Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung von aus Haaren gewonnenen Keratinozyten zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Haare von einem Spender isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Haare zu plattieren, um das Auswachsen von Keratinozyten zu erleichtern.

Anschließend werden die Keratinozyten in vitro erhalten und erweitert. Der letzte Schritt besteht darin, die Keratinozyten mit Hilfe einer episomalen Reprogrammierungsmethode in humaninduzierte pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren. Letztendlich können humane IPS-Zellen isoliert und immunhistochemisch charakterisiert werden, um die Expression von pluripotenten Markern zu zeigen.

Der Gesamtvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der retroviralen oder lentiviralen Methode besteht darin, dass wir durch die Verwendung des episomalen Faktors unerwünschte Transgene vermeiden. Die Integration in das Genom in den Stammzellen, die erzeugt werden, beginnen mit dem Auftauen eines Fläschchens mit extrazellulärer Matrixlösung auf Eis über Nacht. Am nächsten Morgen geben Sie mit vorgekühlten Pipettenspitzen 200 Mikroliter der Lösung auf 12 Milliliter gekühltes DM F 12 Medium.

Geben Sie einen Milliliter der verdünnten extrazellulären Matrixlösung in jede Vertiefung einer 12. Vertiefung. Platten Sie die Vertiefung auf und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Vertiefungen mit Matrix zu beschichten. Entnehmen Sie als Nächstes das primäre menschliche Haar vom Kopf des Spenders, indem Sie die Finger nahe an die Haarwurzel legen und das Haar in einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung zupfen.

Vergewissern Sie sich, dass jedes entnommene Haar einen intakten Haarfollikel enthält. Legen Sie den Follikel unter ein Präpariermikroskop und bestimmen Sie die Wachstumsphase jedes Haares. Sammeln Sie fünf bis 10 Antigenhaare von jedem Individuum, um keratinöses Eis zu extrahieren.

Die Antigenphase enthält im Gegensatz zur T-Phase mehrere Epithelschichten. Geben Sie die Haarproben fünf Minuten lang in eine Petrischale mit 10 Millilitern einer Antibiotikamischung und waschen Sie sie dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS. Fassen Sie dann das Haar mit einer sterilen Pinzette an und schneiden Sie mit einer sterilen Schere den überschüssigen Haarschaft ab, so dass ein Haarfragment mit einem intakten Haarfollikel und etwa 0,5 bis einem Zentimeter Haarschaft übrig bleibt.

Übertragen Sie vorsichtig ein Haarfragment in jede Vertiefung der mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte. Mit der sterilen Pinzette tue ich etwa 100 bis 200 Mikroliter Serumersatz. Medium tropfenweise zu jeder Vertiefung mit Haarproben.

Legen Sie dann die Platte in den Inkubator und lassen Sie die Follikel über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am nächsten Tag ansetzen. Fügen Sie vorsichtig weitere 100 bis 200 Mikroliter Serumersatz hinzu, mittlere Tropfen, um die Haarproben feucht zu halten. Überprüfen Sie die Haarproben täglich, um sicherzustellen, dass sich die Haarfollikel erfolgreich an der Platte befestigt haben.

Geben Sie nach dem Anbringen vorsichtig weitere 500 Mikroliter Medium in die Vertiefung. Wechseln Sie alle zwei Tage das Medium. Preco eine sechswandige Platte mit Kollagen.

Typ eins unter Verwendung einer Vorbehandlung, wie z. B. eines Beschichtungsmatrix-Kits, bei dem 680 Mikroliter des Verdünnungsmediums aus dem Kit in jede Vertiefung gegeben werden, gefolgt von 6,8 Mikrolitern der Beschichtungsmatrixlösung. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. Lassen Sie die beschichtete Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bevor Sie Keratinozyten plattieren.

Entfernen Sie die Beschichtungslösung, dissoziieren Sie Keratinozyten in Kultur in eine Einzelzellsuspension, indem Sie 500 Mikroliter 0,25 %Tripsin pro Vertiefung hinzufügen und die Platten zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald sich die Zellen von der Platte lösen, inaktivieren Sie das Trypsin mit 500 Mikrolitern serumhaltigem Medium und sammeln Sie die Zellen in einem sterilen 15-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie das Haarfragment mit einer sterilisierten Pinzette, pelletieren Sie die Zellen und releben Sie es dann.

Suspendieren Sie sie in einer frischen Keratinozyten-Wachstumsmediumplatte 40.000 Keratinozyten in eine Vertiefung der kollagenbeschichteten Platte in Gegenwart von Keratinozytenmedium. Wechseln Sie das Medium jeden Tag und passieren Sie die Zellen, wenn die Kultur zu etwa 80 % konfluent V ist. Kodieren Sie eine sechswandige Platte mit Gelatine, indem Sie jeweils zwei Milliliter einer 0,1 %igen Gelatinelösung hinzufügen. Lassen Sie die Gelatine mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur beschichten. In der Zwischenzeit dissoziieren Sie Keratinozyten, die sich in der sechsten oder niedrigeren Passage befinden, in eine Einzelzellsuspension, indem Sie einen Milliliter 0,25 % Tryin pro Vertiefung hinzufügen und die Zellen zwei bis fünf Minuten lang inkubieren.

Bei 37 Grad Celsius inaktivieren Sie das Trypsin mit einem Milliliter serumhaltigem Medium und sammeln die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in Keratinozytenmedium. Füllen Sie dann 100.000 bis 150.000 Keratinozyten pro Vertiefung in eine gelatinierte Platte mit sechs Vertiefungen und inkubieren Sie sie über Nacht am nächsten Tag, dem Tag Null. Überprüfen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen zu 50 bis 60 % konfluent sind.

Es wird eine Transfektion der episomalen Reprogrammierungsvektoren an den Keratinozyten unter Verwendung eines Verhältnisses von acht Mikrolitern Transfektionsreagenz zu zwei Mikrogramm Gesamtplasma-DNA durchgeführt, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Am nächsten Tag, dem ersten Tag, wechseln Sie das Keratinozytenmedium und überprüfen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie den Prozentsatz der grün fluoreszierenden Protein-positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop schätzen. Am zweiten Tag wird eine Transfektionseffizienz von 60 bis 70 % erwartet.

Wiederholen Sie die Transfektion, um die Transfektionseffizienz auf mehr als 90 % zu erhöhen. Kodieren Sie dann eine 10-Zentimeter-Schale mindestens 20 Minuten lang mit fünf Millilitern 0,1 % Gelatine vor. Plattieren Sie 4 Millionen mitotisch inaktivierte Feederzellen pro 10-Zentimeter-Schale in FBS-Medium, wie in Conrad Al beschrieben, und lassen Sie die Zellen sich am dritten Tag über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid absetzen und anheften. Ernten Sie die transfizierten Keratinozyten wie zuvor gezeigt und resuspendieren Sie sie in einer KSR-Mediumplatte.

90% der Keratinozyten aus einer der Vertiefungen in eine 10 Zentimeter große Schale, die mit Feederzellen vorbereitet ist, und bedecken sie mit KSR. Medium Humane induzierte pluripotente Stammzellkolonien ab dem 21. Tag durch manuelle Dissektion isolieren. Vermeide Kolonien, die dicht beieinander liegen, und wähle nur Kolonien, die klar von anderen getrennt sind.

Für die manuelle Dissektion schneiden Sie die Kolonien mit einer 26-Gauge-Nadel unter einem Präpariermikroskop in kleine Stücke von etwa 300 bis 600 Mikrometern Länge. Übertragen Sie die Stücke aus einer Kolonie in eine neue MEF-Feeder-Platte, um eine klonale Linie von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu etablieren. Sobald die Kultur eine Konfluenz von 70 bis 80 % mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellkolonien von etwa 1,5 Millimetern Durchmesser erreicht, werden die Zellen unter Verwendung von enzymatischen Standardverpackungsmethoden wie Accutane, Sase oder Kollagenase durchgelassen.

Vier, laut Herstellerangabe. Wenn dieses Protokoll befolgt wird, können Auswüchse bereits drei Tage nach dem Anhaften der Haare beobachtet werden, die sich weiter vermehren. Die hier gezeigten Keratinozyten wurden auf eine neue Platte übertragen und können über mehrere Passagen erhalten werden.

Dieses Bild zeigt eine typische keratinozytenabgeleitete humane induzierte pluripotente Stammzellkolonie. Nach 32 Tagen der Reprogrammierung kann es im Zentrum der humanen induzierten pluripotenten Stammzellkolonie zu einer gewissen Differenzierung kommen. Nach der manuellen Entnahme weisen die abgeleiteten Zellen in der Regel ein hohes Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma und eine definierte Koloniegrenze auf.

Sie exprimieren auch eine Reihe von pluripotenten Markern, wie z. B. OCT four nag und TRA one 60. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Keratinozyten aus Haaren extrahiert und sie in menschlich induzierte Stammzellen umprogrammiert.