylol in den Abzug. Pipettieren Sie anschließend 20 Mikroliter Einbettmedien auf Xylolbasis auf jede ausgewählte Fläche und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.

Ziehen Sie in diesem Schritt die Bilddatei per Drag & Drop in das Hauptfenster von Image J. Gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Bild aus. Wählen Sie als Nächstes Typ aus dem Dropdown-Menü aus und wählen Sie acht Bit.

Wählen Sie anschließend Anpassen und dann Schwellenwert aus, um das Dialogfeld zu öffnen. Passen Sie den unteren Balkenwert im Dialogfeld so an, dass der unerwünschte Hintergrund entfernt wird. Gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Analysieren und dann Partikel analysieren, um ein zweites Dialogfeld zu öffnen.

Legen Sie die Partikelgröße auf 10 fest. Wählen Sie als Nächstes Gliederungen anzeigen und dann Anzeigeergebnisse und Zusammenfassungsfelder aus. Klicken Sie abschließend auf OK, um die Partikeldaten in den Dialogfeldern anzuzeigen.

Geben Sie für die Berechnung in der Tabelle die Daten in die Excel-Tabelle ein und berechnen Sie den Durchschnitt der Anzahl der Partikel in der Kochsalzgruppe als Basislinie. Berechnen Sie dann das prozentuale Niveau jedes Abschnitts und erstellen Sie ein entsprechendes Diagramm. Hier sind die lichtmikroskopischen Ansichten der Hybridisierungssignale, die durch die roten Punkte angezeigt werden.

Das Gewebe wurde bei tief anästhesierten Ratten, die zuvor mit Kochsalzlösung und MDMA behandelt worden waren, mit Paraformaldehyd präfixiert. Die verwendeten Oligonukleotidsonden sind D-A-P-B-P-P-I-B und HT zwei A. Diese Abbildung zeigt die Wirkung auf die hypothalamische HT zwei A-Genexpression bei Ratten, die zuvor mit MDMA behandelt wurden, und eine 20%ige Reduktion von HT zwei, eine Expression wurde beobachtet. Diese Technik erleichtert es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, die Genexpression von Botenstoffen zu messen, indem sie die In-situ-Aktivierung auf Paraform, der Höhe vor dem Hirngewebe, verwendet.