Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, frei im sarkoplasmatischen Retikulum vorhandenes Calcium und das transmembrane Potential gleichzeitig optisch in einem intakten, isoliert lanor-perfunden Kaninchenherzen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Kaninchenherz entnommen und die Aorta für eine retrograde Lanor-Perfusion kaniüliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kontraktion durch Zugabe eines Erregungs-Kontraktions-Entkoppelungsmittels zur Perfusionslösung zu unterdrücken.

Anschließend wird die Perfusion auf eine kleine Volumen-Umwälzschleife umgeschaltet und ein Calciumindikator mit geringer Affinität bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die letzten Schritte bestehen darin, das Herz mithilfe der großen Volumen-Perfusionsschleife auf 37 Grad Celsius zu erwärmen und den spannungsempfindlichen Farbstoff zuzugeben. Somit werden während des Experiments Änderungen in Calciumkonzentration und transmembranem Potential gemessen, indem das Herz mit blauem Licht angeregt und das emittierte Licht mit hochgeschwindigkeitsfähigen CMOS-Kameras erfasst wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie es den Untersuchenden ermöglicht, das sarkoplasmatische Retikulum oder SR direkt auf kurze Kalziumdynamiken hin zu untersuchen, ohne Störungen durch transmembranöse Kalziumsignale. Diese Methode kann auch helfen, zentrale Fragen zur Rolle des Kalziumtransports im SR bei der Entstehung von Arrhythmien zu beantworten, da das transmembranöse Potential gleichzeitig mit dem SR-Kalzium erfasst wird. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die optischen SR-Kalziumsignale eine sehr geringe Amplitude aufweisen. Daher ist das korrekte Beladen mit dem Kalziumindikator entscheidend. Für dieses Protokoll ist es notwendig, frisch zubereitete Tyro-Lösung bereitzuhalten.

Vier Liter sind ausreichend. Mischen Sie die konzentrierten Stammlösungen nicht, ohne sie vorher zu verdünnen. Bereiten Sie auch die anderen Lösungen wie im Textprotokoll angegeben rechtzeitig vor, belüften Sie die Tyros-Lösung mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, und stellen Sie den Gasfluss so ein, dass der pH-Wert der Lösung nahezu bei 7,4 liegt.

Die Lösung sollte Raumtemperatur haben. Bereiten Sie das rezyklierende L-andorf-Perfusionssystem vor, indem Sie ein Inline-Nylonfilter mit 11-Mikrometer-Poren einsetzen, um das Perfusat zu filtern. Füllen Sie nun das Hauptperfusionssystem mit etwa zwei Litern des oxygenierten Tyros auf.

Das Gesamtvolumen von zwei Litern beinhaltet die Lösung im Reservoir. Bereiten Sie anschließend eine kurze Perfusionsleitung vor und spülen Sie diese, wobei das Lösungsreservoir umgangen wird, um einen geschlossenen, kleinen Perfusionskreislauf für Flu oh fünf N am zu schaffen. Das Gesamtvolumen im kleineren Rezirkulationssystem sollte etwa 150 Milliliter betragen.

Um das Drucküberwachungssystem vorzubereiten, verbinden Sie einen Drucksensor mit der Perfusionsleitung und schließen Sie den Ausgang des Sensors an einen Trans-Bridge-Verstärker an. Schalten Sie nun das Datenerfassungssystem ein und stellen Sie es darauf ein, kontinuierlich das EKG und den Perfusionsdruck zu überwachen.

Als Nächstes stellen Sie den basislinien Perfusionsdruck auf null Millimeter Quecksilber ein. Zuletzt richten Sie die optische Abbildungskamera gemäß der schriftlichen Anleitung aus. Beginnen Sie damit, das Kaninchen zu fixieren und es mit Pentobarbital sowie einer Bolusgabe von 1000 Einheiten Heparin zu anästhesieren.

Bedienen Sie die Augen, um das Kaninchen zu beruhigen. Beginnen Sie mit einem medianen Schnitt, um das Brustbein und die Rippen mit stumpfen Scheren zu freilegen. Durchtrennen Sie das Brustbein zwischen dem Xiphoid und dem Meibom.

Danach vorsichtig das Brustbein öffnen, ohne das Herz zu beschädigen, und die Rippen auseinanderziehen, um das Herz freizulegen. Anschließend schnell den gesamten Herz-Lungen-Block entfernen, indem alle umgebenden Gefäße und Gewebe abgeschnitten werden. Den Herz-Lungen-Block in etwa 100 Milliliter eiskalte Tyro-Lösung überführen.

Suchen Sie im exzidierten Gewebestück die Aorta und schneiden Sie die aufsteigende Aorta direkt proximal zu den drei Ästen des Aortenbogens durch. Danach wird die Aorta mit der an das Perfusionsystem angeschlossenen Kanüle der Größe acht kanüliert. Befestigen Sie die Aorta mit einem USP-Nahtfaden der Stärke null aus Seide an der Kanüle.

Nachdem die Kanüle befestigt wurde, disziere vorsichtig die Luftröhre, die Lungen und das epikardiale Fett. Identifiziere danach die Mitralklappe und beschädige oder entferne mit scharfer Pinzette und Schere vorsichtig eine Klappenblätter. Auf diese Weise kann keine Flüssigkeitsstauung im linken Ventrikel auftreten.

Fahren Sie fort, indem Sie das Herz horizontal mit der Vorderseite nach oben in die Perfusionskammer tauchen. Plazieren Sie die Kanüle auf einem Stück Sard. Sichern Sie die Kanüle mit U-förmigen Stiften, die durch das Stück Sard und in den Silikonboden der Perfusionschale gesteckt werden.

Dadurch wird verhindert, dass sich das Herz bewegt. Während der Bildaufnahme kann eine kleine Insektennadel verwendet werden, um die Herzspitze bei Bedarf zu stabilisieren, die Menge an Tyro-Lösung, die während der Kanülierung verwendet wird, messen und durch frische Lösung ersetzen, um die Gesamtmenge der zirkulierenden Lösung bei zwei Litern zu halten. Tauchen Sie nun die EKG-Elektroden vollständig in das Bad auf beiden Seiten des Herzens ein, jedoch ohne Kontakt zum Herzen.

Überprüfen Sie anschließend, ob sich eine normale Ableitung-Eins-EKG-Morphologie ergibt. Gleichzeitig halten Sie den aortalen Druck durch Einstellung des Perfusionsflusses zwischen 25 und 35 Milliliter pro Minute bei 60 bis 70 Millimeter Quecksilber. Schalten Sie nun das Raumlicht aus und geben Sie 0,3 bis 0,6 Milliliter der BLE-Statin-Standardlösung zum PERFU acht hinzu, um eine Endkonzentration von 10 bis 20 Mikromolar zu erreichen.

Nach 10 bis 15 Minuten sollten die Herzkontraktionen aufhören. Danach wechseln Sie zum System mit geringem Volumenstrom. Einer der Schlüssel für eine erfolgreiche SR-Calcium-Bildgebung ist das korrekte Beladen mit dem Fluss-fünf-N-Am-Farbstoff.

Dies erfordert eine Perfusionslösung in kleinem Volumen, um eine hohe Farbstoffkonzentration und Raumtemperaturbedingungen zu erreichen. Um die D-Esterifizierung des D im Cytosol zu vermeiden, bereiten Sie nun 500 Mikroliter Flu-O-fünf-N-am-Ladelösung vor und mischen sie mit 500 Mikrolitern Road-Lösung. Anschließend geben Sie die Mischung in die PERFU-acht.

Lassen Sie den Download 45 Minuten lang fortlaufen und schalten Sie dann das zirkulierende Wasserbad ein, um das System auf 37 Grad Celsius aufzuwärmen. Nach einer Stunde Download wechseln Sie zurück zum größeren Volumen von Perfu acht. Anschließend mischen Sie 50 Mikroliter des spannungsabhängigen Farbstoffs RH 2 37 in ein Milliliter warmes Tyros.

Injizieren Sie dies langsam über einen Zeitraum von etwa fünf Minuten in das System und führen Sie anschließend die optische Kartierung des Herzens durch. Beginnen Sie damit, die Kameras für die optische Kartierung auf das geeignete Sichtfeld zu fokussieren, um die Bewegung auf der PERFU-acht-Oberfläche zu verringern. Legen Sie einen Deckgläser auf die Lösung auf.

Passt nun den LED-Lichtstrahl so an, dass das Herz gleichmäßig beleuchtet wird. Legen Sie für jede optische Aufzeichnung das gewünschte Pacing-Protokoll fest. Schalten Sie das Anregungslicht ein und erfassen Sie ein bis vier Sekunden Daten innerhalb von ein bis zwei Stunden.

Läuft Farbstoff aus, beendet dies das Experiment. Danach spülen Sie das System mit entionisiertem Wasser aus. Anschließend mit 70 % Ethanol und zum Abschluss erneut mit entionisiertem Wasser spülen.

Mithilfe des beschriebenen Protokolls kann die spektrale Trennung des Signals des transmembranen Potentials und des Signals des sarkoplasmatischen Retikulums oder SR-Calciums vorgenommen werden. Optische Spuren während kontinuierlicher Stimulation wurden ebenfalls aufgezeichnet. Anschließend wurden Aktivierungskarten aus den Daten erstellt, indem die Aktivierungszeit jedes Pixels dargestellt wurde.

In einem isochronalen Graphen liegt eine typische Verzögerung von acht bis 10 Millisekunden zwischen den beiden Signalen vor. Es war möglich, die relative Änderung der diastolischen SR-Calcium-Ladung und der systolischen SR-Calcium-Freisetzungsamplituden bei verschiedenen Stimulationszyklen zu quantifizieren. Eine pathologische SR-Calcium-Handhabung wurde nach der Applikation des beta-adrenergen Rezeptoragonisten Isoproterenol beobachtet.

Die roten Pfeile zeigen einen deutlichen Kalziumaustritt aus dem SR. Unter diesen Bedingungen kann eine Kalzium-vermittelte Auslösung von Aktionspotentialen erfolgen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man eine simultane optische Abbildung des transmembranen Potentials und der SR-Kalziumsignale im intakten, langendorff-perfudierten Kaninchenherzen durchführt.