Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca ²⁺ Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die gleichzeitige optische Kartierung des freien intrasarkoplasmatischen Retikulums, des Calciums und des Transmembranpotentials im intakten isolierten LOR-perfundierten Kaninchenherz. Dies wird erreicht, indem zuerst das Kaninchenherz herausgeschnitten und die Aorta für die retrograde Lanorperfusion kanüliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kontraktion zu eliminieren, indem dem Perfu-Acht eine Erregungskontraktionsentkopplung hinzugefügt wird.

Als nächstes wird die Perfusion auf eine Zirkulationsschleife mit kleinem Volumen umgeschaltet und ein Kalziumindikator mit niedriger Affinität bei Raumtemperatur zugegeben. Die letzten Schritte bestehen darin, das Herz mit der großvolumigen Profusionsschleife auf 37 Grad Celsius zu erwärmen und den spannungsempfindlichen Farbstoff hinzuzufügen. So werden während des Experiments Änderungen des Kalzium- und Transmembranpotentials gemessen, indem das Herz mit blauem Licht angeregt und das emittierte Licht mit Hochgeschwindigkeits-CM-OS-Kameras gemessen wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, das sarkoplasmatische Retikulum oder SR direkt auf kurze Kalziumdynamik zu untersuchen, ohne durch Transmembran-Kalziumsignale gestört zu werden. Diese Methode kann auch dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Rolle des SR-Kalzium-Umgangs bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen zu beantworten, da das Transmembranpotenzial gleichzeitig mit dem SR-Kalzium aufgezeichnet wird. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da optische SR-Kalziumsignale eine sehr geringe Amplitude haben. Daher ist die richtige Beladung des Calciumindikators unerlässlich Für dieses Protokoll ist es notwendig, frisch hergestellte Tyrolösung zur Hand zu haben.

Vier Liter reichen aus. Mischen Sie die konzentrierten Stammlösungen nicht ohne Verdünnung. Lassen Sie auch die anderen Lösungen im Voraus vorbereiten, wie im Textprotokoll angegeben, blasen Sie die Versorgung mit Tyros mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und stellen Sie den Gasfluss so ein, dass der pH-Wert der Lösung sehr nahe an 7,4 eingestellt wird.

Die Lösung sollte Raumtemperatur haben. Bereiten Sie das Zirkulationsperfusionssystem vor, indem Sie einen Inline-Nylonfilter mit 11 Mikron-Poren einsetzen, um das Perfusat zu filtern. Grundieren Sie nun das Hauptprofusionssystem mit etwa zwei Litern der sauerstoffhaltigen Tyros.

Das Gesamtvolumen von zwei Litern beinhaltet die Lösung im Behälter. Bereiten Sie als Nächstes eine kurze Profusionsleitung vor und bereiten Sie sie vor, die das Lösungsreservoir umgeht, um eine zirkulierende Profusionsschleife mit kleinem Volumen für Grippe oh five N am zu erstellen. Beim Herunterladen sollte das Gesamtvolumen in der kleineren Umlaufanlage etwa 150 Milliliter betragen.

Um das Drucküberwachungssystem vorzubereiten, schließen Sie einen Druckmessumformer an die Profusionsleitung an und verbinden Sie den Ausgang des Messumformers mit einem trans-Brückenverstärker. Schalten Sie nun das Datenerfassungssystem ein. Stellen Sie es so ein, dass das EKG und der Überflussdruck kontinuierlich überwacht werden.

Stellen Sie als Nächstes den Ausgangsperfusionsdruck auf null Millimeter Quecksilbersäule ein. Richten Sie abschließend die optische Mapping-Kamera aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Zu Beginn befestigen Sie das Kaninchen und betäuben es mit Pentobarbital, zusammen mit einem 1000-Einheiten-Bolus Heparin.

Bedecken Sie die Augen, um das Kaninchen zu beruhigen. Beginne mit einem Schnitt in der Mittellinie, um das Brustbein und die Rippen mit einer stumpfen Schere freizulegen. Schneide durch das Brustbein zwischen dem Xiphoid und dem Meibum.

Öffnen Sie anschließend vorsichtig das Brustbein, ohne das Herz zu beschädigen, und spreizen Sie die Rippen, um das Herz freizulegen. Entfernen Sie dann schnell den gesamten Herz-Lungen-Block, indem Sie alle umliegenden Gefäße und Gewebe wegschneiden. Übertragen Sie den Herz-Lungen-Block in etwa 100 Milliliter eiskalte Tyrolösung.

Lokalisieren Sie im exzidierten Gewebeblock die Aorta und schneiden Sie die aufsteigende Aorta direkt proximal zu den drei Ästen des Aortenbogens. Kanülieren Sie dann die Aorta mit der Acht-Gauge-Kanüle, die am Profusion-System befestigt ist. Befestigen Sie die Aorta mit einem Stück USP zero Seidennaht an der Kanüle.

Nachdem Sie die Kanüle befestigt haben, präparieren Sie vorsichtig die Luftröhre, die Lunge und das Epikardfett. Identifizieren Sie als Nächstes die Mitralklappe und verwenden Sie vorsichtig eine scharfe Pinzette und eine Schere, um ein Segel zu beschädigen oder zu entfernen. Daher kann es nicht zu einer Lösungsstauung im linken Ventrikel kommen.

Fahren Sie fort, indem Sie das Herz horizontal mit der vorderen Seite nach oben in die Perfusionskammer eintauchen. Legen Sie die Kanüle auf ein Stück Sarde. Befestigen Sie die Kanüle mit U-förmigen Stiften, die durch das Stück Sarde in den Silikonboden der Perfusionsschale eingeführt werden.

Dadurch wird verhindert, dass sich das Herz bewegt. Während der Bildgebung kann bei Bedarf ein kleiner Insektenstift verwendet werden, um die Spitze zu stabilisieren, die Menge der während der Kanülierung verwendeten Tyrolösung zu messen und sie durch frische Lösung zu ersetzen, um die gesamte zirkulierende Lösung bei zwei Litern zu halten. Tauchen Sie nun die EKG-Elektroden auf beiden Seiten des Herzens vollständig in das Bad ein, jedoch nicht in Kontakt mit dem Herzen.

Stellen Sie dann sicher, dass dies eine normale Ableitung zu einer EKG-Morphologie macht. Halten Sie in der Zwischenzeit den Aortendruck bei 60 bis 70 Millimeter Quecksilbersäule, indem Sie den Perfundfluss zwischen 25 und 35 Millilitern pro Minute einstellen. Schalten Sie nun das Raumlicht aus und fügen Sie 0,3 bis 0,6 Milliliter BLEs Statin-Stammlösung zum PERFU eight hinzu, um eine Endkonzentration von 10 bis 20 Mikromolar zu erreichen.

Nach 10 bis 15 Minuten sollten die Herzkontraktionen aufhören. Steigen Sie dann auf das Kleinvolumen-Profusionssystem um. Einer der Schlüssel zu einer erfolgreichen SR-Calcium-Bildgebung ist die richtige Beladung des Flow-Fünf-Nam-Farbstoffs.

Dies erfordert eine Perfusion mit kleinem Volumen, um eine hohe Farbstoffkonzentration und Raumtemperatur zu erreichen. Um eine D-Veresterung des D im Zytosol zu vermeiden, bereiten Sie nun 500 Mikroliter Flu O five N am Ladelösung vor und mischen Sie diese mit 500 Mikrolitern Straßenlösung. Dann füge es dem PERFU eight hinzu.

Lassen Sie den Download 45 Minuten lang laufen und schalten Sie dann das zirkulierende Wasserbad ein, um das System auf 37 Grad Celsius zu erwärmen. Wechseln Sie nach einer Stunde Download zurück zur größeren Lautstärke von Perfu eight. Mischen Sie anschließend 50 Mikroliter des spannungsempfindlichen Farbstoffs RH 2 37 in einen Milliliter warme Tyros.

Injizieren Sie dies langsam über etwa fünf Minuten in das System und fahren Sie mit der optischen Kartierung des Herzens fort. Fokussieren Sie zunächst die optischen Mapping-Kameras auf das entsprechende Feld, um die Bewegung auf der PERFU-Acht-Oberfläche zu reduzieren. Schwimmen Sie einen Deckslip auf die Lösung.

Stellen Sie nun den LED-Lichtstrahl so ein, dass das Herz gleichmäßig beleuchtet wird. Stellen Sie für jede optische Aufzeichnung das gewünschte Stimulationsprotokoll ein. Schalten Sie das Anregungslicht ein und sammeln Sie innerhalb von ein bis zwei Stunden Daten von ein bis vier Sekunden.

Der Lärm durch ausgetretenen Farbstoff wird dem Experiment ein Ende setzen. Waschen Sie das System anschließend mit entionisiertem Wasser aus. Dann 70% Ethanol und mit einer weiteren Spülung mit deionisiertem Wasser abschließen.

Mit Hilfe des beschriebenen Protokolls kann die spektrale Trennung des Transmembranpotentialsignals und des sarkoplasmatischen Retikulums bzw. SR-Calciumsignals getrennt werden. Auch optische Spuren während der kontinuierlichen Stimulation wurden aufgezeichnet. Aus den Daten wurden dann Aktivierungskarten erstellt, indem die Aktivierungszeit jedes Pixels dargestellt wurde.

In einem isochronen Diagramm gibt es eine typische Verzögerung von acht bis 10 Millisekunden zwischen den beiden Signalen. Es war möglich, die relative Veränderung der diastolischen SR zu quantifizieren. Die Kalziumbelastung und die systolische SR setzen Calciumamplituden in verschiedenen Stimulationszyklen frei. Eine pathologische SR-Calcium-Behandlung wurde nach der Applikation des beta-adrenergen Rezeptor-Agonisten Isoproterenol beobachtet.

Die roten Pfeile weisen auf ein deutliches Kalziumleck aus dem sr hin. Unter diesen Bedingungen kann es zu einer Calcium-vermittelten Auslösung von Aktionspotentialen kommen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine gleichzeitige optische Kartierung des Transmembranpotentials und der SR-Kalziumsignale im intakten perfundierten Kaninchenherz von Lang Endorf durchführen können.