Name: Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung von Haarstamm-Keratinozyten zu integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels episomaler Vektoren. Diese Methode ermöglicht die sichere Generierung von hiPSCs für regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung.

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Die Autoren danken Harene Ranjithakumaran und Stacey Jackson für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), der University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) und des Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) unterstützt; Zukunftsstipendium des Australian Research Council (A. Pébay, FT140100047), Stipendium der Cranbourne Foundation (R.C.B. Wong); interne Finanzierung durch die National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) und Unterstützung der operativen Infrastruktur durch die Regierung von Victoria.

Die Sammlung der menschlichen Haarprobe von Personen erfordert ethische Genehmigung durch die menschliche Forschung Ethik-Kommission in den Gasteinrichtungen und sollten in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt werden. 1. Isolierung von Keratinozyten aus Zupfinstrumente Haar <ol><li> Tau-extrazellulären Matrix (ECM) Lösung (dh Matrigel) auf Eis O / N. </li><li> Verwendung vorgekühlte Pipettenspitzen, fügen Sie 200 ul ECM-Lösung zu 12 ml gekühltes DMEM / F12-Medium. Coat eine 12-Well-Platte mit 1 ml verdünnter ECM-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die beschichtete Platte O / N bei 37 ° C. Waschen Sie die beschichtete Platte mit vorgewärmten DMEM / F12-Medium vor der Verwendung. </li><li> Sammeln primären menschlichen Haares von der individuellen Kopf, indem die Finger in der Nähe der Wurzel des Haares und Zupfen Sie die Haare in eine schnelle und gleichmäßige Bewegung. Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass jeder gesammelten Haaren enthält eine intakte Haarfollikel und bestimmen die Wachstumsphase der Haare unDer einem Binokular (Abbildung 1). <ol><li> Sammeln 5-10 Anagenhaare von jedem einzelnen auf Keratinozyten zu extrahieren. Verfahren gezupften Haare so schnell wie möglich zu einer erfolgreichen Ableitung Keratinozyten sicherzustellen. ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt die Morphologie der Haare in unterschiedlichen Phasen des Wachstumszyklus. Anagenhaare ist in der Wachstumsphase mit einer sichtbaren äußeren Epithelschicht die Länge der Haare, da die ORS bekannten Umgebung. Auf der anderen Seite, Telogen Haar stellt Haare in der Ruhephase und muss nicht eine sichtbare ORS, aber hat eine klare Kugel von Zellen für den Wurzel des Haares, als Telogen Ausbuchtung bekannt. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Haarprobe in eine Petrischale, die 10 ml mit Antibiotika Mix für 5 min bei RT waschen. </li><li> Verwendung sterilisiert Schere und Pinzette, schneiden Sie übermäßigen Haarwelle, so dass ein Haar-Fragment mit einer intakten Haarfollikel und um 0,5 bis 1 cm von Haarschaft. </li><li> Sorgfältig transfer 1 Haar-Fragment in jeder Vertiefung der ECM-beschichtete Platte mit einer Pinzette. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Pipette ca. 3 Tropfen Knockout Serum Replacement (KSR), Medium (~ 100 bis 200 &amp; mgr; l) zu den Haarproben. Hinweis: Halten Sie das Haar-Fragmente in engem Kontakt zur Plattenoberfläche, um für die Befestigung und die anschließende Keratinozyten Auswuchs zu ermöglichen. Hinzufügen von Seiten übermäßig in diesem Schritt kann bewirkt, dass die Haar-Fragmente zu schweben, und verringert die Chance einer erfolgreichen Haar Befestigung. </li><li> Die Haarproben in einer 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 inkubieren und lassen die Haarfollikel O befestigen / N. Am folgenden Tag, sanft weiteren hinzufügen 3 Tropfen KSR Medium (~ 100 bis 200 &amp; mgr; l), um die Haarproben feucht zu halten. </li><li> Beachten Sie die Haarproben täglich, um zu bestätigen, dass die Haarfollikel erfolgreich angeschlossen. Generell Befestigung der Haarfollikel ist offensichtlich innerhalb von 1-3 Tagen. Dicke Haare sind in der Regel leichter zu befestigen, verglichen mit feinen Haaren, wie feinen Haaren höher habenTendenz zu schweben, die die Befestigung behindern. <ol><li> Sobald das Haar haben auf die beschichtete Platte befestigt ist, fügen Sie 500 ul KSR Medium zum Brunnen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Hinzufügen des Mediums als Haarproben möglicherweise nicht fest angeschlossen haben. Von diesem Punkt zu ändern Medien alle 2 Tage. Hinweis: Keratinozyten Auswüchse sollten von der ORS Bereich der Haar-Fragment nach 3-7 Tagen (2A-B) zu sehen sein. Lassen Sie die Keratinozyten bis zu 14 Tage vor aufwachsen Passagieren der Zellen, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. Wartung und Passagieren von Keratinozyten <ol><li> Vorstrich eine 6-Well-Platte mit der Beschichtungsmatrix Kit. Fügen Sie 680 ul des Verdünnungsmedium aus dem Kit in jede Vertiefung, gefolgt von 6,8 &amp; mgr; l Beschichtungsmatrix-Lösung. Schütteln Sie die Platte um eine gleichmäßige Verteilung der Beschichtungsmatrix-Lösung auf der Platte sicherzustellen. </li><li> Lassen Sie den beschichtete Platte für 30 min bei RT inkubieren. Entfernendie Beschichtungsmatrix-Lösung vor dem Beschichten von Keratinozyten. </li><li> Dissoziieren Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 500 ul 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung des Trypsins mit 500 ul Medium, das Serum enthält (beispielsweise fötales Rinderserum (FBS) mittel) und Sammeln in ein steriles 15 ml Röhrchen. Entfernen Sie die Haare Fragment mit sterilisierten Pinzette. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der geernteten Zellen mit einem Hämozytometer. </li><li> Zentrifugieren der Zellen für 3 min bei 200 x g. Die Zellen mit PBS und wiederholen Zentrifugation waschen. Saugen Sie das PBS und Zellpellet in frischem Keratinozyten-Medium. </li><li> Platte um 4 x 10 4 Keratinozyten in ein Well ECM-beschichtete Platte in Gegenwart von Keratinozyten-Medium. Halten die Keratinozyten in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 (Abbildung 2C). Ändern Medien jeden Tag und Passage-Zellen, wenn die Kultur ist ~ 80% konfluent, which kann etwa 2-7 Tage dauern, je nach Durchgang Nummer und Proliferationsrate der Keratinozyten. Die abgeleiteten Keratinozyten sollte erweitert werden, um ausreichend gefroren Aktien unter Verwendung von Standard langsam Einfrieren Kryokonservierung Methoden 16 zu erzeugen. Anmerkung: Die hier beschriebenen Kulturbedingungen unterstützt die Ausdehnung des homogenen Population von Keratinozyten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie (Abbildung 2C). Gelegentlich können ein paar differenzierten Keratinozyten, mit großen und flachen Morphologie und haben replikative Potential verloren, in der Kultur zu beobachten. Charakterisierung von Keratinozyten durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen Cytokeratin 14 durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben 17. Gegründet Keratinozyten-Zelllinien sollte auch auf Mykoplasmen nach 1-3 Passagen mit kommerziell erhältlichen Kit getestet werden. </li></ol> 3. Erzeugung von hiPSCs von Keratinozyten Mit Episomale Vektoren <ol><li> Vorstrich eine 6-Well-Platte mit0,1% Gelatine (2 ml / Vertiefung). Gelatine mit Mantel für mindestens 20 min bei RT. </li><li> Umprogrammierung Experiment Verwendung Keratinozyten spätestens Gang 6 Dissociate Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 1 ml 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung von Trypsin mit 1 ml Medium, das Serum (zB FBS-Medium) und sammeln Sie in einem 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge Zellen für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellen in Keratinozyten-Medium. Platte 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 pro Vertiefung Keratinozyten in einer gelatinierten Platte O / N. </li><li> Am folgenden Tag (Tag 0), überprüfen Sie die Platte, um sicherzustellen, Zellen 50-60% konfluent. Hinweis: Wenn Keratinozyten weniger als ~ 50% konfluent sie nicht gut nach der Transfektion wachsen könnte. </li><li> Am Tag 0, führen Transfektion der episomalen Vektoren Neuprogrammierung auf die Keratinozyten mit einem Verhältnis von 8 &amp; mgr; Transfektionsreagenz bis 2 &amp; mgr; g Gesamt-Plasmid-DNA.<ol><li> Nehmen 0,5 ug für jeden der 4 Plasmide (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOCT3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) und in 100 &amp; mgr; l reduziert Serum-Medium (zB OPTI-MEM) verdünnt. Hinweis: Das Plasmid pCXLE-eGFP verwendet, um die Transfektionseffizienz in Keratinozyten zu überwachen und ist nicht für eine erfolgreiche Neuprogrammierung erforderlich. </li><li> Sie 8 ul Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA. Mischen Sie durch Schwenken des Rohres. Lassen Sie die DNA-Reaktionsmischung bei RT 15 min ungestört zu entspannen. </li><li> Ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium. </li><li> Fügen Sie vorsichtig die DNA-Reaktionsmischung zu Keratinozyten-Kultur und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 4 Stunden. Hinweis: Es wird nicht empfohlen, längeren Transfektion O / N in Keratinozyten durchzuführen, da sie geringe Überlebens nach der Transfektion aufweisen. </li><li> Nach 4 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium. </li></ol></li><li> Am Tag 1 (1 Tag nach der transfection), ändern Sie die Keratinozyten-Medium und prüfen Transfektionseffizienz durch Schätzung der Anteil der eGFP positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Typischerweise&gt; 60-70% Transfektionseffizienz für primären Keratinozyten unter Verwendung dieses Protokolls festgestellt. </li><li> Am Tag 2 wiederholen Transfektion, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Zwei aufeinanderfolgenden Transfektionen typischerweise erreichen würde&gt; 90% Transfektionseffizienz. Keratinocytenkultur Regel erreicht Mündung bis zum Ende der zweiten Transfektion. <ol><li> Bereiten Sie eine 10 cm Schüssel mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder für jede Neuprogrammierung Reaktion. Bereiten mitotisch inaktivierten MEF Feeder wie zuvor beschrieben 18. </li><li> Precoat-10-cm-Schale mit 5 ml 0,1% Gelatine für mindestens 20 min. Platte 4 x 10 6 mitotisch inaktivierten MEF pro 10 cm Schale in FBS-Medium. Lassen Sie die Zellen absetzen und befestigen Sie O / N in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Am Tag 3, harWeste die Keratinozyten mit 0,25% Trypsin, wie in Schritt 3.2 und 3.3 beschrieben. Resuspendieren der Keratinozyten in KSR Medium und die Platte 90% der Keratinozyten aus 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte in eine 10 cm MEF Feeder-Gericht mit KSR Medium. </li><li> Von Tag 4 ab, jeden Tag ändern Sie die KSR Medium. <ol><li> Alternativ nach Tag 18, ersetzen Sie jeden zweiten Tag Kulturmedium. Hinweis: Nicht-Keratinozyten umprogrammiert wird aufhören zu vermehren, während hiPSC Kolonien mit definierten Grenze, die menschliche embryonale Stammzellen (hES) ähneln wird ab Tag 14 entstehen - 21. </li></ol></li><li> Isolieren hiPSC Kolonien durch manuelle Dissektion von Tag 21 ab. Vermeiden hiPSC Kolonien, die eng zusammen gruppiert sind und nur hiPSC Kolonien, die sich deutlich von den anderen getrennt werden pflücken. Anmerkung: hiPSC Kolonien können früher aufgenommen werden, aber die Kolonie mit definierten Grenzen möglicherweise nicht zu früheren Zeitpunkten offensichtlich, angesichts der geringen Koloniegröße. Neuprogrammierung Effizienzen zwischen diff variierenErent Patienten Keratinozyten und wird auch durch andere Faktoren wie beispielsweise Durchlaufhäufigkeit bzw. Proliferationsrate der Keratinozyten beeinflusst. <ol><li> Für die manuelle Präparation der hiPSC Kolonien, verwenden Sie eine 26G Nadel hiPSC Kolonien unter einem Binokular geschnitten. Schneiden Sie ein hiPSC Kolonie in kleine Stücke rund 300 bis 600 &amp; mgr; m in der Länge. Übertragen Sie die Stücke von einem hiPSC Kolonie in einen neuen MEF Feeder-Platte (2,5 x 10 4 MEF / cm 2), um eine klonale Linie der hiPSCs etablieren. Zu Beginn jeder Kultur hiPSC klonalen Linie in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder Organkulturschalen, erweitern Sie dann bis 6 Well-Plattenformat. </li><li> Pflegen etablierten klonalen Linien hiPSCs in KSR Medium auf MEF Feeder. Sobald der Kultur zu erreichen 70-80% Konfluenz mit hiPSC Kolonien ~ 1,5 mm Durchmesser, Durchgang hiPSCs mit Standard-enzymatische Methoden Passagieren (Accutase, Dispase oder Collagenase IV) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Charakterisieren gegründet hiPSC Linies Pluripotenz und ihre Fähigkeit, in Zellen Vertreter der drei Keimblätter in vitro und / oder in vivo 13,19 differen bestätigen. Auch routinemäßig etablierten Test hiPSC Linien für Mykoplasmen mit kommerziell erhältlichen Kits zu gewährleisten, dass sie pathogen-frei sind. Genomische Stabilität hiPSC Linien durch Karyotypisierung oder Array-basierte Kopienzahl Variation (CNV) Analyse routinemäßig zu überwachen. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Lineage-Specific+Differentiation+Protocols.Springer+Protocols+Handbooks%22">Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks</a>. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li>
<li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li>
<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li>
<li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li>
<li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li>
<li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li>
<li>Conner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22(2001).</li>
<li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li>
<li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hair+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li>
<li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li>
<li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li>
<li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Erzeugung von patientenspezifischer hiPSCs bietet einen einzigartigen Ansatz für die Untersuchung der Pathogenese in den erkrankten Zelltypen in vitro, und stellt auch eine Plattform zum Wirkstoff-Screening, neue Moleküle, die die Krankheitsphänotypen retten kann identifizieren. Diese Krankheit Modellansatz mit hiPSCs vielversprechende Ergebnisse für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Long-QT-Syndrom, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose 22 ergab. Mehrer...

Die Entdeckung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) hat das Gebiet der regenerativen Medizin revolutioniert und bietet eine praktikable Methode zur Erzeugung von patientenspezifischen Stammzellen 1-3. hiPSCs wurden erfolgreich aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, 4,5, 6,7 hämatopoetischen Zellen, Nieren-Epithelzellen aus Urin 8 und Keratinozyten 9,10 erzeugt. Bisher Haut-Fibroblasten und blutbildenden Zellen stellen die am häufigsten verwendeten Zellquellen zur Erzeugung von patientenspezifischen iPSCs. Dies mag auf die Tatsache zurückzuführen, dass Hautbiopsien und Blutentnahme sind Routine medizinischen Verfahren und großen Biobanken von Patienten Blut oder Hautproben wurden in vielen Ländern etabliert. Im Gegensatz zu den Blutzellen und Hautfibroblasten, die invasive Extraktionsmethoden erfordern, Keratinozyten stellen eine leicht zugängliche Zelltyp für hiPSC Generation. Keratinocytes sind Keratin-reiche Epithelzellen, die das Äußere epidermalen Barriere der Haut zu bilden und werden auch in Nägel und Haare 11 gefunden. Insbesondere kann auf die Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS) Haarfollikel von einer externen Zellschicht, die den Haarschaft zusammen mit dem inneren Wurzelscheide (IRS) Zellen (12, Figur 1) abgedeckt ermittelt werden. Wie Haar Sammlung ist ein einfaches Verfahren, das nicht die Unterstützung des medizinischen Personals erfordert, bietet es eine Chance für die Patienten zu sammeln und zu ihren eigenen Haarproben an Laboratorien, die die Sammlung von Patientenproben für hiPSC Generation erheblich erleichtern würde. Epidermiskeratinocyten auch eine höhere Wirksamkeit und eine schnellere Anpassung Umprogrammierung Kinetik im Vergleich zu Fibroblasten, zusätzlich zu den Vorteilen der Verwendung von Keratinozyten, wie die Ausgangszellen für die Erzeugung hiPSC 9,13. Weiterhin kann hiPSCs auch mit anderen Zellpopulationen in der Haarfollikel erzeugt werden,einschließlich der dermalen Papillenzellen an der Basis des Haarfollikels 14,15 entfernt. Frühere Berichte des iPSC Generation mit Haar-abgeleiteten Zellen verwenden häufig retroviralen oder lentiviralen-basierte Verfahren der Reprogrammierung 9,14,15. Allerdings sind diese virale Verfahren einzuführen unerwünschte genomische Integration ausländischer Transgenen während Neuprogrammierung. Im Vergleich dazu ist die Verwendung von episomalen Vektoren, eine Möglichkeit, die nicht-virale Verfahren zum Umprogrammieren Integration freien iPSCs 4 zu erzeugen. Wir haben bereits eine einfache, kostengünstige und nicht-virale Verfahren zur effizienten umprogrammieren Keratinozyten in hiPSCs mit episomalen Vektoren 13 entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Keratinozyten stamm hiPSCs, einschließlich der Ableitung von Keratinozyten aus gezupften Haare, Erweiterung und Wartung der Keratinozyten und anschließender Neuprogrammierung zu hiPSCs generieren.

<table><tbody><tr><td>Antibiotika-Mix:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml Antimykotisches Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>Antibiotika-Mix ist aus PBS hergestellt.</td></tr><tr><td>1X Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Ersatz (KSR) Medium:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Das KSR-Medium wird vor der Verwendung mit Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) filtriert. bFGF wird dem Medium vor der Verwendung frisch zugesetzt.</td></tr><tr><td>20% Knockout-Serumersatz (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 mit Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1&mal; MEM nicht-essentielle Aminosäure</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,5& mal; Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,1 mM &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ng/ml, frisch zugesetzt)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Keratinozyten-Medium:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; EpiLife mit 60&nbsp; &Mikro; M Calcium</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1 mal Nahrungsergänzungsmittel für humane Keratinozyten (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS) medium:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Das FBS-Medium wird vor der Verwendung mit Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) filtriert.</td></tr><tr><td>10% fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0,5x Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Extrazelluläre Matrix (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel lagern und lagern in -80°; C nach Hersteller" s Anweisungen. Die Stammkonzentration von Matrigel variiert leicht von Charge zu Charge (~9 mg/ml). Wir empfehlen die Verwendung von 200&micro; l Matrigel zum Beschichten einer 12-Well-Platte (~150&micro; g/well).&nbsp;</td></tr><tr><td>Beschichtungsmatrix-Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Beachten Sie, dass pCXLE-eGFP nur zur Überwachung der Transfektionseffizienz verwendet wird und nicht für die Reprogrammierung erforderlich ist.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgen</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgen</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgen</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine (aus Schweinehaut)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Besteht aus 0,1 % Gelatine in destilliertem Wasser. Vor Gebrauch autoklavieren.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr> Maus <tr><td>embryonale Fibroblasten (MEF) Feeder</td><td></td><td></td><td>MEF kann durch Mitomycin C-Behandlung oder Bestrahlung inaktiviert werden, wie zuvor beschrieben 16.</td></tr><tr><td>26G-Nadel</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte (Gewebekultur behandelt)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte (Gewebekultur behandelt)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Schale (Gewebekultur behandelt)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Anwendung bei 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Anwendung bei 1 mg/ml</td></tr><tr><td>TRA-160 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>Anwendung bei 5 &; Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>Anwendung bei 5 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>NANOG Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>Einsatz bei 10 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert Detektionskit</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

generation der integration freie menschen induzierten pluripotenten stammzellen mit haarstamm keratinozyten

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Jüngste Fortschritte in der Reprogrammierung ermöglichen es uns, somatische Zellen in humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) umzuwandeln. Die Krankheitsmodellierung mit patientenspezifischen hiPS-Zellen ermöglicht die Untersuchung des zugrundeliegenden Mechanismus der Pathogenese und bietet auch eine Plattform für die Entwicklung von In-vitro-Wirkstoffscreenings und Gentherapien zur Verbesserung der Behandlungsoptionen. Das vielversprechende Potenzial von hiPSCs für die regenerative Medizin zeigt sich auch an der steigenden Zahl von Publikationen (>7000) zu iPSCs in den letzten Jahren. Verschiedene Zelltypen aus unterschiedlichen Abstammungslinien wurden erfolgreich für die Erzeugung von hiPSCs verwendet, darunter Hautfibroblasten, hämatopoetische Zellen und epidermale Keratinozyten. Während Hautbiopsien und Blutentnahmen in vielen Labors routinemäßig als Quelle für somatische Zellen für die Erzeugung von hiPSCs durchgeführt werden, wird die Entnahme und anschließende Ableitung von Haarkeratinozyten seltener verwendet. Aus Haaren gewonnene Keratinozyten stellen einen nicht-invasiven Ansatz dar, um Zellproben von Patienten zu gewinnen. Hier skizzieren wir eine einfache nicht-invasive Methode zur Gewinnung von Keratinozyten aus gezupftem Haar. Wir bieten auch Anweisungen für die Wartung von Keratinozyten und die anschließende Reprogrammierung zur Erzeugung integrationsfreier hiPSC unter Verwendung episomaler Vektoren.

Das Haar durchläuft drei verschiedene Phasen des Wachstumszyklus: Anagenphase (Wachstumsphase), catagen (die Regressionsphase) und Telogen (die Ruhephase) 20,21. Das Anagen Haarfollikel enthält mehrere Schichten von Epithel; Diese Schichten sind die ORS, IRS und den Haarschaft (Abbildung 1). Anagenhaar schließlich einen Übergang zu dem catagen Phase, die durch Apoptose der ORS und Beendigung der Haarschaft Differenzierung gekennzeichnet ist. Schließlich catagen Haar Übergang in die Telogenpha...

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung von aus Haaren gewonnenen Keratinozyten zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Haare von einem Spender isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Haare anzupflanzten, um das Auswachsen von Keratinozyten zu fördern.Anschließend werden die Keratinozyten in vitro kultiviert und vermehrt. Im letzten Schritt erfolgt die Reprogrammierung der Keratinozyten zu humanen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels einer episomalen Reprogrammierungsmethode. Letztendlich können humane iPS-Zellen isoliert und mittels Immunhistochemie charakterisiert werden, um die Expression von Pluripotenzmarkern nachzuweisen.Der allgemeine Vorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der retroviralen oder lentiviralen Methode liegt darin, dass durch die Verwendung episomaler Faktoren unerwünschte Transgene vermieden werden. Die Integration in das Genom der erzeugten Stammzellen wird vermieden. Beginnen Sie damit, eine Gefriermenge der extrazellulären Matrixlösung über Nacht auf Eis aufzutauen. Am nächsten Morgen pipettieren Sie mit vorab gekühlten Pipettenspitzen 200 µL der Lösung in 12 mL gekühltes DMEM/F12-Medium. Geben Sie ein Milliliter der verdünnten extrazellulären Matrixlösung in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Vertiefungen mit Matrix zu beschichten. Sammeln Sie anschließend primäre menschliche Haare vom Kopf des Spenders, indem Sie die Finger nahe an der Haarwurzel ansetzen und das Haar mit einer schnellen, gleichmäßigen Bewegung herausziehen.Überprüfen Sie, ob jedes gesammelte Haar einen intakten Haarfollikel enthält. Legen Sie den Follikel unter ein Stereomikroskop und bestimmen Sie die Wachstumsphase jedes Haares. Sammeln Sie fünf bis zehn antigene Haare von jeder Person, um keratinöses Eis zu extrahieren.Die Antigenphase enth&auml;lt im Gegensatz zur T-Phase mehrere Epithelschichten. Geben Sie die Haarproben f&uuml;nf Minuten lang in eine Petrischale mit 10 Milliliter einer antibiotischen Mischung und waschen Sie sie anschlie&szlig;end f&uuml;nf Minuten bei Raumtemperatur in PBS. Fassen Sie danach das Haar mit sterilen Pinzetten und schneiden Sie mit einem Paar steriler Scheren den &uuml;berstehenden Haarschaft ab, sodass ein Haarfragment mit intaktem Haarfollikel und etwa 0,5 bis einem Zentimeter Haarschaft &uuml;brig bleibt.Übertragen Sie vorsichtig ein Haarfragment in jede Vertiefung der mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte. Geben Sie mit der sterilen Pinzette etwa 100 bis 200 Mikroliter an Serumersatzmedium tropfenweise in jede Vertiefung, die Haarproben enthält.Danach die Platte in den Inkubator stellen und die Follikel über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid anheften lassen. Am folgenden Tag vorsichtig weitere 100 bis 200 Mikroliter an Serumersatzmedium tropfenweise hinzufügen, um die Haarproben feucht zu halten. Die Haarproben täglich überprüfen, um sicherzustellen, dass die Haarfollikel erfolgreich an der Platte angeheftet sind.Sobald sie angeheftet sind, vorsichtig zusätzliche 500 Mikroliter Medium in die Vertiefung geben. Erneuern Sie das Medium alle zwei Tage. Beschichten Sie eine sechsgliedrige Platte mit Kollagen.Verwenden Sie eine Vorbehandlung, wie beispielsweise ein Beschichtungsmatrix-Kit, indem Sie 680 µL des Verdünnungsmediums aus dem Kit in jede Vertiefung geben, gefolgt von 6,8 µL der Beschichtungsmatrix-Lösung. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Beschichtung sicherzustellen. Lassen Sie die beschichtete Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bevor Sie die Keratinozyten ansäen.Entfernen Sie die Beschichtungslösung und lösen Sie die Keratinozyten in der Kultur durch Zugabe von 500 µL 0,25 % Trypsin pro Mulde in eine Einzelzell-Suspension auf. Inkubieren Sie die Platten zwei bis fünf Minuten bei 37 °C. Sobald sich die Zellen von der Platte lösen, neutralisieren Sie das Trypsin mit 500 µL Medium mit Serum und sammeln Sie die Zellen in einem sterilen 15-mL-Röhrchen. Entfernen Sie das Haarfragment mithilfe sterilisierter Pinzette, pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie diese anschließend.Suspendieren Sie sie in frischem Keratinozyten-Wachstumsmedium und geben Sie 40.000 Keratinozyten in eine Vertiefung der mit Kollagen beschichteten Platte unter Zugabe von Keratinozyten-Medium. Wechseln Sie das Medium jeden Tag und passagieren Sie die Zellen, wenn die Kultur etwa 80 % konfluent ist. Beschichten Sie eine sechswellige Platte mit Gelatine, indem Sie zwei Milliliter einer 0,1 %-Gelatine-Lösung in jede Vertiefung geben und die Gelatine mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur wirken lassen. In der Zwischenzeit dissoziieren Sie Keratinozyten der Passage sechs oder niedriger zu einer Einzelzell-Suspension, indem Sie je Vertiefung ein Milliliter einer 0,25 %-Trypsin-Lösung hinzufügen und die Zellen zwei bis fünf Minuten lang inkubieren. Bei 37 Grad Celsius wird die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von einem Milliliter Medium mit Serum gestoppt, und die Zellen werden in einem 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Die Zellen werden abzentrifugiert und in Keratinozyten-Medium resuspendiert. Anschließend werden 100.000 bis 150.000 Keratinozyten pro Vertiefung in eine mit Gelatine beschichtete Sechs-Vertiefungs-Platte ausgeplattet und über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag, Tag null, wird die Platte überprüft, um sicherzustellen, dass die Zellen zu 50–60 % konfluent sind.Führen Sie eine Transfektion der episomalen Reprogrammierungsvektoren in die Keratinozyten mit einem Verhältnis von acht Mikrolitern Transfektionsreagenz zu zwei Mikrogramm gesamter Plasmid-DNA wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben durch. Am nächsten Tag, Tag eins, wechseln Sie das Keratinozyten-Medium und überprüfen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie den Prozentsatz der grün fluoreszierenden Protein-positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop abschätzen. Eine Transfektionseffizienz von 60 bis 70 % wird am zweiten Tag erwartet.Wiederholen Sie die Transfektion, um die Transfektionseffizienz auf über 90 % zu erhöhen. Beschichten Sie dann eine 10 cm-Schale mit fünf Milliliter 0,1 % Gelatine für mindestens 20 Minuten. Impfen Sie 4 Millionen mitotisch inaktivierte Futterzellen pro 10 cm-Schale in FBS-Medium aus, wie von Conrad et al. beschrieben, und lassen Sie die Zellen über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid am dritten Tag anschwellen und anheften. Gewinnen Sie die transfizierten Keratinozyten wie zuvor gezeigt und resuspendieren Sie sie in KSR-Medium.90 % der Keratinozyten aus einem der Wells in eine 10 cm große Petrischale überführen, die mit Futterzellen vorbereitet wurde, und mit KSR bedecken. Ab Tag 21 humane induzierte pluripotente Stammzellkolonien durch manuelle Dissektion isolieren. Kolonien vermeiden, die dicht beieinander liegen, und nur solche Kolonien auswählen, die deutlich von anderen getrennt sind.Verwenden Sie für die manuelle Dissektion eine Nadel mit 26 Gauge, um die Kolonien unter einem Stereomikroskop in kleine Stücke von etwa 300 bis 600 Mikrometern Länge einzuschneiden. Überführen Sie die Stücke von einer Kolonie in eine neue MEF-Futterzellen-Platte, um eine klonale Linie humaner induzierter pluripotenter Stammzellen zu etablieren. Sobald die Kultur eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht hat und humanen induzierten pluripotenten Stammzellkolonien mit einem Durchmesser von etwa 1,5 Millimetern aufweist, passagieren Sie die Zellen mit standardmäßigen enzymatischen Aufbereitungsmethoden wie Accutase, Trypsin oder Kollagenase.Vier, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bei Befolgung dieses Protokolls können Rezykly-Überwachsungen bereits drei Tage nach der Haarbefestigung beobachtet werden und proliferieren weiterhin. Die hier gezeigten Keratinozyten wurden auf eine neue Platte übertragen, und diese Zellen können über mehrere Passagen hinweg kultiviert werden.Dieses Bild zeigt eine typische, aus Keratinozyten stammende humane induzierte pluripotente Stammzellkolonie. Nach 32 Tagen der Umprogrammierung kann es im Zentrum der Kolonie zu einer Differenzierung kommen. Nach manueller Isolierung zeigen die gewonnenen Zellen typischerweise ein hohes Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und eine klar definierte Koloniengrenze.Sie exprimieren außerdem eine Reihe von pluripotenten Markern wie OCT4, Nanog und TRA-1-60. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Keratinozyten aus Haaren isoliert und sie in humane induzierte pluripotente Stammzellen umprogrammiert.

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelheiten des Verfahrens zur Kryokonservierung humanen iPS-Zellen in KnockOut SR Kryokonservierungsmedium und Gewinnung dieser Zellen in völliger KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) mittel-oder Feeder-basierte KnockOut SR Medium.

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Dieser Artikel stellt eine robuste Protokoll zur Isolierung und Kultivierung der Neuralleiste Stammzellen aus menschlichen Haarfollikeln.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für die Differenzierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in jeder Somiten Derivat (Myotom, Sklerotom Dermatome und Syndetome) in chemisch definierten Bedingungen, die hat Anwendungen in zukünftigen Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien in der orthopädischen Chirurgie.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hautorganoiden, die Haarfollikel aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen enthalten, unter Verwendung eines planaren, physiologisch relevanten Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultursystems, um die Hautarchitektur und -funktion zu replizieren.

Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten planaren haartragenden Hautorganoiden unter Verwendung eines Luft-Flüssig-Grenzflächenkultursystems

Erfahren Sie die Reprogrammierung von Haarstamm-Keratinozyten zu integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels episomaler Vektoren. Diese Methode ermöglicht die sichere Generierung von hiPSCs für regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

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