Name: Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca 2+ Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Lernen Sie die duale optische Kartierung von Membranpotential und Calcium im sarkoplasmatischen Retikulum im isolierten Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung kardialer Dynamiken.

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Diese Arbeit wurde teilweise von den US National Institutes of Health (R01 HL 111600) und der American Heart Association (12SDG9010015) unterstützt.

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Animal Care und Verwenden Committee der University of California, Davis zugelassen und auf den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health veröffentlicht geklebt. 1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie zwei konzentriert (25x) Aktien von modifizierten Tyrode-Lösung im Voraus und bei 4 ° C: (1) Auf I (in mM: NaCl 3205, CaCl 2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl 2 26.25) und (2) Stock II (in mM: NaHCO 3 500). <ol><li> Frisch herzustellen 2 l Tyrode-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1.05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 und Glucose 11,1 durch Kombination von 1840 ml entionisiertem (DI) Wasser, 80 ml Lizenz I, 80 ml Lizenz II und 4 g Glucose. Nicht direkt Mischung Stock I und Vektor II; hinzufügenm bis 1.840 ml DI, um die Ausfällung zu vermeiden. </li></ol></li><li> Bereiten Stammlösung der Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin bei 10 mg / ml in wasserfreien Di-Dimethylsulfoxid (DMSO) im Voraus und lagern Sie die Stammlösung bei 4 ° C. </li><li> Stammlösungen von fluoreszierenden Farbstoffen: (1) spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 (1 mg / ml in DMSO) und (2) von geringer Affinität Calciumindikator Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Mit den Vorbereitungen sofort zur Zersetzung mit anschließendem Verlust von Ladekapazität zu vermeiden. </li><li> Prime das Rezirkulieren Langendorff-Perfusionssystem mit oxygeniertem (95% O 2, 5% CO 2) Tyrodelösung. Einstellen der Strömung von O 2 / CO 2, um den pH-Wert der Tyrodelösung bei 7,4 ± 0,05 zu halten. Verwenden Sie eine in-line Nylon gewebt Nettofilter (Porengröße: 11 &amp; mgr; m), um kontinuierlich filtern das Perfusat. <ol><li> Prime das Perfusionssystem bei RT, wie nachfolgende loading Fluo-5N Uhr bei RT durchgeführt. Für Fluo-5N AM Beladung mit einem kleinen Kreislaufvolumen Perfusat (~ 150 ml). Nach der Farbstoffbeladung, verwenden Sie ein größeres Volumen an Perfusat (1 - 2 L, siehe Abbildung 1C). </li></ol></li><li> Schalten Sie Datenerfassungssystem und die Vorbereitungen für die kontinuierliche Überwachung von EKG und Perfusionsdruck. Bereiten Druck-Überwachungssystem: Verbinden Sie einen Druckwandler, um die Perfusion Linie und der Perfusionsdruck mit einem Transbridge Verstärker zu überwachen. Können die Grundlinien Perfusionsdruck auf 0 mmHg, wenn das Herz nicht in das Perfusionssystem angebracht ist. </li><li> Richten Sie die optische Abbildungskameras, um räumliche Ausrichtung zwischen dem V m und SR Ca 2+ Signale zu gewährleisten. <ol><li> Zunächst konzentrieren sich die Kameras, indem Sie ein Lineal oder ein Objekt mit Text in die Perfusion Gericht. Drehen Sie die Mapping-Kameras in eine Live View-Modus, und stellen Sie den Fokus, bis der Text ist scharf und klar. Erwerben Sie einen einzelnen Frame Bild von jeder Kamera. </li><li> OverlayDiese Bilder und die Transparenz anzupassen des oberen Bildes, so dass die beiden Bilder sichtbar sind. Der Text in den Bildern sollte genau überlappen. Wenn nicht perfekt ausgerichtet sind, kann der Winkel des dichroitischen Spiegels oder der Position jeder Kamera einzustellen, bis die beiden Bilder ausgerichtet sind. </li></ol></li></ol> 2. Ernten, Perfusion und Farbstoffbeladung von Kaninchen-Herz <ol><li> Sichern Sie das Kaninchen in einem zugelassenen Rückhalte Kaninchen. Tief anästhesiert über eine intravenöse Injektion (marginale Ohrvene) von Natriumpentobarbital (50 mg / kg) und Heparin (1000 IU). <ol><li> Als die Kaninchen Displays fehlt der nozizeptiven Reflexen, stellen Sie eine Mittellinie Hautschnitt, um den Brustbein und Rippen freizulegen. Schnitt durch das Brustbein mit stumpfen Spitze chirurgische Scheren aus dem Schwertfortsatz, um den Hammergriff. Achten Sie darauf, das Herz schädigen beim Öffnen des Brustbeins. Verbreiten Sie die Rippen, um das Herz freizulegen. </li><li> Schnell auszuschneiden das gesamte Herz-Lungen-Block durch schnelles Schneiden aller Gefäße und Bindegewebe. Immediadig legen Sie die Herz-Lungen-Block in Lösung eiskalten Tyrodes. </li></ol></li><li> Suchen Sie die Aorta für die retrograde Perfusion. Schneiden Sie den aufsteigenden Aorta proximal der drei Zweige des Aortenbogens. Kanülieren die Aorta in eine 8 G Kanüle in das Perfusionssystem verbunden. Verwenden Sie ein Stück USP 0 Seidenfaden, um die Aorta auf die Kanüle zu sichern. </li><li> Sorgfältig sezieren die Luftröhre, Lunge und epikardialen Fett aus dem Herzen. Mit einem scharfen Pinzette und Schere Dissektion, suchen Sie die Mitralklappe und sorgfältig beschädigen oder entfernen Sie eine Broschüre zur Lösung Staus in der linken Herzkammer zu verhindern. </li><li> Tauchen Sie die Herzen in der Glasmantel Perfusionskammer horizontal mit der anterioren Oberfläche des Herzens nach oben für die Bildgebung. Sichern die Kanüle in einem Stück Sylgard mit U-förmigen Stifte auf dem Silizium Boden der Schale, um die Bewegung des Herzens während der Zuordnung (Figur 1D) zu verhindern. Falls gewünscht, legen Sie ein kleines Insekt Stift an der Spitze des Herzens für stasierung. </li><li> Position Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden, die in dem Bad an der rechten und linken Seite des Herzens. Vollständig versenken die Elektroden im Bad und sicherzustellen, dass sie nicht in Kontakt mit der Herzoberfläche, um ein Volumen-EKG durchgeführt analog zu einem Lead I Konfiguration bereitzustellen. Stellen Sie sicher, eine normale Ableitung I EKG-Morphologie. Einstellen der Strömung (25 - 35 ml / min), um sicherzustellen, dass der Aortendruck wird bei 60 gehalten - 70 mmHg. </li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung und fügen Sie 0,3 bis 0,6 ml blebbistatin Stammlösung (Schritt 1.2) zum Perfusat (Endkonzentration 10 - 20 &amp; mgr; M). <ol><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung zu Photoinaktivierung blebbistatin vermeiden. Falls erforderlich, kann ein kleines Spotlight oder Stirnlampe verwendet werden, um Arbeitsplatzbeleuchtung bereitzustellen. Hinweis: blebbistatin ist ein Myosin-ATPase-Inhibitor und eine Erregung und Kontraktion Entkoppler. Weil Fluo-5N Lade erweiterten (60 min) RT (Hypothermie) Bedingungen erfordert (siehe Schritte 2,8-2,10), Herz-Energieproduktion beeinträchtigt sein kann. Therefore, Zugabe von blebbistatin in das Perfusat vor dem Laden Farbstoff kann den Energiebedarf 16 Verringerung und Beseitigung von Bewegungsartefakten bei der nachfolgenden optischen Aufnahmen 17. </li></ol></li><li> Bei Kontraktion des Herzens aufgehört hat (10 bis 15 min, auf der Aortendruck Aufzeichnung überprüft), um kleinvolumigen rezirkulierenden Perfusion (siehe Schritt 1.4.1) wechseln. </li><li> Bereiten Sie und laden Fluo-5N AM Beladungslösung: In 0,25 ml Fluo-5N AM-Stammlösung (Schritt 1.3) zu 0,25 ml warmem 20% Pluronic F127. 0,5 ml warmem Tyrodelösung zu der Mischung, gut mischen, und fügen Sie der kleinvolumigen Umlauf Perfusionssystem. </li><li> Kontinuierlich Perfusionsdruck und EKG-Überwachung und den Fluss ggf. einstellen. Farbstoffbeladung dauert ca. 1 h bei RT. 45 Minuten nach dem Laden begonnen hat, schalten Sie den zirkulierenden Wasserbad Erwärmung der Perfusionssystem und Perfusat auf 37 ° C zu beginnen. </li><li> Nach 60 min Fluo-5N AM Laden, switch die Perfusion des größeren Volumens Umlauf Perfusionssystem (siehe Schritt 1.4). </li><li> Verdünnte 50 ul spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 Stammlösung (Stufe 1.3) in 1 ml warmem Tyrodelösung und langsam (über ~ 5 min) in eine Injektionsöffnung proximal der Kanüle. </li></ol> 3. Optische Mapping <ol><li> Während der letzten Momente der Farbstoffbeladung, positionieren Sie den Herzen und konzentrieren sich die optischen Abbildungskameras, um die entsprechende Sichtfeld für das Experiment zu gewährleisten. </li><li> Falls gewünscht, eine bipolare Schrittmacherelektrode an der epikardialen Oberfläche des Herzens zur Stimulierung. </li><li> Legen Sie eine Kunststoff- oder Glasdeckglas auf der Oberfläche der Perfusionskammer, um Bewegungsartefakte auf der Flüssigkeitsoberfläche, die vorhanden sein können, aufgrund von Rückführung des Perfusat zu reduzieren. Hinweis: Als Alternative zu einem Deckglas mit einem sauberen Plastik 50 mm Petrischale Cover. </li><li> Fokus der Lichtleiter gleichmäßig die Oberfläche des Herzens mit e beleuchtenxcitation Licht. Verwenden blauen Leuchtdiode (LED) Lichtquellen und das Licht weiter zu filtern mit einem 475-495 nm Bandpassfilter (Abbildung 1A). </li><li> Sammeln emittiert Fluoreszenz mit einer Makroskops und zwei komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) optische Abbildungskameras. Teilen Sie das emittierte Licht mit einer dichroitischen Spiegel bei 545 nm. <ol><li> Langpaßfilter langwelligeren Gruppierung, enthaltend die V m Signal bei 700 nm. Bandpassfilter die kürzeren Wellenlängen-Einheit, mit dem SR Ca 2+ Signal, 502 bis 534 nm (Abbildung 1A). Stellen Sie die Frequenz des optischen Datenerfassung, um 0,5 bis 1 kHz. </li></ol></li><li> Für jeden optischen Aufzeichnungs zunächst initiieren die gewünschte Stimulationsprotokoll, schalten Sie das Anregungslicht, und sammeln 1-4 sec von Daten. Falls gewünscht, synchronisieren die Stimulationsprotokolle und Datenerfassung. Anmerkung: Es ist nicht möglich, wieder laden, Fluo-5N AM, also das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wird decrease während des Versuchs infolge einer Leckage aus dem SR färben. Begrenzen experimentelle Protokoll auf 1 - 2 h, hohe SNR-Werte zu gewährleisten. </li><li> Nach dem Versuch, wäscht den Perfusionssystem in der Sequenz von DI-Wasser, 70% Reagensalkohol und nochmals mit DI-Wasser. </li><li> Filtern jedes Datensatzes mit einer Orts Gaußfilter (Radius 3 Pixel) unter Verwendung von im Handel erhältlichen Software-Paketen gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Falls erforderlich, räumlich ausrichten V m und SR Ca 2+ Datensätze. Wie in Schritt 1.6, Overlay-Bilder von jeder Kamera, und überprüfen Sie, dass die anatomischen Strukturen des Herzens (dh., Koronargefäße, Kanten der Atrien oder Ventrikel) oder andere Gegenstände in das Blickfeld (dh Kanüle, Schrittmacherelektrode) genau, überlappen. Falls nicht, wird räumliche Ausrichtung der Datensätze notwendig. </li><li> Schieben Sie die Top-transparentes Bild in der x- und y-Richtung, bis genaue Überdeckung erreicht wird, unter Nennung der Anzahl der Pixelmuss das Bild in jeder Richtung verschoben werden. Die gesamte Datenmenge entsprechend dem oberen Bild (entweder m oder V SR Ca 2+) ist dann bestimmt durch die Anzahl von Pixeln in jeder Richtung verschoben werden, um eine genaue Ausrichtung zwischen dem V m und SR Ca 2+ Datensätze zu gewährleisten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Schlüssel zur erfolgreichen Fluo-5N Farbstoffbeladung sind der kleinvolumige rezirkulierenden Perfusion Einrichtung, die für eine hohe Fluo-5N-Konzentration ermöglicht, ohne die Notwendigkeit für große Mengen an Farbstoff, der Länge der Ladezeit (1 h) und Ausführen des Lade bei RT. Wenn das Laden bei physiologischen Temperaturen, zellulären Enzymaktivität schnell spaltet die -AM-Tag, wenn der Farbstoff kreuzt die Zellmembran, Einfangen der Farbstoffmoleküle in das Cytosol und nicht so dass sie die Membran zu durchqu...

Duale optische Kartierung des intrazellulären Ca2+- und Transmembranpotentials (Vm) im intakten Langendorff-perfundierten Herzen ist zu einer Hauptstütze der Untersuchungen in der kardialen Elektrophysiologie geworden, einschließlich der Mechanismen der Arrhythmie und der Erregungs-Kontraktions-Kopplung1-4. Dieser Ansatz hat beispiellose Erkenntnisse über die normale und abnormale Elektrophysiologie und, was wichtig ist, über die bidirektionale Beziehung zwischen Vm und intrazellulärem Ca2+ geliefert. Die optische Kartierung von intrazellulärem Ca2+ mit hochaffinen Fluoreszenzindikatoren (wie Rhod-2 und Fluo-4) berichtet jedoch nur über Massenänderungen in intrazellulärem Ca2+ und ist nicht in der Lage zu unterscheiden, ob diese Veränderungen auf den Transmembran-Ca2+-Fluss, die Freisetzung und die Wiederaufnahme in intrazelluläre Speicher oder in den meisten Fällen auf eine Kombination aus beidem zurückzuführen sind. Darüber hinaus weisen hochaffine Ca2+-Indikatoren eine langsame Ein-Aus-Kinetik auf und berichten möglicherweise nicht genau über schnelle Änderungen der Ca2+-Konzentration5.
Jedes Aktionspotential löst einen Anstieg des intrazellulären Ca2+ Transienten (CaT) aus, der als intrazelluläres Ca2+ Transient (CaT) bekannt ist. Im Säugetierherz sind etwa 70 – 90 % des gesamten CaT auf die Freisetzung von Ca2+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) über die Öffnung von Ryanodinrezeptoren (RyRs)6 zurückzuführen. Innerhalb des SR ist etwa die Hälfte des gesamten Ca2+-Gehalts an Calsequestrin (CSQ) und andere Intra-SR-Puffergebunden 7, die eine wichtige Rolle bei der SR-Ca2+-Homöostase spielen8,9. Die Menge an freiem SR Ca2+ bestimmt die treibende Kraft für die Freisetzung von SR Ca2+ sowie das Gating von RyR und hat daher einen signifikanten Einfluss auf das intrazelluläre CaT. Darüber hinaus können Veränderungen der SR Ca2+-Freisetzung oder -Wiederaufnahme wiederum über den elektrogenen Na+-Ca2+-AustauschVm beeinflussen, was arrhythmogene Folgen haben kann. Daher kann neben dem CaT auch das Monitoring des freien SR Ca2+ wichtige Erkenntnisse über kontraktile und elektrophysiologische Dysfunktionen liefern.
In den letzten Jahren haben Forscher signifikante Fortschritte bei der Überwachung von SR Ca2+ in isolierten Herzmyozyten und von einer einzigen Stelle am intakten Herzen gemacht. Eine solche Methode erfordert schnelle Koffeinimpulse, um RyRs zu öffnen, und der SR Ca2+-Gehalt wird dann aus dem unmittelbaren Anstieg des intrazellulären Ca2+10 abgeleitet oder berechnet. Ein weiterer faszinierender Ansatz verwendet Ca2+-Indikatoren mit geringer Affinität, wie z. B. Fluo-5N11 oder Mag-Fluo412, die an freies SR Ca2+ binden. Diese Indikatoren weisen Dissoziationskonstanten (Kd) im Bereich von 10 – 400 μM auf und weisen daher eine minimale Fluoreszenz im Zytosol auf, verglichen mit dem SR-Lumen, wo die Ca2+-Konzentration ([Ca2+]SR) im millimolaren Bereich liegt. Unter Verwendung von niedrig affinen Ca2+-Indikatoren wurden verschiedene Aspekte des SR Ca2+-Zyklus auf der Ebene der isolierten Myozyten untersucht, einschließlich der fraktionierten SRCa2+-Freisetzung und der Mechanismen von Ca2+-Alternans13,14. Um jedoch die heterogene Natur des SR Ca2+-Zyklus im intakten Herzen und die Rolle von SR Ca2+ bei räumlich unterschiedlichen arrhythmischen Phänomenen vollständig zu verstehen, sind Methoden zur Abbildung von SR Ca2+ über die Epikardoberfläche des intakten Herzens erforderlich15.
Dieser Artikel beschreibt die Methodik für die duale optische Kartierung von freiem SR Ca2+ und Vm im intakten Langendorff-perfundierten Kaninchenherz mit dem niedrigaffinen Ca2+-Indikator Fluo-5N. Neben der räumlichen Darstellung der SR Ca2+-Eigenschaften über die Epikardoberfläche des Herzens hat dieser Ansatz den Vorteil der gleichzeitigen Überwachung von Vm, was eine Untersuchung der bidirektionalen Beziehung zwischen Vm und SR Ca2+ ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific S217-500</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>Scientific S233-3</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Bestandteil der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>95 % O2 5 % CO2</td><td>AirGas</td><td>carbogen</td><td>Für die Sauerstoffversorgung und den pH-Wert der Tyrode-Lösung</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Anregungs-Kontraktions-Entkoppler</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Spannungsempfindlicher Farbstoff</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Ca2+-Indikator mit geringer Affinität; Alternativ: Invitrogen F-14204; Die Beladung muss bei Raumtemperatur durchgeführt werden</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>Für die Beladung des Ca2+ Indikators; Vor Gebrauch erwärmen, bis die Lösung klar ist</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Zum Auflösen von Blebbistatin und Farbstoffen</td></tr><tr><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &#956; m Inline-Filter</td></tr><tr><td>Druckmessumformer</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>Zur Messung des Perfusionsdrucks</td></tr><tr><td>Transbrückenmessumformer Verstärker</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Zur Übertragung/Verstärkung von Drucksignalen; PowerLab kann auch mit entsprechenden BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>verwendet werden Zur kontinuierlichen Aufzeichnung von Druck- und EKG-Signalen</td></tr><tr><td>THT Makroskop</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Makroskopischer optischer Aufbau. Details: 0,63X Objektiv (NA = 0,31), 2X Kondensationsobjektiv, resultierendes Sichtfeld = 3,1 cm x 3,1 cm, Tiefenschärfe = ~ 1,5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optische Mapping-Kameras</td></tr><tr><td>Präzisions-LED-Spotlicht</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED-Lichtquelle</td></tr></tbody></table>

optische kartierung der intra-retikulum ca<sup&gt; 2+</sup&gt; und transmembranpotential in der langendorff-perfundierten kaninchen herz

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarkoplasmatisches Retikulum (SR) Die Behandlung von Ca2+ spielt eine Schlüsselrolle bei der normalen Erregungs-Kontraktions-Kopplung und es ist bekannt, dass die aberrante SRCa2+-Handhabung eine bedeutende Rolle bei bestimmten Arten von Arrhythmien spielt. Da es sich bei Arrhythmien um räumlich unterschiedliche, emergente Phänomene handelt, müssen sie auf Gewebeebene untersucht werden. Die Methoden zur direkten Sondierung von SR Ca2+ im intakten Herzen sind jedoch nach wie vor begrenzt. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die duale optische Kartierung des Transmembranpotentials (Vm) und des freien intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) im Langendorff-perfundierten Kaninchenherz. Dieser Ansatz nutzt die Vorteile des niedrig affinen Ca2+-Indikators Fluo-5N, der im Zytosol eine minimale Fluoreszenz aufweist, während intrazelluläres [Ca2+] ([Ca2+]i) relativ niedrig ist, aber eine signifikante Fluoreszenz im SR-Lumen aufweist, wo [Ca2+]SR im millimolaren Bereich liegt. Neben der räumlichen Darstellung der SR Ca2+-Eigenschaften über die epikardiale Oberfläche des Herzens hat dieser Ansatz den entscheidenden Vorteil der gleichzeitigen Überwachung von Vm, was Untersuchungen der bidirektionalen Beziehung zwischen Vm und SR Ca2+ und der Rolle von SR Ca2+ bei arrhythmogenen Phänomenen ermöglicht.

1A zeigt eine schematische Darstellung der optischen Anordnung für Dual V m und SR Ca 2+ Kartierung. Mit diesem Setup, gibt es komplette spektrale Trennung der V m und SR Ca 2+ Signale (Abbildung 1B). Ein Diagramm des Dual-Schleifen Perfusionssystem für Fluo-5N Farbstoffbeladung verwendet wird, in Figur 1C veranschaulicht. Figur 1D zeigt die horizontale Ausrichtung des Herzens in das Perfusionssystem Schale. V...

Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, frei im sarkoplasmatischen Retikulum vorhandenes Calcium und das transmembrane Potential gleichzeitig optisch in einem intakten, isoliert lanor-perfunden Kaninchenherzen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Kaninchenherz entnommen und die Aorta für eine retrograde Lanor-Perfusion kaniüliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kontraktion durch Zugabe eines Erregungs-Kontraktions-Entkoppelungsmittels zur Perfusionslösung zu unterdrücken.Anschließend wird die Perfusion auf eine kleine Volumen-Umwälzschleife umgeschaltet und ein Calciumindikator mit geringer Affinität bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die letzten Schritte bestehen darin, das Herz mithilfe der großen Volumen-Perfusionsschleife auf 37 Grad Celsius zu erwärmen und den spannungsempfindlichen Farbstoff zuzugeben. Somit werden während des Experiments Änderungen in Calciumkonzentration und transmembranem Potential gemessen, indem das Herz mit blauem Licht angeregt und das emittierte Licht mit hochgeschwindigkeitsfähigen CMOS-Kameras erfasst wird.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie es den Untersuchenden er

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung der Methodik und Ergebnisse der gleichzeitigen endokardiale und epikardialen optische Abbildung der elektrischen Erregung in der intakten linken Vorhof eines Langendorff-perfundierten Schafe Herzen während stretch-induzierten Vorhofflimmern.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Untersuchung der Herzdynamik anhand eines translationalen Tiermodells zu etablieren. Der beschriebene experimentelle Ansatz beinhaltet eine duale Emissions-Optokardiographie in Verbindung mit einer elektrophysiologischen Studie zur Beurteilung der elektrischen Aktivität in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell.

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Dieses Protokoll präsentiert eine Sammlung von Sarkomer-, Kalzium- und makroskopischen geometrischen Daten aus einer aktiv kontrahierenden Herztrabekula ex vivo. Diese simultanen Messungen werden durch die Integration von drei Bildgebungsmodalitäten ermöglicht.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

Lernen Sie die duale optische Kartierung von Membranpotential und Calcium im sarkoplasmatischen Retikulum im isolierten Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Diese Methode ermöglicht die direkte Beobachtung kardialer Dynamiken.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca

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