Bewertung der perigenital Sensitivität und Prostatic Mastzellaktivierung in einem Mausmodell der Neonatal Maternal Separation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen von Stress im frühen Leben auf das Urogenitalsystem zu bestimmen, indem die perigenitale mechanische Empfindlichkeit und die Mastzellaktivierung in der Prostata bei männlichen C 57 schwarzen sechs Mäusen gemessen werden, die einer neonatalen mütterlichen Trennung unterzogen wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine neonatale mütterliche Trennung bei Würfen von C 57 schwarzen Sechs-Maus-Jungtieren durchgeführt wird, um an 20 aufeinanderfolgenden Tagen Stress im frühen Leben zu induzieren. Der zweite Schritt besteht darin, die perigenitale mechanische Empfindlichkeit durch Auftragen einer Reihe von Von-Fre-Monofilamenten auf den perigenitalen Bereich zu messen.

Als nächstes wird die Färbung von angesäuertem Toluidinblau an Kryostatenschnitten der Prostata der Maus durchgeführt. Um die Aktivierung von Mastzellen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Trennung von Müttern bei Neugeborenen die perigenitale mechanische Empfindlichkeit und die Aktivierung der prothetischen Mastzellen erhöht, basierend auf unseren verhaltensbezogenen und histologischen Analysen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der experimentellen Autoimmunprostatitis besteht darin, dass sie die Stressbelastung während der frühen Entwicklung berücksichtigt, die die Symptomatik im späteren Leben auslöst, ähnlich wie bei Patienten mit chronischer Prostatitis. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der chronischen Beckenschmerzen zu beantworten, wie z. B. den Einfluss von Stress im frühen Leben auf das Verhalten, und histologische Beweise für veränderte Schmerzzustände liefern. Obwohl diese Methode Einblicke in die chronische Prostatitis geben kann, kann sie auch auf andere funktionelle Schmerzsyndrome wie interstitielle Zystitis, schmerzhaftes Blasensyndrom, Vulvodynie, Fibromyalgie oder Migräne angewendet werden.

Es kann sogar auf andere häufige psychische Begleiterkrankungen wie Angstzustände und Depressionen angewendet werden. Entfernen Sie die Hündin am Tag nach der Geburt aus dem Käfig und setzen Sie sie in einen sauberen Zweitbehälter. Reiben Sie eine Handvoll Einstreu zwischen sauberen, behandschuhten Händen, um den Duft des Heimkäfigs zu erhalten, und übertragen Sie dann eine Tiefe von ein bis zwei Zentimetern der Einstreu des Heimkäfigs in einen sauberen, entsprechend beschrifteten Zwei-Liter-Glaslautsprecher. Legen Sie außerdem bei etwa der Hälfte des zusätzlichen Anreicherungseinstreumaterials, das im Heimkäfig vorhanden ist, wie z. B. Nestlets oder Knisterpapier, einzeln an den Glaslautsprecher, alle Welpen aus einem einzigen Wurf in das vorbereitete Becherglas und stellen Sie das Becherglas sofort 180 Minuten lang bei 33 Grad Celsius und 50 % Luftfeuchtigkeit auf.

Während der getrennten Inkubationszeit nehmen Sie das Muttertier aus dem zweiten Behälter und setzen Sie es in den Heimkäfig zurück. Bringen Sie den Heimkäfig an seinen geeigneten Platz innerhalb des Vivariums zurück. Holen Sie am Ende der Trennungszeit den Heimkäfig zurück, entfernen Sie den Damm und setzen Sie ihn in einen sauberen Zweitbehälter.

Nehmen Sie dann den Becher aus dem Brutkasten und lassen Sie eine Handvoll Einstreu zwischen saubere, behandschuhte Hände fallen, um den Geruch des Heimkäfigs beim Umgang mit den Welpen zu erhalten. Bringen Sie die Welpen vorsichtig einzeln aus dem Becherglas in den Heimkäfig und bringen Sie alle im Becherglas verbliebenen Anreicherungen und Einstreu in den Heimkäfig zurück. Sobald alle Jungtiere zurückgebracht wurden, bringen Sie das Muttertier aus dem zweiten Behälter in den Heimkäfig und bringen Sie es an seinen geeigneten Wohnort im Vivarium zurück.

Wiederholen Sie diese gesamte Prozedur für jeden Wurf, der bis zum 21. Tag nach der Geburt täglich von der Mutter getrennt wird. Entwöhnen Sie dann die Jungtiere und bringen Sie sie während der gesamten Dauer des Experiments unter den gleichen Bedingungen wie die Kontrollmäuse unter. Bereiten Sie den Testbereich vor, indem Sie eine saugfähige Unterlage unter einen erhöhten Drahtgeflechttisch mit einer Höhe von 55 Zentimetern legen.

Der Tisch sollte genügend Platz bieten, damit sich der Untersucher von der Unterseite nähern kann, ohne die Mäuse zu erschrecken. Platzieren Sie bis zu 12 acht Wochen alte Mäuse einzeln unter durchsichtigen, perforierten Kunststoffkammern auf dem Drahtgittertisch. Lege einen schweren Gegenstand auf die Kammern, um zu verhindern, dass die Mäuse entkommen.

Halten Sie die Basis eines Dreipunkt-22-Gramm-Rahmen-Monofils fest und legen Sie das eingefahrene Monofilament frei. Positionieren Sie die Sonde so, dass das Monofilament vertikal ausgerichtet ist. Wenn die Maus wach und unbeweglich ist, wird ihr Körpergewicht gleichmäßig auf die Hinterpfoten verteilt.

Tragen Sie es entweder auf die linke oder rechte Seite des Hodensacks auf und vermeiden Sie dabei die Mittellinie, bis eine leichte Biegung des Filaments beobachtet wird. Halten Sie das Monofilament 10 Sekunden lang an Ort und Stelle oder bis das Tier eine positive Reaktion zeigt, wie z. B. ein lebhaftes Rucken oder Springen oder ein Lecken- oder Beißverhalten, das auf das Monofilament gerichtet ist. Wenn sich eine Maus während der zehnsekündigen Monofilament-Anwendung weder bewegt noch positive Reaktionen zeigt, zeichnen Sie einen negativen Antworttest auf, testen Sie alle Mäuse mit dem gleichen Filament und wechseln Sie dann zum nächsten geeigneten Monofilament.

Testen Sie jede Maus mit dem nächstgrößeren oder kleineren Monofilament für weitere vier Anwendungen. Nachdem die erste positive Reaktion beobachtet wurde, wird fixiertes Prostatagewebe von neun Wochen alten Mäusen in sieben Mikrometer dicke Kryoschnitte präpariert und dann in Kryoschnitte geschnitten. Bereiten Sie als Nächstes eine 1%ige Toluidinblau-Stammlösung vor, indem Sie ein Gramm Toluidinblau O zu 100 Millilitern 70%igem Ethanol hinzufügen und die Mischung so lange wirbeln, bis sie in Lösung geht.

Lagern Sie die Stammlösung bis zu drei Wochen bei Raumtemperatur. Geben Sie in einem anderen Becherglas ein Gramm Natriumchlorid in 100 Milliliter Wasser und geben Sie es auf eine Rührplatte. Den pH-Wert der Salzlösung mit 12 molarer Salzsäure einstellen, bis ein pH-Bereich von 0,5 bis 1,0 erreicht ist.

Bereiten Sie dann eine 0,25%ige angesäuerte Toinblau-Arbeitslösung vor, indem Sie acht Milliliter der Udineblau-Stammlösung und 32 Milliliter der sauren 1%igen Natriumchloridlösung kombinieren. Spritzen Sie es auf und ab, um eine vollständige Einarbeitung der odblauen Stammlösung zu gewährleisten, und mischen Sie die Arbeitslösung mit einem Wirbel frisch für jede Charge Objektträger. Waschen Sie die Gewebeschnitte, indem Sie die Objektträger einzeln etwa eine Sekunde lang in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen tauchen, das ein ausreichendes Volumen an PBS enthält, um das Gewebe vollständig einzutauchen.

Lassen Sie die Objektträger auf einem Papiertuch an der Luft trocknen. Legen Sie als nächstes Objektträger in ein stehendes Glasgefäß, das genügend der 0,25%igen Toluidinblau-Arbeitslösung enthält, um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte vollständig untergetaucht werden. Inkubieren Sie die Rutschen 10 bis 15 Minuten lang, während Sie sich auf einer Plattformwippe mit 15 U/min befinden.

Tauchen Sie dann die Objektträger etwa eine Sekunde lang in PBS, um überschüssiges hohes Udinblau auszuwaschen, und legen Sie die Objektträger so in eine Objektträgerbox, dass die Objektträger auf der Seite liegen. Um eine Drainage zu ermöglichen. Trocknen Sie die Objektträger mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei Raumtemperatur.

Tauchen Sie die Objektträger nach dem Trocknen etwa eine Sekunde lang in 95%iges Ethanol und lassen Sie den Abschnitt dann vollständig trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein- bis 10 Mal, bis das Gewebe mehr blau als violett trocknet. Tauchen Sie die Objektträger anschließend etwa eine Sekunde lang in 100%iges Ethanol und lassen Sie den Abschnitt vollständig trocknen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang ein- bis 10 Mal, bis das Gewebe dunkel- bis mittelblau, aber nicht violett ist. Zum Schluss fixieren Sie den Fleck, indem Sie die Objektträger drei Minuten lang in 100%igem Xylol inkubieren. Lassen Sie sie trocknen und decken Sie sie dann ab, schieben Sie die Objektträger mit Glycerin PPS oder einem permanenten Eindeckmedium auf Xylolbasis auf.

Lassen Sie überschüssige Medien ab, und lagern Sie die fertigen Objektträger bei Raumtemperatur. Bei Tests mit einer abgestuften Serie von Von-Frame-Monofilamenten, einer acht Wochen alten mütterlichen Trennung von Neugeborenen, zeigten Mäuse im Vergleich zu naiven Artgenossen eine perigenitale mechanische Allodynie. Dies zeigt sich in einer signifikanten Verringerung der mechanischen Entzugsschwelle, die eine positive Verhaltensreaktion hervorrief.

Weitere Hinweise auf eine chronische Prostatitis, ein chronisches Beckenschmerzsyndrom, sind histologisch gezeigt: Hier sind Kryostatenschnitte von Prostatageweben, die mit angesäuertem O Toluidin blau gefärbt wurden, um Tryptase-Granula zu beobachten, die in Mastzellen untergebracht sind. Ein signifikant höherer Prozentsatz an degranulierten Mastzellen wurde in Prostataschnitten von neonatalen Trennmäusen beobachtet. Im Vergleich zu naiven Mäusen Bei der Trennung der Mutter bei Neugeborenen ist es wichtig, daran zu denken, den Geruch des Käfigs zu Hause zu erhalten, um eine Abstoßung der Welpen durch das Muttertier zu vermeiden.

Andere Methoden wie Freilandtests oder eine Zwei-Auswahl-Flüssigkeitspräferenz können verwendet werden, um Verhaltensnachweise für komorbide Stimmungsstörungen zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die perigenitale mechanische Empfindlichkeit und die Aktivierung der Prostatamastzellen als verhaltensbezogener und histologischer Beweis für chronische Prostatitis und Mäuse nach neonataler mütterlicher Trennung beurteilt werden können.