Name: Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Produktion von DNA-Ministrings für die Gendelivery mittels eines einfachen Ein-Schritt-Systems. Diese Methode ermöglicht die Herstellung sicherer, linearer DNA-Vektoren in weniger als acht Stunden.

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Die Autoren danken den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) für die Förderung dieser Arbeit.

1. Herstellung von Medien und Kulturen <ol><li> Für LB + Amp: Bereiten 500 ml Luria-Bertani-Brühe (LB) sterilisiert für 30 min einem Autoklaven bei 121 ° C verwendet wird. Supplement mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml Ampicillin und lagern bei 4 ° C zu erhalten, bis sie benötigt. </li><li> Für TB + Amp: Bereiten Sie sich auf große (500 ml oder mehr) Produktionsvolumina MiniString-. Bereiten 600 ml steriler Terrific Broth (TB) sterilisiert unter Verwendung eines Autoklaven bei 121 ° C für 30 min. Supplement mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml Ampicillin und lagern bei 4 ° C zu erhalten, bis sie benötigt. </li><li> Für LB-Agar + Amp: Bereiten sterile LB-Agarplatten mit LB + Amp mit 15 g / l Agar ergänzt vorbereitet. Aliquotieren ca. 15, - 20 ml in sterile Petrischalen und speichern den Kopf bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie eine Ausstrichplatte von W3NN [PDMS] von aseptisch Ausstreichen W3NN [PDMS] Zellen auf LB-Agar + Amp. Die Platte overnight bei 30 ° C, bis einzelne Kolonien beobachtet werden können. Sie brüten nicht W3NN oberhalb dieser Temperatur dereprimieren protelomerase Ausdruck zu vermeiden. </li><li> Aseptisch Transfer 5 ml LB + Amp in ein steriles Reagenzglas. Bereiten Sie eine Nacht-Kultur von W3NN [PDMS] durch dieses Volumen mit einer einzelnen Kolonie von der Ausstrichplatte Inokulation. Inkubieren der Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler bei 230-250 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 2. Wachstum Phase <ol><li> Aseptisch Transfer 10 ml LB + Amp in einen sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben und impfen mit 100 &amp; mgr; l der über Nacht W3NN [PDMS] Kultur in die vorbereitete LB + Amp, so dass eine 1: 100-Verdünnung. <ol><li> Für größere Volumina, 500 &amp; mgr; l über Nacht Kultur in 50 ml TB + Amp in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben, anstelle von LB + Amp. </li><li> Alternativ können Sie als zweite &quot;repräsentativ&quot; Kultur in Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 250 rpm bis zum culture erreicht durch eine optische Dichte (OD) oder Absorption bis zur späten logarithmischen Phase, angegeben mid: A 600 = 0,8. Nach 1-2 Stunden sollte das Medium beginnen mit dem bloßen Auge trüb erscheinen. <ol><li> Aseptisch 1 ml der Kultur auf eine saubere Spektrophotometerküvette. </li><li> Messen Sie die Lichtabsorption eines UV-VIS-Spektralphotometer mit der Wellenlänge auf 600 nm verwendet wird. Verwenden Sie 1 ml der Medien, in denen Zellen, die den Rohling (LB oder TB) zu setzen angebaut wurden. Optional können Sie die repräsentative Kultur aus Schritt statt 2.1.3 für diesen Schritt. </li><li> Wenn die Kultur noch nicht den entsprechenden OD erreicht, kehren Sie zu den Shaker geben und überprüfen Sie noch einmal jede halbe Stunde. Überprüfen Sie die OD häufiger als die A 600 0,8 nähert. </li></ol></li><li> Sobald die Kultur der späten log - Phase, angezeigt durch A 600 = 0,8, aseptisch übertragen die Kultur in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen erreicht hat. </li><li> Sammle die Zellen durch die Kultur bei 10.000 xg für 10 min zentrifugiert. Überprüfen Sie für eine peam Boden des Röhrchens llet. </li><li> Umfüllen geklärte Überstand in einen geeigneten Abfallbehälter Biohazard. Nicht das Zellpellet stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5, bis alle Zellen gesammelt wurden. </li><li> Re-suspend das Pellet in 100 ul LB + Amp. Absaugen mit einer Mikropipette oder einen Wirbelmischer verwenden. Für eine größere MiniString- Produktion, resuspendieren Sie das Pellet aus einem 50 ml TB + Amp-Kultur in 1 ml frischem LB + Amp-Medien. </li></ol> 3. Ministring Produktion <ol><li> Aseptisch 20 ml LB + Amp in einem 125 ml Erlenmeyerkolben und Wärme auf 42 ° C. Für eine höhere Produktions MiniString- bereiten 500 ml LB + Amp, vorgewärmt auf 42 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Aufwirbelung in die vorgewärmte Medium. </li><li> Inkubieren bei 42 ° C und 250 rpm bis zum letzten logarithmischen Phase, angedeutet durch A 600 = 1,0. Lassen Sie keine 20 ml Kultur bei 42 ° C über 1 Stunde. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur auf 37 ° C und lassen Sie die Kultur für eine zusätztionale 90 min. Für 500 ml, lassen Sie die Kultur für eine zusätzliche Induktionszeit von 90 bis 120 min und nicht die Temperatur zu senken. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur auf 30 ° C und lassen Sie die Kultur bei 200 Umdrehungen pro Minute für eine zusätzliche Temperaturherunterschalten Zeitraum von 2 h schütteln. Für 500 ml, wobei die Temperatur Herunterschalten bis 4 Stunden verlängern oder über Nacht. </li></ol> 4. Ernten Ministrings <ol><li> Unter aseptischen Bedingungen wird die Kultur in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 g für 10 min und inspizieren für einen Pellet. </li><li> Den Überstand umfüllen in einen geeigneten Abfallbehälter Biohazard, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen, bis alle Zellen gesammelt wurden. </li><li> Bewahren Sie das Pellet für Plasmid-Extraktion mit einer kommerziellen Extraktion und Endotoxinentfemung Kit oder Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C für die spätere Extraktion. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir beschreiben hier ein einfaches System zur Herstellung von LCC DNA Ministrings unter Verwendung eines einstufigen hitzeinduzierbaren Protokoll, das zur Seite keine spezielle Ausrüstung erfordert, von der, die in typischen Bakterienwachstum und Manipulation verwendet wird. DNA-Ministrings sind verwindungssteife, stabile lineare DNA-Expressionskassetten, frei von prokaryotischen genetischen Elementen. Sie können anstelle von konventionellen Verfahren für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen, sowie in Abschätzungen in Richtung der Wirksamkeit der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von &quot;Mini&quot; Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt - in - vivo - Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen - Transfer - Anwendung ohne die Notwendigkeit für mehrere teure In - vitro - Verfahren. Es gibt mehrere wichtige Schritte zusorgen für eine optimale MiniString- Produktion (Abbildungen 2 und 3). Wärmeinduktion ist der kritischste Schritt zur Herstellung MiniString-. Vollständiges Fehlen der Produktion von MiniString- ist höchstwahrscheinlich wegen des Mangels an Wärmeinduktion (Zellen bei 30 ° C gehalten), wo Unterdrückung der protelomerase Ausdruck Umwandlung von Vorläufer Plasmid LCC MiniString- verhindert. Im Anschluss an die Wärmeinduktion Protokoll, erwarten eine Produktionseffizienz von etwa 75%. Wärmeinduktion ist optimal, während Zellen in der log-Phase sind. Obwohl es in MiniString- PE keinen statistisch signifikanten Unterschied ist , wenn die Zellen in der stationären Phase ( &quot;Overgrown&quot;, Abbildung 3) verwenden, haben wir fast eine 50% ige Abnahme der Gesamt Plasmidausbeute beobachten. Die Erträge werden auf der verwendeten Plasmid-Extraktionsprotokoll abhängen. Für eine optimale MiniString- Produktion auslösen Wärmeinduktion, während Zellen in der log-Phase sind. Schlechte MiniString- Produktion wird höchstwahrscheinlich ein Ergebnis einer längeren Temperatur Hoch- oder insufficie seinnt Temperatur Herunterschalten. Längerer Temperatur Hochschalten wird abgeraten , da dies der E. aktiviert coli Hitzeschockantwort 15, die protelomerase Aktivität hemmen kann und mit dem Plasmid Stabilität stören. Daher die Temperatur Herunterschalten Timing ist ein weiterer wichtiger Schritt für eine effiziente MiniString- Produktion. Ohne zusätzliche Inkubationszeit bei 30 ° C wurde MiniString- Produktionseffizienz als sehr schlecht zu sein ( &quot;Early Removal&quot;, Abbildung 3). Dies kann auf die Menge an Zeit für Tel Expression und Aktivität erforderlich zurückzuführen. Der Ursprung Prophagen PY54 Codierung Tel protelomerase infiziert normalerweise Yersinia, die optimal wächst um 28 ° C 12, was darauf hinweist , dass 30 ° C auch für Tel Aktivität mehr optimal ist. Die DNA - minivector Produktionssystem verwendet eine in vivo Plattform qualitativ hochwertige bakterielle Sequenz freie DNA minivectors zu erzeugen. i Modifikationen des Protokolls kannnclude die Wachstumsmedien zu verändern Plasmid und die Proteinproduktion zu optimieren, um das Zellwachstum während der Wachstumsphase (TB anstelle von LB) zu fördern, oder die Effizienz zu steigern MiniString- Produktion und Umwandlung. Für größere Kulturvolumina (200 ml und mehr), Temperatur Herunterschalten und Inkubation bei 30 ° C kann auf MiniString- PE über Nacht ohne starke negative Auswirkung verlängert werden. Wir haben als Beispiel für die 500-ml-Kulturen Änderungen in unserem Protokoll enthalten. Reinigung von DNA - Ministrings können durch in vitro - Endonuklease - Verdau des prokaryotischen Rückgrat beschleunigt werden. Es gibt eine Anzahl von Endonuclease - Zielstellen (beispielsweise PI-SceI, PvuI, ScaI) auf dem prokaryotischen Rückgrat des Vorläufers Plasmid, das geschnitten werden kann , offen linear zu belichten endet, so dass für in vitro - Abbau des prokaryotischen Rückgrat. Isolierung von Ministrings aus anderen Vektorarten können auch durch Anionenaustauschermembran - Chromatographie 16 erreicht werden. Eine Strombegrenzung, die mit dem LCC-DNA-Vektor-Produktionssystem ist die Notwendigkeit einer Reinigung der DNA MiniString- von anderen LCC und CCC Produkte. Obwohl Verfahren unter Verwendung von Standard-Plasmidisolation leicht gereinigt, kann der Isolationsschritt noch ein Nachteil in einer groß angelegten Einstellung sein. Trennung des MiniString- kann AGE zu verwenden, wenn die Ministring und das LCC prokaryotischen Rückgrat zu ähnlich groß sein zeitraubend. Alternativ bieten kann Anionenaustauschermembran Chromatographie eine bessere Trennung von Ministrings von CCC Vektorarten 16. Temperatur Hochschalten kann eine weitere mögliche Einschränkung sein , da hohe Temperaturen auch die Hitzeschockantwort in E. aktivieren coli, das rekombinante Protein liefert 17 wirkt sich negativ auf und folglich Raten von Plasmid reduzieren Umstellung auf MiniString-. Wir berichten an anderer Stelle Optimierungen der Produktionsplattform zu umgehen und / oder zu mildern solche Effekte von Hitzeschock - 18. Wiroptimieren derzeit auch Methoden LCC Kontamination prokaryotischen Rückgrat in vivo zu beseitigen oder zu reduzieren. Chromosomale Integration der LCC DNA MiniString- stört das Wirtschromosom und unterzieht die Zelle zur Apoptose. Nicht nur, dass diese zu reduzieren, mögliche negative Auswirkungen von Insertionsmutagenese wie oncogenesis und Silencing von benachbarten Genen, wodurch die Verbesserung ihrer Sicherheit; die letale Wirkung kann auch als ideales Verfahren zum knock-in und gene replacement Untersuchungen ohne die damit verbundenen Nebenwirkungen und Beschädigungen der Integration dienen. DNA MiniString- Vektoren können in Richtung der Transfer und die Expression von Genen für die therapeutische Proteine, RNA, Antikörper oder Antigene in einem gegebenen Ziel in vivo angewendet werden , oder eine Fehl- oder nicht - funktionelle Allel ersetzen. Die einfache Ein-Schritt hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem ermöglicht DNA MiniString- Vektoren leicht für klinische oder industrielle Anwendungen hergestellt werden.

Das Ziel ist , skalierbare Mengen von linearen zu produzieren kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors mit einem einfachen und einen hohen Wirkungsgrad in einem Schritt hitzeinduzierbarer in vivo DNA MiniString- Produktionssystem. DNA-Ministrings bieten eine sichere und wirksame nicht-viralen Strategie DNA zu liefern. Sie kombinieren die Sicherheit von LCC-Vektoren mit der Effizienz von DNA-Minicircles, und bieten auch eine sicherere Alternative zu Virus-abgeleiteten Vektoren ohne Transfektionseffizienz zu beeinträchtigen. Damit ein Transgen Verabreichungssystem erfolgreich zu sein, muss die DNA Vektor, der die Ziel-Wirtszelle ein und das codierte Transgen (e) exprimieren. Es gibt mehrere zelluläre Barrieren, die vor allem in Säugersystemen in der Praxis überwunden werden müssen. Um den Abbau durch Nukleasen und Serumimmundetektion durch retikuloendothelialen System, das DNA-Vektor muss bio- und immun kompatibel sein mit dem Zielsystem zu vermeiden. Ungeschützte DNA wird schnell durch Plasma-Nukleasen verdautund die Plasmid-Membran besteht aus dichten Lipoprotein Barrieren besteht, so dass die DNA-Vektor schnell der Lage sein muss, die Plasmamembran von Zielzellen kreuzen. Einmal in der Zelle, Vektoren müssen das Zytoplasma durchqueren und die Kernmembran durchqueren den Kern für die Transgen-Expression einzugeben. Nicht-virale Techniken Genübertragung Fokus auf Verbesserung der Gewebe- und Zell-Targeting. Jedoch verringert die Verwendung von herkömmlichen Plasmiden mit diesen Techniken Transfektionseffizienz aufgrund des Vorhandenseins von immunogenen bakteriellen Sequenzen, die sich rasch Genexpression 1,2 verstummen. Herkömmliche Plasmide tragen typischerweise Antibiotika-Resistenzgene für die Wartung in prokaryotischen Systemen. Diese können jedoch mögliche schädliche Wirkungen auf menschliche Wirte produzieren oder Resistenz gegenüber natürlich vorkommenden Wirts Flora über den horizontalen Gentransfer Effekte verleihen. Herkömmliche Plasmiden auch Dinukleotid CpG - Motive 2, enthalten , die eine unerwünschte immunstimulierende Reaktion auslösen können, potenziellReduzierung oder Transgen-Expression zum Schweigen zu bringen. Da sie nur aus den eukaryotischen Expressionskassette enthalten sind, DNA minivectors, wie DNA - Miniringe 3 sind eine bessere Alternative für die Genabgabe wie sie extrazelluläre und intrazelluläre Bioverfügbarkeit und verbesserte Genexpression aufgrund ihrer verringerten Größe und Abwesenheit von immunstimulatorischen prokaryotischen Elemente verbessert aufweisen 4. Die reduzierten Vektorgröße Tarife besser in Bezug auf Beständigkeit gegen Scherkräfte , die mit in - vivo - Verabreichung an eine Zielstelle 5. Die höhere Kopienzahl des Vektors pro Masseneinheit erfordert weniger Transfektionsreagenz, wodurch die Toxizität verringert wird. Jedoch im Falle der Zufallsvektor Integration in ein Wirtschromosom, zirkular kovalent geschlossene (CCC) Vektoren, die sowohl DNA-Miniringe und konventionellen Plasmiden, molekulare Kontinuität verleihen und damit zu Insertionsmutagenese führen kann, was verheerende Folgen haben kann <sbis&gt; 6. Vergleichsweise, die Integration eines linearen DNA - Vektor , stört das Chromosom und initiiert Zelltod Wege, wodurch die mutierte Zelle aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen und Insertionsmutagenese 7 verhindert wird . Minimalistische immunologisch definierte Genexpression (MIDGE) Vektoren 8 und Mikro-linearen Vektoren 9 (MiLV) sind LCC DNA - Vektoren in vitro entwickelt. MIDGE - Vektoren wurden auf eine 17-fache verbessert Transgen - Expression in vivo zeigten sich im Vergleich zu herkömmlichen Plasmid - DNA - Vektoren 11 und haben vielversprechende Ergebnisse in Impfstoff 10 und Krebs 8 Gentherapie demonstriert. Darüber hinaus aufgrund der verwindungsfreie Struktur des LCC minivector weniger Transfektionsreagenz ist im Vergleich zu dem CCC supercoiled Gegenstück erforderlich, wodurch die Toxizität reduzieren 7. Unsere verbesserte LCC DNA-Vektoren, DNA-Ministrings haben überlegen Expressionseffizienz und bioavai demonstriertLabilität 7. Weiterhin DNA Ministrings auf einem einstufigen hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem produziert, eine zweckmäßige und kostengünstige Alternative zu MIDGE und MiLV LCC - Vektoren, die in vitro mehrere Schritte erfordern. Die DNA MiniString- Produktionssystem gezeigt werden , ist eine einfache hitzeinduzierbaren Verfahren in vivo durchgeführt wird , ist es sowohl kostengünstiger und leicht skalierbar macht. Dieses System nutzt die Yersinia enterocolitica Bakteriophagen PY54-derived Tel / pal protelomerase 12 Rekombinationssystem die minimal eukaryotischen Expressionskassette aus dem prokaryotischen Plasmidrückgrat zu trennen. Wir haben Escherichia coli - Zellen entwickelt (W3NN) Tel protelomerase unter der Kontrolle des hitzeinduzierbaren Bakteriophagen - λ - Promotor, cI [Ts] 857 13 auszudrücken. Bei der Expression wirkt Tel protelomerase auf pal Zielstellen , die innerhalb &quot;Super - Sequence&quot; (SS) Stellen auf dem Vorläufer Plasmid befindetLCC Produkte zu ergeben, aus dem das DNA MiniString- kann dann gereinigt werden (Figur 1). Die SS - Stellen auf der DNA MiniString- Vorläufer Plasmid codieren auch Zielstellen für andere Rekombinasen einschließlich Cre - Rekombinase (LOX), TelN protelomerase (telRL) und Flp - Rekombinase (FRT), wodurch die Herstellung von isogenen LCC und CCC minivectors von einem Vorläufer - Plasmid zu erleichtern. Zusätzlich wird jede SS Seite auf beiden Seiten von SV40 - Enhancer (SV40e) Sequenzen flankiert, die dazu dienen , 14 nukleäre Translokation zu verbessern. Wir haben an anderer Stelle gezeigt , dass sukzessive Zugabe von SV40e schrittweise Erhöhungen der Transfektionseffizienz 7 verleiht. Der Vorläufer - Plasmid (pDNA MiniString- oder PDMS) enthält einen Polylinker (Abbildung 1) Einführen eines beliebigen Gens von Interesse in transkriptionale Fusion mit dem grün fluoreszierenden Reporter (GFP) zu erleichtern. Die DNA-minivector Technologie kannanstelle von herkömmlichen Methoden für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen und Beurteilungen auf die Effizienz der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von &quot;Mini&quot; Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt-Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen-Transfer-Anwendung und bietet ein höheres Sicherheitsprofil.

<table><tbody><tr><td>E. coli W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>Stamm für die Ministring-Verarbeitung: Nafissi & Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>Parent Plasmid für die Ministring-Verarbeitung: auch als pDNA Ministring (pDMS) bezeichnet.BD</td></tr> <tr><td>Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broce</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>hochreines Milipore Wasser</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Modell: Mili-Q Advantage A10 OP-Handschuhe für das Wasseraufbereitungssystem</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petrischalen mit klarem Deckel mit erhöhtem Grat (100&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Reagenzgläser</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer Küvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Steril 15 ml Falcon Röhrchen</td> <td>&nbsp; BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr> <tr><td>sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen</td> <td>&nbsp; FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette (100-1.000&nbsp; &mu; l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette (20-200&nbsp; &mu; l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipettenspitzen (100-1.250&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipettenspitzen (1-200&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Brenner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td>New Brunswick Scientific &nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Erlenmeyerkolben (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Erlenmeyerkolben (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Erlenmeyerkolben (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Modell: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Bodenzentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>369001</td><td>Modell: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Modell: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analoger Vortex-Mischer&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA-Leiter</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

die produktion von doppelstrang-dna-ministrings

Production of Double-stranded DNA Ministrings

Wir konstruierten linearen kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors als nicht-virale alternative Gen-Delivery - Vektor über eine einfache Plattform in vivo produziert. DNA - Ministrings ein erhöhtes Sicherheitsprofil besitzen und auch DNA - Ladung gezielt Zellen effizient zu liefern. Herkömmliche DNA Vektoren tragen unerwünschte prokaryotische Sequenzen, einschließlich Antibiotika-Resistenzgene, CpG-Motiven und bakterielle Replikationsursprünge, die an der Stimulation der Wirtsimmunreaktionen führen können. Die Bioverfügbarkeit von herkömmlichen DNA-Vektoren wird auch aufgrund ihrer grßeren Molekülgrße kompromittiert. Ihr Kreis Natur kann auch chromosomale Integration vermitteln, zu Insertionsmutagenese führt. Bakterielle Sequenzen werden von DNA minivectors ausgeschnitten, nur das Gen von Interesse (GOI) und notwendige eukaryotischen Expressionselemente zu verlassen. Unsere LCC DNA minivectors oder DNA-Ministrings, sind frei von immunogenen bakteriellen Sequenzen; daher die Verbesserung der thEIR Bioverfügbarkeit und GOI Ausdruck. Im Falle der Vektor-Integration in das Chromosom wird das LCC DNA MiniString- letal das Wirtschromosom zu stören, wodurch die möglicherweise gefährliche Mutante aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen. Folglich bieten DNA-Ministrings die Vorteile von &#39;Minicircle-&#39; DNA, während das Potenzial für unerwünschte Vektorintegration Ereignisse zu beseitigen. Im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden und ihren isogenen Kreis kovalent geschlossene (CCC) Pendants zeigen DNA Ministrings überlegene Bioverfügbarkeit Transfektionseffizienz und cytoplasmatischen Kinetik - also sie geringere Mengen an kationischen Tensiden zur effektiven Transfektion von Zielzellen erforderlich ist. Wir haben ein Ein-Schritt - induzierbare in vivo - System für die Herstellung von DNA - Ministrings in Escherichia coli konstruiert , das einfach zu bedienen ist , schnelle und skalierbar.

Nach der DNA-Extraktion, wird Restvorläufer Plasmid, LCC prokaryotischen Rückgrat und die DNA MiniString- zurückgewonnen werden. Insgesamt Plasmid Ausbeute und Reinheit kann mit einem Spektralphotometer bewertet werden. Reinheit wird bei 260 nm und 280 nm (A260 / A280), wobei ein Verhältnis von 1,9-2,0 ist optimal mit dem Verhältnis der Absorption geschätzt. Alle LCC und CCC - Produkte können durch Agarose - Gelelektrophorese (AGE) (Abbildung 2) getrennt werden. AGE visualisiert die Ergebnisse der MiniString- Produktion nach der Wärmeinduktion, vor MiniString- Reinigung. Eine qualitative Bewertung der MiniString- Produktion kann durch den Vergleich Bandenintensität des MiniString- (2,4 kb) an die Mutter Plasmid (5,6 kb) (Abbildung 2) zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Ministring- DNA kann über Standard - Plasmid -Gelextraktions Protokolle folgende AGE zurückgewonnen werden. Abbildung 3 fasst MiniString- Produktionseffizienz unter verschiedenen Bedingungen wahrscheinlich auftreten , während carrying das Protokoll aus. MiniString- Produktionseffizienz wurde auf Basis von DNA-Bandenintensität bestimmt das Analyseprogramm des Herstellers mit. Jede ähnliche Densitometrie Programm kann verwendet werden, um die Ergebnisse von AGE zu analysieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Abb . 1: Übersicht über die MiniString- Produktion (A) Der Elternvektor enthält einen Polylinker in Transkriptions Fusion mit einem Reporter - Gen, eingerahmt von den beiden SS - Sites. Das Rückgrat kodiert Beta-Lactamase für Ampicillin - Resistenz und enthält auch mehrere Schnitt Websites einzigartig für das Rückgrat für die in vitro Verdauung. (B) Überblick über das Hauptprotokoll. Die Schritte 2) Wachstumsphase und 3) Ministring Produktion werden in einem Diagramm dargestellt auf eine schematische Gesamt der Schritte zur Verfügung zu stellen, die Einfachheit des Protokolls hervorheben. (C) Ministring Induktion. Wärmeinduktion inaktiviert die temperaturempfindlichen Repressor, so dass tel Ausdruck von Tel Aktivität auf SS - Sites in den übergeordneten Plasmide gefolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Abbildung 2: MiniString- Produktion nach Abweichungen vom Protokoll. 1: Kontrolle, 2: Nicht induzierte, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: frühzeitige Entfernung. DNA MiniString- ist etwa 2,4 kb, LCC Rückgrat 3 kb ist, und pNN9 Mutter Plasmid beträgt 5,6 kb. Band Intensität von MiniString- und LCC-Backbone Bänder fallen mit Abweichungen vom Protokoll, was auf niedrigere MiniString- Ausbeute. Von links nach rechts: 1 kb Leiter von New England Biolabs; Kontrolle, folgende Protokoll; Nicht induzierte, kein Hochschalttemperatur; Überwachsen, Temperatur upshift during stationäre Phase; Overinduced, erweiterter Temperaturhochschalten; Frühe Entfernung, kein Temperaturherunterschalten. Die Plasmide wurden extrahiert , um die Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini Kit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Abbildung 3:. Auswirkungen von Abweichungen vom Protokoll auf MiniString- Produktionseffizienz (PE) Die Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Versuchen. PE wird aus der relativen Bandenintensität gemessen mit AlphaImager HP nach AGE geschätzt. Die Abweichungen treten bei den folgenden Schritten: Kontrolle, folgende Protokoll; Nicht induzierte, kein Temperaturhochschalten bei Schritt 2; Überwachsen, Temperatur Hochschalt- begann während der stationären Phase in Schritt 1,6; Overinduced, erweiterter Temperaturhochschalten bei Schritt 2.3; Frühe Entfernung, Zellen entfernt und extrahiertohne Temperaturherunterschalten bei Schritt 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Der linear kovalent geschlossene (LCC) DNA-Minivektor (DNA-Ministring) ist ein nicht-viraler Gentransfervektor mit hoher Transfektionseffizienz und ist für jede DNA-Verabreichungsanwendung relevant. Das Produktionssystem ist einfach, schnell und in vivo skalierbar. Das folgende Protokoll enthält eine visuelle Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Herstellung von DNA-Ministrings.

Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, sichere, lineare, kovalent geschlossene DNA-Minivektoren oder DNA-Ministrings mithilfe eines einfachen, einstufigen Produktionssystems herzustellen. Daher kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Vektoren und der Genübertragung zu beantworten. Insbesondere, wie man sicherere und wirksamere Genübertragungsvektoren, sogenannte DNA-Ministrings, effizient herstellt.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein effizienter und einfacher, einkomponentiger in-vivo-Ansatz zur Herstellung von DNA-Ministrings ist. Zur Herstellung des Kulturmediums nach dem Ansetzen von 500 Millilitern LB, 600 Millilitern TB und LB-Agar für Platten jeweils 30 Minuten bei 121 Grad Celsius im Autoklaven sterilisieren. Nach dem Abkühlen jedes Medium mit Ampicillin unter Zusatz einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter versetzen.Flüssige Medien bei vier Grad Celsius lagern. Anschließend 15 bis 20 Milliliter LB-Agar plus Amp in sterile Petrischalen geben, nach dem Abkühlen verkehrt herum bei vier Grad Celsius lagern. W3NN-PDMS-Zellen auf LB-Agar plus Ampicillin ausstreichen und die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.Dann mit einer einzelnen Kolonie von der Strichplatte eine Übernachtkultur von W3NN PDMS ansetzen, indem fünf Milliliter LB plus Ampicillin inoculiert werden. Die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius und 230 bis 250 U/min inkubieren. In einem 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben 10 Milliliter LB plus Ampicillin mit 100 Mikroliter der W3NN PDMS-Übernachtkultur beimpfen, um eine Verdünnung von 1 zu 100 zu erhalten.Inkubieren Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius und 250 U/min, bis sie mit bloßem Auge trübe erscheint und die mittlere bis späte logarithmische Wachstumsphase erreicht hat. Übertragen Sie anschließend 1 Milliliter der Kultur in eine saubere Küvette. Stellen Sie dann mithilfe eines UV-Vis-Spektrophotometers mit einer Wellenlänge von 600 Nanometern und dem zur Kultivierung der Zellen verwendeten Medium den Blindwert ein, bevor Sie die Lichtabsorption der Kultur messen.Falls die Kultur den geeigneten OD noch nicht erreicht hat, stellen Sie sie zurück auf den Schüttler und überprüfen Sie alle halbe Stunde erneut. Sobald die Kultur die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht hat, überführen Sie sie in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten.Den klaren Überstand in einen geeigneten Bioabfallbehälter dekantieren und den Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen mit 100 Mikrolitern LB plus Amp resuspendieren. Um die Produktion von Ministrings zu induzieren, 20 Milliliter LB plus Amp in einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben geben und auf 42 Grad Celsius erwärmen. Den resuspendierten Pellet in das vorgewärmte Medium überführen und über der logarithmischen Wachstumsphase oder maximal eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius und 250 U/min inkubieren.Senken Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und lassen Sie die Kultur weitere 90 Minuten lang inkubieren. Anschließend senken Sie die Temperatur weiter auf 30 Grad Celsius ab und lassen die Kultur zwei Stunden lang bei 200 U/min schütteln. Um die Ministrings zu gewinnen, überführen Sie die Kultur in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Anschließend 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugieren und auf ein Pellet prüfen. Schließlich den Überstand dekantieren und ein kommerzielles Extraktions- und Endotoxin-Entfernungskit verwenden, um das Plasmid zu isolieren. Nach der DNA-Extraktion werden verbleibendes Präkursorplasmid, LCC-prokaryotischer Träger und die DNA-Ministring gewonnen und können mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt werden, wie hier dargestellt.Vor der Ministring-Reinigung kann an dieser Stelle eine qualitative Beurteilung der Ministring-Produktion durchgeführt werden, indem die Bandenintensität des Ministrings mit der des Elter-Plasmids verglichen wird. Diese Abbildung fasst die wahrscheinlichen Ministring-Produktionsausbeuten unter verschiedenen Bedingungen während der Durchführung des Protokolls zusammen. Die Ausbeute der Ministring-Produktion wurde anhand der DNA-Bandenintensität bestimmt.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung vollständig in weniger als acht Stunden abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, die richtigen Temperatursprünge einzuhalten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Agarose-Gelelektrophorese oder Endonukleaseverdau durchgeführt werden, um Ministrings zu isolieren oder die Produktionseffizienz zu überprüfen.Diese Technik kann die Genübertragung in eukaryotische Zellen erheblich verbessern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Produktion von DNA-Ministrings mithilfe unserer Produktionsplattform maximiert werden kann. Vergessen Sie nicht, dass UV-Beleuchtungsgeräte bei der Arbeit mit Äthidiumbromid äußerst gefährlich sein können und dass stets angemessene Sicherheitsausrüstung im Labor getragen werden sollte, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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