Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Tumorbiologie über die molekularen Mechanismen der Metastasierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Rekrutierung von Tumorzellen innerhalb eines entfernten Organs quantitiert werden kann. Beginnen Sie mit einem nicht-enzymatischen Zelldissoziationsreagenz, um fluoreszierendes Protein-exzierendes Lewis-Lungenkarzinom oder LLC- oder LLC-Zellen gemäß Standardprotokollen aus ihrem Kulturbehälter zu entfernen.

Übertragen Sie die resultierende Zelllösung vor der Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Konikonröhre, und Zentrifugen waschen Sie die Pellets zweimal in fünf Milliliter PBS pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche die Zellen durch ein 40-Mikrometer Porenzellsieb filtern und die Suspension auf ein mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Konzentration verdünnen. Dann laden Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 29-Spur-Nadel ausgestattet, und injizieren 100 Mikroliter Zellen in die Schwanzvene jeder acht bis zehn Wochen alten, C57-Black-6, männliche Maus.

Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt eine Schere, um die Haut von der ventralen Oberfläche jeder Maus zu entfernen, und schneiden Sie die Rippen und das Zwerchfell, um die Brusthöhle freizulegen. Verwenden Sie eine 25-Spur geflügelte Infusionsnadel und Schläuche, um 15 Milliliter PBS durch den rechten Ventrikel zu spülen und das Herz und den Thymus zu entfernen. Die Luftröhre mit Zangen greifen, hochziehen, das Bindegewebe um die Luftröhre sezieren, um die Lunge zu ernten.

Dann waschen Sie die Lunge in PBS, und lösen Sie einen Lappen für die Visualisierung der fluoreszierenden Zellen in situ unter einem Fluoreszenzmikroskop. Um das Lungengewebe zu verdauen, würfeln Sie zuerst den kaudalen Lappen mit einer Schere und legen Sie die Lungenstücke in eine 10-Milliliter-Spritze. Schließen Sie die Spritze mit dem Kolben, und aspirieren Sie fünf Milliliter Verdauungslösung in die Spritze, bewegen Sie den Kolben in und aus der Spritzenwelle, bis das Lungengewebe in der gesamten Lösung verbreitet wird.

Die Lungenschlämme in eine 50-Milliliter-Röhre geben und das Gewebe 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 150 U/min auf einem wechselseitigen Shaker verdauen. Am Ende der Inkubation das verbleibende Gewebe trituieren, bis die Lungenzellen vollständig dispergiert sind, und geben Sie das Rohr für weitere 30 Minuten an den Shaker zurück. Filtern Sie dann die Zellen durch ein 40-Mikrometer Porensieb und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Um die isolierten Lungenzellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, setzen Sie das Pellet in zwei Millilitern roter Blutzelllysepuffer für eine Minute bei Raumtemperatur wieder auf und sammeln sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann Zentrifugieren Sie das Pellet zwei Mal in fünf Milliliter frischen PBS mit 1%rinderserum albumin pro Wäsche ergänzt. Nach der zweiten Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter frischer PBS plus BSA wieder aufsetzen und die Zellen durch ein neues 40-Mikrometer Porensieb zur Quantifizierung der Tumorzellen durch Durchflusszytometrie filtern.

Die Lunge stellt zwei Stunden nach der Injektion viele GFP-LLC-Zellen dar, wobei die überwiegende Mehrheit der Zellen innerhalb von 24 Stunden aus der Lunge verschwindet. Beachten Sie, dass alle fluoreszierenden Flecken, die im roten Filter erkannt werden, von der Zellanzahl ausgeschlossen werden sollten. Um die Anzahl der GFP-LLC in der Lunge zu bestätigen, kann einer der Lappen für die zytometrische Analyse des Durchflusses verwendet werden, wie gezeigt.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass ein eingefrorener Abschnitt eine genauere Methode zur Beobachtung der genauen Position von Tumorzellen ist.