Name: Schnelle In-situ- Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Lernen Sie eine schnelle In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden für Rattenhirngewebe. Diese Methode reduziert Verarbeitungszeit und ermöglicht zuverlässige mRNA-Quantifizierung mit ImageJ.

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Diese Studie wurde von den NIH (R15DA029863) unterstützt, der Florida Atlantic University Undergraduate-Forschungsstipendium (M30014) und die Ross University School of Veterinary Medicine Forschungsstipendium. Wir möchten das National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) für die Bereitstellung von (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) für diese Arbeit danken.

Unten beschriebenen Tiernutzung Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) bei Ross University School of Veterinary Medicine und Florida Atlantic University zugelassen. Obwohl sterile Techniken und Handschuhe erforderlich sind, ist die RNase-freie Umgebung nicht notwendig, während Sie dieses Protokoll. 1. Vorbereitung <ol><li> Gewebepräparation und Schneiden <ol><li> Vergeben Ratten zufällig in drei Gruppen: frisch / Salzlösung (SAL; 0,9% NaCl), vorangestellt ist / SAL und voran / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, siehe Angaben in Tabelle 1). </li><li> Verwalten drei Dosen von 1 ml / kg SAL und 10 mg / kg intraperitoneal MDMA, die jeweils mit den SAL und MDMA Gruppen 2 Stunden-Intervall. Lassen Sie Tiere, die Behandlung für 6 Tage zu überleben. </li><li> Am 7. Tag verabreichen 100 mg / kg Ketamin in Kombination von 5 mg / kg Xylazin intraperitoneal den Ratten nach einem tiefe Narkose (dh Verlust an Hornhaut blinken und tail kneifen Reflexe). </li><li> Für die Frisch / SAL-Gruppe, schnell zu enthaupten Ratten und entfernen Sie das Gehirn für die frischen Gehirn-Test (siehe Details in der Referenz 5). </li><li> Für die voran / SAL und voran / MDMA Gruppen, machen einen Schnitt entlang des Brustbeins etwa 10 bis 12 cm und dann setzen die Ende des Brustbeins. </li><li> Halten Sie das Ende des Brustbeins mit einer Gefäßklemme und schneiden Sie die Membran seitlich auf beiden Seiten mit einer scharfen Schere und dann nach oben geschnitten auf den Rippen und parallel zu den Lungen. </li><li> Mit einer Hand halten Sie die ventralen Spitze der Herzen mit kleinen Zange. Mit der anderen Hand, durchbohren die linke Herzkammer mit einer 18 G Injektionsnadel (beachten Sie den Adapter Seite der Nadel ist mit einem Y-förmigen Silizium-Schlauch an eiskalten SAL und Para Behälter und Schlauchpumpen verbunden, siehe die Referenz 9). </li><li> Schalten Sie den SAL Pumpe an der mittleren Ebene der Flussrate (~ 5 ml / min) und Punktion der rechten Vorhof mit der Zange, um das Entweichen der Rückkehr circ ermöglichenlation. Aufrechtzuerhalten SAL Perfusion für 30 min. </li><li> Schalten Sie den Parapumpe auf mittlerem Niveau und lassen Sie das eiskalte 4% Paraformaldehyd, das Tier für 30 Minuten durchströmen. </li><li> Entfernen Perfusion Instrument und enthaupten das Tier. Einen posteroanterior durch die Mittellinie des Schädels geschnitten und dann flattern den Schädel, um die Schädelhöhle 10 freizulegen. </li><li> Entfernen des Gehirns mit einem Spatel aus der Schädelhöhle und legen das Gehirn in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, das 25 ml von 4% igem Paraformaldehyd. Halten das Gehirn innerhalb des Parahaltigen Röhrchen bei 4 ºC Kühlschrank für 24 Stunden. </li><li> Bewegen das Gehirn in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, das 25 ml 30% Saccharose-Lösung bei 4 ° C für 3 Tage. Schließlich speichert das Gehirn in Plastiktüten bei -80 ° C bis Gebrauch. </li><li> Montieren Sie das Gehirn auf einem Spannfutter mit Einbettungsmittel und frieren die Einbettungsmittel Gehirn enthält, in einem Kryostaten bei einer Temperatur von -26 ºC. Schneiden Sie den frisch eingefrorenn Gehirn in 20 um Abschnitte und Para-Präfix Gehirn in 10 &amp; mgr; m-Abschnitte. Übertragen Sie den Abschnitt zu einem RT Mikroskop-Objektträger, indem Sie den Schieber auf den Abschnitt. </li><li> Luft trocknen bei Raumtemperatur für 4 Stunden. Bewahren Sie die Sektion Folien in einer dicht verschlossenen Beutel bei -80 ° C bis Gebrauch. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Nehmen Objektträger aus dem -80 ° C Gefrierschrank und weisen Abschnitte in eine von drei Tests: HT2A, PPIB (positive Kontrolle) oder dapB (Negativkontrolle); Zeichen und Etikettenabschnitte mit einem Kugelschreiber (nicht mit einem Bleistift). Tauchen Sie Folien in 100% Alkohol bei Raumtemperatur für 5 min. Trocknen Sie die Objektträger für 5 min in einer Abzugshaube. </li></ol></li><li> Vorbehandlung <ol><li> Je 20 ul der Vorbehandlung-1-Reagens (Inaktivierung von alkalischer Phosphatase) zu den Abschnitten auf Objektträger. Objektträger auf einem Rack-Schiene in einer feuchtigkeitsFach (beachten Sie, dass die Schale mit einem Deckel abgedeckt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu verhindern, daß Verdampfung aus dem Reaktions solutio pflegenn). </li><li> Schütteln des Feuchtigkeits Tablett auf einem Horizontalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit für 10 min. Zweimal für 2 min Waschen Sie die Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Tauchen die Folie in einem 200 ml Becherglas, das 150 ml der Vorbehandlungs-2-Reagenz (Brechen der Querverbindungen von Paraformaldehyd Fixierung induziert). Man kocht die Folien für eine Gesamtzahl von 5 min bei 100 ºC (wärmeinduzierte Wiederherstellung der RNA-Struktur 11). </li><li> Zweimal für 2 min Waschen Sie die Objektträger mit ddH 2 O. Objektträger in 100% Alkohol für 5 min. Trocknen Sie die Objektträger für 5 Minuten im Abzug. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um einen Kreis um den ausgewählten Bereich im Gewebeschnitt zu ziehen (zB nicht-kortikalen Strukturen, einschließlich Thalamus und Hypothalamus, wie in 2 beschrieben). </li><li> Je 10 ul der Vorbehandlung-3-Reagenz (Anstieg der Sondenpenetration) zu jedem ausgewählten Bereich, und decken den Feuchtefach mit dem Deckel. Legen Sie das Fach in der Hybridisierungsofenmit dem Horizontalschüttler ausgestattet und stellen Sie die Ofentemperatur bei 40 ºC; schütteln Sie das Fach für 30 min. Zweimal für 2 min Waschen Sie die Objektträger mit ddH 2 O. </li></ol></li></ol> 2. Die Hybridisierung und Amplifikation <ol><li> Pipette 10 ul HTR2A, PPIB und dapB Sonde Reagenzien jeweils auf den ausgewählten Bereichen. Decken den Feuchtigkeitsschale mit dem Deckel um eine Verdampfung des Reagens zu verhindern. Schütteln Sie auf dem Horizontalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit eingestellt. Die Folien bei 40 ºC inkubieren in den Ofen für 2 Stunden. </li><li> Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-1 Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 30 min. </li><li> Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-2-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 15 min. </li><li> Zweimal w Waschen Sie die Objektträgerit einem Waschpuffer für 2 min. Je 10 ul der Amplification-3 Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 30 min. </li><li> Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-4-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei 40 ° C für 15 min. </li><li> Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-5-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei Raumtemperatur 30 min. </li><li> Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. Je 10 ul der Amplification-6-Reagenz auf jedem ausgewählten Bereich, schütteln und Inkubation der Objektträger bei Raumtemperatur für 15 min. Zweimal mit einem Waschpuffer für 2 min Waschen der Objektträger. </li></ol> 3. Signalerkennung <ol><li> Je 10 ul der Red-Reagenz zu jedem ausgewählten Bereich (Beachten Sie, dass das Reagenz ist eine Mischung aus Rot-B und Red-A bei einem 1:60 Verhältnis und sollte ich nutzennmittelbar). Legen Sie die Folie in der Feuchtigkeit Tablett auf dem Horizontalschüttler bei RT und leicht schütteln bei niedriger Geschwindigkeit für 10 min. </li><li> Zweimal für 10 min Waschen Sie die Objektträger mit (ddH 2 O). Trocknen Sie die Objektträger bei 60 ° C in den Ofen für 15 Minuten. Objektträger in Xylol unter dem Abzug für 5 min. Je 20 &amp; mgr; l Xylol-basierten Montagemedium auf jeder ausgewählten Bereichs und mit einem Deckglas. </li></ol> 4. Bildaufnahme <ol><li> Nehmen digitale Mikrofotografien von den ausgewählten Bereichen (z, Hypothalamus, Figuren 1 und 3) mit einer Vergrößerung von 4 × 20 × und Objektivlinsen. Speichern Sie die Bilddatei. </li></ol> 5. Teilchenbildanalyse <ol><li> Ziehen Sie die Bilddatei in den Haupt ImageJ Fenster. Gehen Sie auf die Menüleiste und wählen Sie &#39;Bild&#39;, neben auswählen &#39;Type&#39; aus dem Dropdown-Menü, und wählen Sie &quot;8-Bit&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Anpassen&quot;, und wählen Sie &quot;Threshold &#39;, um das Dialogfeld zu öffnen. Stellen Sie die untere Stange Wert im Dialogfeld, so dass die unerwünschte Hintergrund wird entfernt. Gehen Sie in der Menüleiste und wählen Sie &quot;Analysieren&quot;, wählen Sie dann &quot;Analyze Particles&quot;, um ein zweites Dialogfeld zu öffnen. </li><li> Stellen Partikelgröße bei 10, nächste Option &quot;umreißt anzeigen&quot; und wählen Sie &quot;Ergebnis anzeigen&quot; und &quot;Zusammenfassen&quot; Boxen. Schließlich klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um die Partikeldaten in den Dialogfeldern anzuzeigen. </li></ol> 6. Tabellenkalkulation <ol><li> Geben Sie die Daten in die Excel-Tabelle und der Mittelwert der Anzahl der Partikel in der SAL-Gruppe als Grundlinie. Berechnen Sie die prozentuale Höhe der einzelnen Abschnitte und machen einen Graphen entsprechend (Abbildung 4). </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
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<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
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<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
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<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Eines der Hauptanliegen des In-situ-Hybridisierungstests ist die Auswahl geeigneter Techniken für die RNA-Konservierung aufgrund von RNase-Enzymen. Es ist allgemein bekannt, dass diese Enzyme in den Zellen und in der Umwelt weit verbreitet sind und die Ergebnisse beeinflussen können. Die Enzymaktivität kann jedoch schnell unterschieden werden, indem das Gewebe in die Trockeneis-Alkohol-Lösunggelegt wird 5,12. Obwohl eine schnelle Konservierung für die Hybridisierung mit einer Ribosonde13 en...

Das Serotonin-Syndrom (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) ist eine akute neurologische Störung, die durch 5-HT-fördernde Medikamente wie Antidepressiva verursachtwird 1 und auch in Situationen des MDMA-Konsums zu Freizeitzwecken auftritt2. Die molekularen Mechanismen, die für Stimmungsschwankungen, Lern- und Gedächtnisdefizite verantwortlich sind, die im Zusammenhang mit dem akuten Syndrom auftreten, sind nicht gut verstanden3,4. Die In-situ-Hybridisierung ist ein leistungsfähiges Forschungsinstrument, das den Nachweis und die Quantifizierung spezifischer mRNAs ermöglicht, die möglicherweise auf Einzelzellebene exprimiert werden. Die herkömmliche Methode zur Durchführung einer In-situ-Hybridisierung besteht darin, eine radioaktiv markierte Ribosonde zu verwenden, die das interessierende Gen spezifisch hybridisiert. Ein großer Nachteil ist jedoch, dass die Methode komplizierte und zeitaufwändige Sondenvorbereitungs- und Hybridisierungsschritte sowie den Zugang zu frischen gefrorenen Geweben erfordert, die in einer RNase-freien Umgebung aufbewahrt werden5,6. 
Oligonukleotidsonden wurden kürzlich entwickelt, um kürzere RNA-Fragmente zu hybridisieren, als sie für Ribosonden benötigt werden7. Darüber hinaus erzeugen die Sonden ein geringes Hintergrundsignal, ohne die Spezifitätzu beeinträchtigen 8. Diese neu entwickelte Sondentechnologie kann in situ Hybridisierung auf paraformaldehyd-präfixiertes Hirngewebe angewendet werden, das in immunzytochemischen Laboratorien üblich ist.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die in situ Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden an Rattengehirn mit Paraformaldehyd-Präfix und vergleichen die Ergebnisse mit denen, die in einem frisch gefrorenen Gehirn beobachtet wurden5,6. Dieses Protokoll wird verwendet, um die Hypothese zu testen, dass MDMA-Substanzmissbrauch Veränderungen in der htr2a-mRNA des 5-HT2A-Rezeptorgens im Gehirn verursacht. Wir begannen das Verfahren mit einer MDMA-Behandlung, gefolgt von einer Paraformaldehyd-Gewebeperfusion des Tieres, einer In-situ-Hybridisierung der thr2a-Sonde und einer Datenanalyse. Beachten Sie, dass dapB (das bakterielle Gen, das für Dihydrodipicolinat-Reduktase kodiert) als Negativkontrolle und ppiB (Housekeeping-Gen, das für Peptidylprolyl-Isomerase B kodiert) als Positivkontrolle verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>RNAscope Negativkontrollsonde-DapB</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reagenzienkit - Red</td><td>Advanced Zelldiagnostik, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Sonde - Rn-Ppib</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Htr2a</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaler Schüttler</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober</td><td>Stift Vektor</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle<em&gt; in-situ-</em&gt; hybridisierung unter verwendung von oligonukleotidsonden auf paraformaldehyd-präfix gehirn von ratten mit serotonin-syndrom

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Die Toxizität von 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA; Ecstasy) kann aufgrund eines akuten Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT)-Syndroms regionsspezifische Veränderungen in der serotonergen mRNA-Expression verursachen. Diese Hypothese kann mit Hilfe von in situ Hybridisierung zum Nachweis des Serotonin-5-HT 2A-Rezeptor-Gens htr2a getestet werden. In der Vergangenheit waren solche Verfahren mit radioaktiver Ribosonde aufgrund des komplizierten Arbeitsablaufs, der mehrere Tage in Anspruch nimmt, und der zusätzlichen Schwierigkeit, dass die Technik die Verwendung von frischem gefrorenem Gewebe erforderte, das in einer RNase-freien Umgebung aufbewahrt wurde, schwierig. In jüngster Zeit hat die Entwicklung kurzer Oligonukleotidsonden die In-situ-Hybridisierungsverfahren vereinfacht und die Verwendung von Hirnschnitten mit Paraformaldehyd-Präfix ermöglicht, die in Laboratorien häufiger verfügbar sind. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit nicht-radioaktiven Oligonukleotidsonden auf dem vorfixierten Hirngewebe. Zu den für diese Studie verwendeten Hybridisierungssonden gehören dapB (ein bakterielles Gen, das für Dihydrodipicolinat-Reduktase kodiert), ppiB (ein Housekeeping-Gen, das für Peptidylprolyl-Isomerase B kodiert) und htr2a (ein Serotonin-Gen, das für 5-HT2A-Rezeptoren kodiert). Diese Methode ist relativ einfach, kostengünstig, reproduzierbar und benötigt weniger als zwei Tage, um abgeschlossen zu werden.

Unter Verwendung der Oligonukleotid-RNA-Sonden (&lt;25 nt), kann die Hybridisierung als rote Punkte im Hypothalamus Zellen von den Para-Präfix und frisch gefrorenes Hirn hergestellt nachgewiesen werden. Die HTR2A mRNA-Moleküle sind in einigen Zellen (durch durchgezogene Pfeile) vorhanden, aber andere nicht (offene Pfeile). Wir beobachteten, dass es keinen Unterschied zwischen der Paraformaldehyd-Präfix und die frisch gefrorenes Gewebe (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Hybridisierung kann zuerst ...

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und vereinfachte in situ Hybridisierungsmethode, die ideal für das Gehirn mit Paraformaldehyd-Präfix ist, wodurch der Bedarf an langwierigen komplexen Schritten bei der Verwendung von frischem gefrorenem Gewebe reduziert wird. Die Methode wird anhand der Identifizierung des Serotonin-5-HT2A-Rezeptor-Gens htr2a bei Ratten validiert.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine schnelle in-situ-Hybridisierung an mit Paraformaldehyd fixiertem Hirngewebe durchzuführen. Dies wird erreicht, indem Gewebeschnitte des Gehirns zuerst dehydriert und anschließend mit den Reagenzien der Vorbehandlung eins, zwei und drei behandelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Schnitte mit primären Oligonukleotidsonden sowie der zweiten, dritten und vierten Sonde zu hybridisieren.Fügen Sie anschließend das Fast-Red-Substrat hinzu, um die Ziel-RNA nachzuweisen. Im letzten Schritt wird die Stärke der mRNA-Signale mit der Image-J-Software quantifiziert. Letztendlich können Änderungen in der RNA-Genexpression durch den Vergleich der experimentellen und der Kontrollgruppen ermittelt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie relativ einfach, kostengünstig, reproduzierbar ist und weniger als zwei Tage zur Durchführung benötigt. Diese Arbeit wurde von mir selbst und John Jay Lenan von der Ross University School of Veterinary Medicine sowie von Jean Soza und RU Tao vom College of Medicine der Florida Atlantic University entwickelt. Bei diesem Verfahren entnehmen Sie vier Objektträger aus Objektträgerkästen, die im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Weisen Sie die Schnitte den Tests von P-P-I-B-D-A-P-B und HT zwei A-Genen zu, markieren und beschriften Sie sie mit einem Kugelschreiber. Tauchen Sie danach die Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 100 % Alkohol ein. Anschließend trocknen Sie die Objektträger fünf Minuten im Abzug. Geben Sie für die Vorbehandlung 20 Mikroliter des Vorbehandlungsreagenz 1 auf jeden Schnitt, und platzieren Sie die Objektträger auf einem Gestell in einer Feuchtewanne.Vorsichtig die Feuchtigkeitswanne 10 Minuten lang auf einem horizontalen Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit schütteln. Anschließend die Objektträger zweimal zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Die Objektträger in einen 1000-Milliliter-Becher mit 450 Millilitern des Reagenz „Pretreatment zwei“ eintauchen.Anschließend die Objektträger insgesamt fünf Minuten bei 100 Grad Celsius zum Kochen bringen, um die RNA-Struktur wiederherzustellen. Danach die Objektträger zweimal mit doppelt destilliertem Wasser je zwei Minuten lang waschen. Die Objektträger für fünf Minuten in 100 % Alkohol geben.Trocknen Sie die Objektträger anschließend fünf Minuten lang. Verwenden Sie im Abzug einen hydrophoben Stift, um einen Kreis um den ausgewählten Bereich im Gewebeschnitt zu zeichnen. Pipettieren Sie danach 10 Mikroliter des Vorbehandlungsreagenz drei auf jeden ausgewählten Bereich, um die Sondenpenetration zu erhöhen, und decken Sie die Feuchtigkeitswanne mit einem Deckel ab.Als Nächstes stellen Sie das Tablett in den Hybridisierofen, der mit einem horizontalen Schüttler ausgestattet ist. Stellen Sie die Ofentemperatur auf 40 Grad Celsius ein und schütteln Sie das Tablett vorsichtig für 30 Minuten. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal mit doppelt destilliertem Wasser, jeweils zwei Minuten lang. In diesem Schritt pipettieren Sie 10 µL der P-P-I-B-D-A-P-B- oder HTR zwei A-Sonde auf die ausgewählten Bereiche.Dann bedecken Sie die Feuchtigkeitswanne mit einem Deckel, um die Verdunstung des Reagenz zu verhindern. Schwenken Sie die Objektträger vorsichtig auf dem horizontalen Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit, während sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius im Ofen inkubiert werden. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal mit Waschpuffer, jeweils zwei Minuten lang, und pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikations-Reagenz 1 auf jeden ausgewählten Bereich.Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger bei 40 Grad Celsius für 30 Minuten. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal mit Waschpuffer, jeweils zwei Minuten lang. Geben Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenz zwei auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger bei 40 Grad Celsius für 15 Minuten.Anschließend die Objektträger zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten lang waschen. Jedes Mal 10 Mikroliter des Verstärkungsreagenz 3 auf jeden ausgewählten Bereich pipettieren. Die Objektträger schütteln und 30 Minuten bei 40 Grad Celsius inkubieren.Anschließend die Objektträger zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten waschen. 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenz vier auf jeden ausgewählten Bereich pipettieren. Die Objektträger schütteln und 15 Minuten bei 40 Grad Celsius inkubieren.Anschließend die Objektträger zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten waschen. 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenz 5 auf jeden ausgewählten Bereich pipettieren. Die Objektträger schütteln und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Anschließend die Objektträger zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten waschen. 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenz sechs auf jeden ausgewählten Bereich pipettieren. Die Objektträger schütteln und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Anschließend die Objektträger erneut zweimal mit Waschpuffer je zwei Minuten lang waschen. Nun 10 Mikroliter der roten Reagenz auf jeden ausgewählten Bereich pipettieren, die Objektträger in die feuchte Kammer auf den horizontalen Schüttler bei Raumtemperatur geben und 10 Minuten lang vorsichtig mit niedriger Geschwindigkeit schütteln. Danach die Objektträger zweimal mit zweifach destilliertem Wasser je 10 Minuten lang waschen.Trocknen Sie die Objektträger jedes Mal 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius im Ofen. Danach legen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in Xylol im Abzug. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter xylolbasiertes Eindeckmedium auf jeden ausgewählten Bereich und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.In diesem Schritt ziehen Sie die Bilddatei per Drag & Drop in das Hauptbild-J-Fenster. Gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Bild. Wählen Sie anschließend Typ aus dem Dropdown-Menü und dann Acht Bit.Als Nächstes wählen Sie „Anpassen“ und dann „Schwellenwert“, um das Dialogfeld zu öffnen. Passen Sie den Wert des unteren Balkens im Dialogfeld so an, dass der unerwünschte Hintergrund entfernt wird. Gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie „Analysieren“ und dann „Teilchen analysieren“, um ein zweites Dialogfeld zu öffnen.Stellen Sie die Partikelgröße auf 10 ein. Wählen Sie anschließend „Umrisse anzeigen“ und „Ergebnisse anzeigen“ sowie „Kästchen zusammenfassen“. Klicken Sie abschließend auf „OK“, um die Partikeldaten in den Dialogfeldern anzuzeigen.Tragen Sie die Daten für die Tabellenkalkulation in das Excel-Arbeitsblatt ein und bilden Sie den Durchschnitt der Partikelanzahl in der Salin-Gruppe als Basislinie. Berechnen Sie anschließend den prozentualen Wert jedes Abschnitts und erstellen Sie entsprechend ein Diagramm. Hier sind die lichtmikroskopischen Aufnahmen der Hybridisierungssignale, die durch rote Punkte gekennzeichnet sind.Die Gewebe wurden bei stark sedierten Ratten, die zuvor mit Kochsalzlösung und MDMA behandelt worden waren, mit Paraformaldehyd vorgefixiert. Die verwendeten Oligonukleotid-Sonden sind D-A-P-B-P-P-I-B und HT zwei A. Diese Abbildung zeigt die Wirkung auf die hypothalamische HT-zwei-A-Genexpression bei Ratten, die zuvor mit MDMA behandelt wurden; dabei wurde eine 20 %ige Reduktion der HT-zwei-A-Expression beobachtet. Diese Technik erleichtert es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, die Genexpression von Boten-RNA mittels In-situ-Hybridisierung an paraformaldehyd-vorgefixiertem Hirngewebe zu messen.

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Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Dieses Video zeigt den Nachweis der Serotoninrezeptor-RNA-Synthese mit Hilfe von Oligonukleotidsonden in Rattenhirngewebe, das vom Serotonin-Syndrom betroffen ist. Das Protokoll umfasst eine Gewebevorbehandlung, Sondenhybridisierung und enzymatische Detektion, um die RNA-Expression von Serotoninrezeptoren unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und zu quantifizieren.

In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden zur Untersuchung der RNA-Expression in Hirnschnitten von Ratten

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016). Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind,...

 Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Wir haben die repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) auf die einseitige Hemisphäre des Rattengehirns angewendet, indem wir eine 25-mm-Spirale 8 1 cm lateral zum Scheitel auf der biaurikulären Linie platziert und die Spule um 45° gewinkelt haben. Für rTMS wurde für mehr als 20 min eine hauseigene Wasserkühlung eingesetzt.

Repetitive transkranielle Magnetstimulation auf die Einseitige Hemisphäre von Rattenhirn

Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

DetectSyn ist ein unvoreingenommener, schneller fluoreszierender Assay, der Veränderungen der relativen Synapsenzahl (prä- und postsynaptisches Engagement) über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg misst. Diese Technik verwendet eine Proximity-Ligationstechnik, die sowohl in kultivierten Neuronen als auch in festem Gewebe eingesetzt werden kann.

DetectSyn: Eine schnelle, unvoreingenommene fluoreszierende Methode zur Erkennung von Änderungen der Synapsendichte

Wir haben einen Duplex-in-situ-Hybridisierungsassay zur Kartierung der Insulinrezeptor-Isoformen IR-A und IR-B im murinen Plexus choroideus etabliert und damit die Einschränkungen traditioneller Methoden überwunden. Dieser hochauflösende Ansatz enthüllt die isoformspezifische Expression und bietet neue Einblicke in die Insulinsignalisierung im Gehirn und potenzielle isoform-gezielte Therapien für neurologische Erkrankungen.

Präzise Visualisierung der Insulinrezeptoren A und B im Gehirn von Mäusen mit einem RNA In Situ Hybridisierungsassay

Lernen Sie eine schnelle In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden für Rattenhirngewebe. Diese Methode reduziert Verarbeitungszeit und ermöglicht zuverlässige mRNA-Quantifizierung mit ImageJ.

Schnelle In-situ- Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom (Video) | JoVE Journal

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