Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay
26. Februar 2019
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Tumorbiologie über die molekularen Mechanismen der Metastasierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Rekrutierung von Tumorzellen innerhalb eines entfernten Organs quantitiert werden kann. Beginnen Sie mit einem nicht-enzymatischen Zelldissoziationsreagenz, um fluoreszierendes Protein-exzierendes Lewis-Lungenkarzinom oder LLC- oder LLC-Zellen gemäß Standardprotokollen aus ihrem Kulturbehälter zu entfernen.
Übertragen Sie die resultierende Zelllösung vor der Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Konikonröhre, und Zentrifugen waschen Sie die Pellets zweimal in fünf Milliliter PBS pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche die Zellen durch ein 40-Mikrometer Porenzellsieb filtern und die Suspension auf ein mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Konzentration verdünnen. Dann laden Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 29-Spur-Nadel ausgestattet, und injizieren 100 Mikroliter Zellen in die Schwanzvene jeder acht bis zehn Wochen alten, C57-Black-6, männliche Maus.
Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt eine Schere, um die Haut von der ventralen Oberfläche jeder Maus zu entfernen, und schneiden Sie die Rippen und das Zwerchfell, um die Brusthöhle freizulegen. Verwenden Sie eine 25-Spur geflügelte Infusionsnadel und Schläuche, um 15 Milliliter PBS durch den rechten Ventrikel zu spülen und das Herz und den Thymus zu entfernen. Die Luftröhre mit Zangen greifen, hochziehen, das Bindegewebe um die Luftröhre sezieren, um die Lunge zu ernten.
Dann waschen Sie die Lunge in PBS, und lösen Sie einen Lappen für die Visualisierung der fluoreszierenden Zellen in situ unter einem Fluoreszenzmikroskop. Um das Lungengewebe zu verdauen, würfeln Sie zuerst den kaudalen Lappen mit einer Schere und legen Sie die Lungenstücke in eine 10-Milliliter-Spritze. Schließen Sie die Spritze mit dem Kolben, und aspirieren Sie fünf Milliliter Verdauungslösung in die Spritze, bewegen Sie den Kolben in und aus der Spritzenwelle, bis das Lungengewebe in der gesamten Lösung verbreitet wird.
Die Lungenschlämme in eine 50-Milliliter-Röhre geben und das Gewebe 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 150 U/min auf einem wechselseitigen Shaker verdauen. Am Ende der Inkubation das verbleibende Gewebe trituieren, bis die Lungenzellen vollständig dispergiert sind, und geben Sie das Rohr für weitere 30 Minuten an den Shaker zurück. Filtern Sie dann die Zellen durch ein 40-Mikrometer Porensieb und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Um die isolierten Lungenzellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, setzen Sie das Pellet in zwei Millilitern roter Blutzelllysepuffer für eine Minute bei Raumtemperatur wieder auf und sammeln sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann Zentrifugieren Sie das Pellet zwei Mal in fünf Milliliter frischen PBS mit 1%rinderserum albumin pro Wäsche ergänzt. Nach der zweiten Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter frischer PBS plus BSA wieder aufsetzen und die Zellen durch ein neues 40-Mikrometer Porensieb zur Quantifizierung der Tumorzellen durch Durchflusszytometrie filtern.
Die Lunge stellt zwei Stunden nach der Injektion viele GFP-LLC-Zellen dar, wobei die überwiegende Mehrheit der Zellen innerhalb von 24 Stunden aus der Lunge verschwindet. Beachten Sie, dass alle fluoreszierenden Flecken, die im roten Filter erkannt werden, von der Zellanzahl ausgeschlossen werden sollten. Um die Anzahl der GFP-LLC in der Lunge zu bestätigen, kann einer der Lappen für die zytometrische Analyse des Durchflusses verwendet werden, wie gezeigt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass ein eingefrorener Abschnitt eine genauere Methode zur Beobachtung der genauen Position von Tumorzellen ist.
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Übersicht
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Ansammlung von Tumorzellen in der Lunge in einem Tiermodell der Tumormetastasierung. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der Rekrutierung von Tumorzellen in einem entfernten Organ und liefert Einblicke in die molekularen Mechanismen der Metastasierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der Tumormetastasierung ist entscheidend für die Krebsforschung.
- Die Quantifizierung der Tumorzellansammlung kann wichtige biologische Erkenntnisse liefern.
- Die Verwendung von Tiermodellen ist bei der Untersuchung des Krebsfortschritts üblich.
- Fluoreszierende Proteine exprimierende Zellen erleichtern das Verfolgen und die Quantifizierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Quantifizierung der Ansammlung von Tumorzellen in der Lunge.
- Untersuchung der Rekrutierung von Tumorzellen in einem metastatischen Modell.
- Verbesserung des Verständnisses der molekularen Mechanismen, die der Metastasierung zugrunde liegen.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines nicht-enzymatischen Reagenz zur Zell-Dissociation.
- Zentrifugation und Waschen der Zellpellets in PBS.
- Filterung der Zellen durch einen Zellfilter mit 40-Mikrometer-Pore.
- Injektion der verdünnten Zellsuspension in die Schwanzvene von Mäusen.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine effektive Quantifizierung der Tumorzellakkumulation.
- Zeigte die Durchführbarkeit des Trackings von Tumorzellen in vivo auf.
- Lieferte Erkenntnisse über die Dynamik der Rekrutierung von Tumorzellen.
- Trug zum Verständnis metastatischer Prozesse bei.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Tumorbiologie.
- Sie verbessert die Fähigkeit, Metastasen in Tiermodellen zu erforschen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Technik aufbauen, um therapeutische Zielstrukturen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieser Test ermöglicht die quantitative Beurteilung der Rekrutierung von Tumorzellen in entfernte Organe und unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der entdeckung von Medikamenten, die auf Metastasen abzielen. Indem primäre Invasionsschritte des Tumors umgangen werden, konzentriert er sich auf stromale Wechselwirkungen und Extravasationsereignisse, die für die präklinische Zielvalidierung entscheidend sind. Die Methode liefert einen reproduzierbaren, skalierbaren Endpunkt zur Bewertung antimetastatischer Substanzen in vivo.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen über den Beitrag des Stroma zur Metastasierung in fernen Organen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Quantifizierung der Tumorzellansammlung in der Lunge nach Injektion.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten durch Messung der Wirkstoffeffekte auf die Dynamik der Tumorzellrekrutierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Ausgaben mittels Durchflusszytometrie für Substanz-Screening-Kampagnen.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet definierte Zellkonzentrationen und Injektionsvolumina, um eine konsistente Modellierung der Metastasierung sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit der Bearbeitung mehrerer Vertiefungen und der Analyse mit hohem Informationsgehalt zur Absicherung von Zielstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert Lungenmikrometastasen, um organspezifische Kolonisationsmechanismen zu untersuchen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung von antimetastatischen Wirkstoffen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der Reduktion der markierten Tumorzellanzahl.
Pipeline- und Workflow-Integration
Positionen innerhalb des Entdeckungsprozesses, von der Testung von Zielhypothesen bis zur Optimierung von Leitsubstanzen, die eine quantitative Bewertung von metastasemodulierenden Verbindungen ermöglichen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die mechanistische Untersuchung von Tumor-Stroma-Interaktionen in metastatischen Nischen.
- Screening: Liefert fluoreszenzbasierte quantitative Messwerte zur Bestätigung von Hits in Metastasen-Assays.
- Analytik: Erzeugt zählbare Tumorzell-Daten mittels Durchflusszytometrie für Dosis-Wirkungs-Analysen und statistische Auswertungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt Biomarker-Strategien durch die Verfolgung der In-vivo-Verbreitung markierter Zellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für metastasenmechanistische Studien über Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei Metastasierungswegen durch quantifizierbare, organspezifische Rekrutierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Tumorzellapplikation und Gewebeaufbereitung für reproduzierbare, interlaboratorische Vergleiche.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühe Absicherung von metastasenzielgerichteten Therapeutika ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf präklinischen Daten zur Metastasensuppression.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der murinen Schwanzveneninjektion und in Gewebedissoziationstechniken.
- Abhängig von Durchflusszytometrie-Geräten und Fluoreszenz-Kompensationskontrollen.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Zellpräparation über verschiedene Forschungsteams hinweg voraus.
- Erfordert die Optimierung der Zelldosis, um störende Signale durch übermäßige Anreicherung in der Lunge zu vermeiden.
- Auf die Quantifizierung der Lungenanreicherung beschränkt; erfasst weder die Invasion des Primärtumors noch ein späteres metastatisches Wachstum.
