Name: Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Lernen Sie die Generierung von Prostatakrebs-Patienten-Xenografts aus zirkulierenden Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die molekulare Charakterisierung und Entwicklung neuer Biomarker.

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Wir danken Dr. Jordi Ochando von den gemeinsamen Ressourcen für Durchflusszytometrie am Mount Sinai Medical Center für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie-Analyse. Wir danken Dr. Rumana Huq von der Microscopy Shared Resource Facility am Mount Sinai Medical Center für ihre Unterstützung bei der Bildgebung. Die Autoren danken der TJ Martell Foundation für ihre Unterstützung bei diesem Projekt.

Dieses Protokoll wurde an unserer Hochschule mit Genehmigung durch die institutionellen Forschungsethikkommission durchgeführt und ist in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das menschliche Wohlergehen. 1. Erhebung der peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs Hinweis: Wählen Sie Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs. Eine schriftliche Einwilligung des Patienten und notieren klinischen Merkmale der Patienten, einschließlich Alter, in Isolation und vorherige Chemotherapie und Hormonbehandlungen. Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs wird potenziell höchste Konzentration von CTCs im peripheren Blut. <ol><li> Sammeln von Blutproben nach der informierten Einwilligung und unter einer geeigneten Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Latexhandschuhe und Laborkittel während des gesamten Verfahrens zu tragen. </li><li> Schließen Sie 25 G Butterfly-Nadel und Schlauch mit Nadelhalter. Verwenden Sie einen Alkoholtupfer zur Reinigung BereichAntekubitalvene zwischen Bizeps und Unterarm, dann gelten Tourniquet um Patienten Oberarm. </li><li> Legen Schmetterling Nadel in Antekubitalvene und schieben Blutentnahmeröhrchen in die Nadelhalter zur Sammlung zu beginnen. Sammeln ca. 10 ml Blut in Blutentnahmeröhrchen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um ein Gerinnen zu verhindern, enthalten. </li><li> Entfernen Schmetterlingsnadel von Patient und Druck mit steriler Gaze über Ort der Venenpunktion für 1 min. Abdeckung Seite mit einem sterilen Verband. </li></ol> 2. Isolierung von mononukleären Zellen Anmerkung: Die in Schritt 1 gesammelten Blut werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) (zB Lymphozyten und Monozyten) zusätzlich zu den mononukleären CTCs enthalten. <ol><li> Pipette Vollblut in 50 ml konischen Röhrchen Polystyrol mit einer 5 ml serologische Pipette und fügen Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in einem Verhältnis 1: 1. Gently Pipette Mischung zu homogenisieren. </li><li> 15 ml eines kommerziell hergestellten Lösung (Ficoll-Paque), um Blutkomponenten durch niedrige Geschwindigkeit Dichtegradientenzentrifugation getrennt in einen leeren 50 ml konischen Röhrchen Polystyrol. </li><li> Pipette vorsichtig Vollblut und HBSS Mischung aus Schritt 2.1, in die Polystyrol-Röhrchen aus Schritt 2.2, um unterschiedliche obere Schicht zu bilden. Set Pipette auf niedrigste Einstellung zu minimieren Durchmischung von Lösungen, wird dies zu gewährleisten effiziente Trennung. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei RT (25 ° C). Stellen Verzögerung auf niedrigste Einstellung Mischung von Lösungen nach der Trennung zu verhindern. Beschleunigung kann auf jede Geschwindigkeit eingestellt werden. </li><li> Nach dem Zentrifugieren identifizieren den dünnen weißgrauen Streifen von PBMCs und CTCs klemmt Schicht zwischen Plasma auf der Oberseite und Trennlösung am Boden des Röhrchens. </li><li> Sammeln Sie die Zellen von der weiß-grauen Streifen in Schritt 2.5 in ein 50 ml Polystyrolröhrchen mit einem Kunststofftransferpipette. </li><li> In HBSS auf 50 ml konischen Röhrchen Polystyrol mit PBMCs und CTCs und centrifuge wieder bei 400 × g für 10 min RT zu waschen. </li><li> Dekantier-Flüssigkeit und Pellet in 50 ml HBSS und Zentrifuge wieder bei 400 × g für 3 min bei RT waschen. </li><li> Überstand verwerfen, resuspendieren verbleibende Pellet mit 5 ml Lyse der roten Blutkörperchen Puffer und Inkubation der Lösung für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen der roten Blutkörperchen Lysepuffer durch Zentrifugation bei 400 × g für 3 min bei RT. </li><li> Der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml PBS 1x mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt werden, um vor der Antikörperfärbung blockieren. </li></ol> 3. Die Färbung mononukleären Zellen mit CD45-FITC Antikörper für Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Quantifizierung der Zahl der lebensfähigen (Trypanblau-negative Zellen) (aus Schritt 2.11) mit einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler. Bereiten Sie eine 1 x 10 6 Zellen / ml Suspension (in PBS 1x mit 10% FBS) und legen Sie sie auf Eis für 1 Stunde. </li><li> Verteilen Sie die quantifiziertZellsuspension aus dem vorherigen Schritt in zwei Röhrchen. Label Rohre als Kontrolle und CD45-Färbung. </li><li> In dem Steuerrohr, fügen IgG1κ-FITC (2,5 ug / ml) in einer Verdünnung von 1: 250. In der CD45-Färbung Rohr, fügen CD45 FITC (2,5 ug / ml) konjugierte primäre Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 250 und Inkubation der Zellsuspensionen auf Eis für 30 min. CD45-Antigen Kennzeichnung wird verwendet, um hämatopoetische Zellen auszuschließen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 × g für 3 min bei 4 ° C, und den Überstand verwerfen. </li><li> Zweimaliges Waschen der Zellen durch Suspendieren jedes Pellet mit sterilem 1 x PBS, ergänzt mit 10% FBS, gefolgt von Zentrifugation bei 400 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einer 1 ml Lösung von PBS 1x enthaltend 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Konzentration von 10 ug / ml. </li><li> Filtern Sie die endgültige Lösung durch 35 &amp; mgr; m Sieb Kappen in 12 mm x 75 mm Polystyrolröhrchen. </li></ol> 4. Isolierung von Prostata CTCs durchFACS Hinweis: Nutzen Sie eine Durchflusszytometer, um Live-CD45 negativen CTCs zu sammeln. <ol><li> Stellen Kompensationssteuerungen unter Verwendung von Zellen aus dem Röhrchen beschriftet, &quot;Control&quot;. </li><li> Erstellen Tore, die Trümmer und Cluster von Zellen unter Verwendung von geeigneten Vorwärtsstreu und Seitenstreuparameter aus. </li><li> Stellen Sie die FITC-Gates mit den Zellsuspensionen aus dem Röhrchen markiertem &quot;CD45-FITC.&quot; </li><li> Tor lebensfähigen (DAPI-negative) Zellen unter Verwendung des Pacific Blue-A-Kanal. </li><li> Sammeln CD45 negativen Population in einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen Polystyrol, das 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 10% FBS ergänzt. </li><li> Zentrifuge nach der Prostatatumorzellsuspension bei 400 × g für 3 min, dann Resuspendieren des Pellets in 200 bis 500 ul RPMI, supplementiert mit 10% FBS. </li></ol> 5. Die Injektion von CTCs in Mäusen und Überwachung von Xenograft Wachstum Hinweis:Führen Sie alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care Committee genehmigt. Dieses Protokoll wurde an unserem Institut wurde im Rahmen eines spezifischen Tier Verwenden Protokolls durch unsere Animal Care Committee in Übereinstimmung und Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Agenturen, Vorschriften und Richtlinien zugelassen durchgeführt. <ol><li> Mischen Sie die sortiert Prostatatumorzellsuspension mit der extrazellulären Matrix in einem Verhältnis 1: 1 und auf Eis. </li><li> Betäuben Maus vor subkutaner Implantation in einer Kammer, Zuführen von 5% (v / v) inhalierten Isofluran in 1 l / min Sauerstoff. Eine angemessene Betäubung, indem für den Verlust der Hornhaut und Zehenreflex in der Maus. </li><li> Verwendung einer 25 G-Nadel und einer 1 ml Spritze, Injizieren 250 ul Prostatatumorzellen und extrazellulärer Matrix Zellsuspension subkutan in beide oberen Flanken einer 8-10 Wochen alten männlichen immundefizienten Maus. Volumina von 250 ul unabhängig von CTC-Konzentration als das Injektionsvolumen ist das important Wert. Maximale SQ Verwaltung in der Maus nicht mehr als 1 ml. &#160;</li><li> Überwachen Mäusen durch Ausführen wöchentliche Palpation der Maus Injektionsstellen für das Wachstum von subkutanen noduläre Dichten und durch Messen Mäusen Gewicht zweimal pro Woche. </li><li> Euthanize Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid, gefolgt durch Genickbruch und der Ernte subkutanen menschlichen Prostatakrebs-Xenotransplantaten, wenn die Tumorgröße mehr als 0,5 cm und weniger als 1 cm größter Durchmesser ausreichend Tumorgewebe für molekularbiologische Untersuchungen und die serielle Passage zu gewährleisten. Euthanize Mäusen mit Anzeichen von Leiden oder Gewichtsverlust von 15%, obwohl keine Tumor ist spürbar. </li></ol>

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<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Prostatakrebs PDX Modelle CTCs. Die Verwendung von CTCs zur Erzeugung von PDX Modelle hat mehrere wichtige potenzielle Vorteile gegenüber bestehenden Verfahren. Zuerst zugängliche Sammlung von CTCs aus dem peripheren Blut ermöglicht die Erzeugung von experimentellen Modellen des gleichen Patienten in verschiedenen Krankheitsstadien. Zweitens stellt der Blutentnahme eine sicherere und kostengünstiges Verfahren, um Tumorzellen zu isolieren, we...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patienten abgeleitet Xenotransplantate werden immer beliebter experimentelle Modelle für die Krebsforschung eingesetzt. Sie können für die Charakterisierung von Biomarkern und biologische Pfade, präklinische Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten, und die Schaffung von Avataren für personalisierte Krebstherapien 1,2 verwendet werden. Zuvor haben andere Forschungsgruppen PDX-Modelle entweder durch Implantation oder Injektion von einzelnen Tumorzellsuspensionen oder ganze Tumor Explantate in immungeschwächten Mäusen 1 entwickelt. Diese PDX Modelle erfordern chirurgische Sammlung von frischen soliden Tumor, malignen Aszites oder Pleuraerguss von einem Patienten, der sich einem chirurgischen Eingriff, die sowohl teuer ist und setzt den Patienten einem erhöhten Risiko der iatrogenen Morbidität. Eine signifikante neue Entwicklung in der Krebsforschung ist die Detektion, Lokalisierung und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen. Diese Tumorzellen zu entkommen aus dem primären Tumormasse und geben Zirkulationwo sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung und Rückfall, ist die häufigste Ursache von Krebs bedingte Sterblichkeit 3. Die Auswertung und Charakterisierung von CTCs aus verschiedenen soliden Tumorarten haben klinische Informationen für die Diagnose, Prognose und Überwachung von Resterkrankung 3 zur Verfügung gestellt. Eine Vielzahl von derzeit verwendeten Ansätze sich auf entweder die physikalischen Eigenschaften, die Expression von Biomarkern oder Gebrauchseigenschaften CTCs kann verwendet werden, um effizient zu isolieren CTCs 4 werden. Bestehende Makro CTC Isolationsverfahren beinhalten Dichtegradientenzentrifugation, körperliche Filtration mit Filterporen und Trennung gegen Oberflächenmoleküle. Die am weitesten verbreitete CTC Isolierung Methoden werden auf Antikörper-basierte Erfassung von CTC basiert. Sowohl positive als auch negative Selektion von Zelloberflächenmarkern verwendet werden, um CTCs aus peripherem Blut zu isolieren. Positive Selektion für CTCs im peripheren Kreislauf verwendet allgemein epithelialen Marker (zB EpCAM), die einewieder auf CTCs aber nicht hämatopoetischen Zellen exprimiert. Der Nachteil dieser Methode ist, dass CTCs mit metastatischem Potenzial oft epithelial-to-mesenchymale Transition (EMT), die Epitheloberfläche Marker 3 downregulates zogen. Um CTCs mit metastatischen Potential zu isolieren, eine negative Selektionsmethode, die den blutbildenden Oberflächenmarker CD45 verwendet, um zum Abbau der normalen Zellpopulation von Leukozyten verwendet werden 5. Prostatakrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebs und eine Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Männern 6. Die Mechanismen der Tumorprogression und Aggressivität sind nicht vollständig verstanden, und deshalb die Erzeugung und Charakterisierung von experimentellen Modellen, die die molekulare Heterogenität von Prostatakrebs rekapitulieren sind von großem Interesse. PDX Modelle von Prostatakrebs wurden vorher durch Verpflanzung von menschlichen Prostatakrebszellen erzeugten immunocomversprach Mäusen 7,8. Jedoch ist die Erzeugung solcher Modelle ist durch die geringe Transplantationsrate von Prostatakrebs in immungeschwächten Mäusen, die im Wesentlichen auf die träge Art der Krankheit zurückzuführen ist behindert. Kurzem CTCs wurden verwendet, um Brustkrebs 9, Lungenkrebs und Prostatakrebs 10 11 PDX Modelle zu erzeugen. Diese Proof-of-Concept-Studien wurde die Möglichkeit eingeführt PDX-Modelle unabhängig von der Notwendigkeit eines chirurgischen Probensammlung zu erzeugen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail ein Verfahren zur Erzeugung dieser neuartigen experimentellen Modell.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 & Mikro; m Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen aus Polystyrol</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Röhrchen aus Polystyrol mit Kappe für das Zellsieb</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>BD Vacutainer Lavendel Blutentnahmeröhrchen mit EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Winged Blutentnahmeset mit Druckknopf Rückzugsnadel 23 Gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Einweg-Nadelhalter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Latex-Tourniquet-Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aus Latex oder latexfreie Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 Wattepads Mullbinden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pflaster</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G Nadel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation von prostatakrebs-patienten gewonnen xenograft-modelle von zirkulierenden tumorzellen

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) Modelle werden in der Krebsforschung immer beliebter und werden für die präklinische Arzneimittelbewertung, die Identifizierung von Biomarkern, biologische Studien und personalisierte Medizinstrategien verwendet. Zirkulierende Tumorzellen (CTC) spielen eine entscheidende Rolle bei der Tumormetastasierung und wurden von Patienten mit mehreren Tumorarten isoliert. In jüngster Zeit wurden CTCs verwendet, um PDX-Versuchsmodelle für Brust- und Prostatakrebs zu erstellen. Dieses Manuskript beschreibt die von unserer Gruppe entwickelte Methode zur Generierung von PDX-Modellen für Prostatakrebs aus CTCs. Zu den Vorteilen dieser Methode gegenüber herkömmlichen PDX-Modellen gehören die Unabhängigkeit von der chirurgischen Probenentnahme und die Generierung experimenteller Modelle in verschiedenen Krankheitsstadien. Die Dichtegradientenzentrifugation, gefolgt von der Lyse roter Blutkörperchen und der Durchflusszytometrie-Depletion von CD45-positiven mononukleären Zellen, wird verwendet, um CTCs aus peripheren Blutproben von Patienten mit metastasierender Erkrankung anzureichern. Die CTCs werden dann immungeschwächten Mäusen injiziert; Nachträglich erzeugte Xenotransplantate können für funktionelle Studien verwendet oder für die molekulare Charakterisierung geerntet werden. Die Haupteinschränkung dieser Methode ist die negative Auswahlmethode, die für die CTC-Anreicherung verwendet wird. Trotz dieser Einschränkung stellt die Generierung von PDX-Modellen aus CTCs ein neuartiges experimentelles Modell dar, das in der Prostatakrebsforschung eingesetzt werden kann.

Dieses Protokoll wird auf die Erzeugung von PDX-Modelle von isolierten CD45 negativen Prostatakrebs CTCs führen. Basierend auf der in unserem Protokoll verwendeten negativen Selektionsverfahrens ist es notwendig, um tote Zellen auszuschließen unter Verwendung von DAPI-Färbung. Der Prozentsatz von CD45-negativen Zellen durchflusszytometrisch erfasst ist variabel und hängt von der Tumorbelastung des Patienten (1A). Immunfluoreszenzfärbung von unsortierten Zellen mit CD45 und DAPI (Zellkerne identifiziert)...

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, die zur Erzeugung von von Prostatakrebspatienten abgeleiteten Xenotransplantaten (PDXs) aus zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) verwendet wird. Die Generierung von PDX-Modellen aus CTCs bietet ein alternatives experimentelles Modell zur Untersuchung von Prostatakrebs; Der am häufigsten diagnostizierte Tumor und eine häufige Todesursache durch Krebs bei Männern.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Protokolls besteht darin, ein Prostatakarzinom-Patienten-abgeleitetes Xenotransplantat aus zirkulierenden Tumorzellen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst peripheres Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakarzinom gesammelt wird.Im zweiten Schritt wird der mononukleäre Zellkompartiment aus dem Blut isoliert, der die zirkulierenden Tumorzellen enth&auml;lt. Anschlie&szlig;end werden die mononukle&auml;ren Zellen mit einem CD45-ZI-Antik&ouml;rper markiert. Um die zirkulierenden Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie auszuw&auml;hlen, werden die Zellen danach in immundefiziente M&auml;use injiziert. Die Ergebnisse zeigen die Erzeugung von Prostatakarzinom-Xenotransplantaten auf Grundlage der Injektion zirkulierender Tumorzellen, die mittels Durchflusszytometrie aus dem peripheren Blut von Prostatakrebspatienten isoliert wurden.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Prostatakrebsforschung zu beantworten, indem neue experimentelle Modelle erzeugt werden, die für die molekulare Charakterisierung des Prostatakarzinoms und die Entwicklung neuer Biomarker verwendet werden können. Die Demonstration des Verfahrens wird Williams, ein Student aus dem Labor, und Omada, eine Forscherin aus der Onkologieabteilung hier am Mount Sinai, durchführen. Zunächst wird Vollblut von ausgewählten Patienten mit metastasierendem Prostatakarzinom gesammelt, da diese eine hohe Anzahl zirkulierender Tumorzellen im peripheren Blut aufweisen können. Unter Verwendung einer 10 Milliliter-Serologischen Pipette wird das Vollblut zusammen mit Hank's Balanced Salt Solution in ein 50 Milliliter-Polystyrol-Konischgefäß überführt.Im Verhältnis eins zu eins vorsichtig pipettieren, um die Mischung zu homogenisieren. Als Nächstes 15 Milliliter einer FI-Call-Pack-Lösung in ein leeres 50-Milliliter-Polystyrol-Kegelrohr geben. Vorsichtig 20 Milliliter des verdünnten Vollbluts auf die Oberfläche der Lösung pipettieren, dabei die niedrigste Einstellung verwenden, um eine deutliche obere Schicht zu bilden.Anschließend die Probe bei 400 Gs 30 Minuten lang zentrifugieren. Die Zentrifugation bei Raumtemperatur durchführen und die Verzögerung der Zentrifuge auf die niedrigste Stufe einstellen, um ein Vermischen der Lösungen nach der Trennung zu verhindern. Nach der Zentrifugation den dünnen, weißen bis grauen Streifen der peripheren mononukleären Blutzellen und zirkulierenden Tumorzellen identifizieren, der sich zwischen der oberen Plasmaschicht und der Trennlösung befindet.Am Boden des Röhrchens sorgfältig die Zellen aus dem weißgrauen Streifen sammeln und in ein 50-Milliliter-Polystyrolröhrchen überführen. Mit einer Plastik-Transferpipette anschließend Hank's Balanced Salt Solution zu den isolierten Zellen hinzufügen, bis ein Gesamtvolumen von 10 Milliliter erreicht ist.Zentrifugieren Sie die Mischung erneut bei 400 Gs für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Zellen zu waschen, entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.Nach der zweiten Waschung wird das Überstand entfernt. Den verbleibenden Pellet in fünf Milliliter Puffer zur Lyse der roten Blutkörperchen suspendieren und die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Probe bei 400 Gs drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Lysepuffer durch Entsorgen des Überstandes entfernen.Resuspendieren Sie das Pellet schließlich in einem Milliliter PBS, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, vor der Färbung. Quantifizieren Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mithilfe der standardmäßigen Trypanblau-Ausschlussmethode an einem Hämozytometer oder automatischen Zellzähler. Verdünnen Sie die Zellen anschließend auf eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter in PBS mit 10 % FBS und stellen Sie sie eine Stunde lang auf Eis.Um unspezifische Bindung zu blockieren, verteilen Sie die Zellsuspension auf zwei separate Röhrchen. Beschriften Sie ein Röhrchen für Kontrollzellen und ein weiteres für CD45-Färbungszellen im Kontrollröhrchen. Geben Sie IgG one Kappa Zi in einer Verdünnung von 1 zu 250 hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen.Im CD45-Färberöhrchen CD45-ZI-konjugiertes Primärantikörper in derselben Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen und die Zellsuspensionen 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Anschließend die Zellen bei 400 × g drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und danach den Überstand verwerfen.Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie jedes Pellet in sterilem PBS, ergänzt mit 10 % FBS, resuspendieren und anschließend bei vier Grad Celsius für drei Minuten bei 400 G zentrifugieren. Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Zellen in einer Lösung von einem Milliliter PBS, die 10 Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Färbemittel enthält. Filtern Sie die endgültige Lösung durch 35-Mikrometer-Filterkappen in Polystyrolröhrchen mit den Maßen 12 Millimeter mal 75 Millimeter, um Zellklumpen oder Debris auszuschließen.Schließen Sie anschließend die CD45-positiven Zellen und tote Zellen aus der Suspension mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung aus, um sie wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben zu entfernen. Mischen Sie die sortierte Prostatatumorzellsuspension im Verhältnis 1:1 mit extrazellulären Matrixproteinen und stellen Sie die Mischung auf Eis. Betäuben Sie danach eine acht bis zehn Wochen alte männliche immundefiziente Maus gemäß den institutionellen Richtlinien mit 5 % inhaliertem Isofluran in einem Sauerstoffstrom von einem Liter pro Minute.Stellen Sie eine geeignete Anästhesie sicher, indem Sie beim Maus das Fehlen des Hornhaut- und Zehenreflexes überprüfen. Ziehen Sie 250 Mikroliter der Zellsuspension mit einer 25-Gauge-Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze auf. Injizieren Sie dann das gesamte Volumen der extrazellulären Matrix-Zellsuspension subkutan in beide obere Flanken der Maus. Überwachen Sie Tumore durch wöchentliches Abtasten der Injektionsstellen an der Maus auf das Wachstum subkutaner knotiger Verdichtungen.Aufgrund der in diesem Protokoll verwendeten Negativselektionsmethode ist es notwendig, tote Zellen mithilfe der DAPI-Färbung auszuschließen. Wie hier gezeigt, variiert der Prozentsatz der CD45-negativen Zellen innerhalb der verbleibenden vitalen Zellen und hängt von der Tumorbürde des Patienten ab, lässt sich jedoch leicht von den CD45-positiven Zellen abgrenzen. Bei korrekter Gating-Strategie werden nach Implantation der Prostatatumorzellsuspension subkutane knotige Dichten an beiden Flanken der Maus sichtbar.Jede knotige Dichte stellt ein Xenotransplantatwachstum dar und kann als von gesundem Gewebe unterscheidbar wahrgenommen werden, da es aus der dorsalen Muskulatur der Maus hervorsteht und eine festere Konsistenz aufweist. Vom Patienten stammende Xenotransplantatmodelle, die aus zirkulierenden Tumorzellen erzeugt wurden, bilden menschliche Prostatatumore nach, wie durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung sowie durch immunhistochemische Nachweise prostataspezifischer zellulärer Marker wie dem Androgenrezeptor und dem prostataspezifischen Membranantigen zu sehen ist. Nach der Erzeugung der Xenotransplantate können weitere Protokolle wie die Profilierung der Gen- oder Proteinexpression durchgeführt werden, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zur Aggressivität des Prostatakarzinoms beitragen.

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Research

Forschung

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Medicine

Medizin

Wir beschreiben die Herstellung von Druckhormonpellets sowie subkutane chirurgischen Implantation in Mäuse. Diese Strategie kann mit dem Wachstum von Zellen und Geweben Xenotransplantate unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen ohne Thymus hormonelle Regulation der Karzinogenese und der gutartigen Prostatawachstum zu beurteilen kombiniert werden.

Nierenkapsel Xenografting und subkutane Implantation Pellet für die Beurteilung von Prostata-Karzinogenese und benigne Prostatahyperplasie

Prostatakrebs ist die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache in den Vereinigten Staaten. Ein orthotopes Krebsmodell bietet einen nützlichen Ansatz, um die Biologie des Prostatakarzinoms zu verstehen und die Wirksamkeit von Therapieschemata zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt detaillierte Schritte, die zur Etablierung eines orthotopen Prostatakrebs-Mausmodells erforderlich sind.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

Das Ziel dieses Protokolls ist die Intra-Prostata Injektion von Prostata-Krebszellen, mit anschließenden Kastration zu demonstrieren. Orthotopen präklinische Modellen von Androgen-abhängigen und Kastration-resistenten Prostatakrebs sind entscheidend für die Krankheit im Zusammenhang mit einer klinisch relevanten Tumor Mikroumgebung und einem immunkompetenten Wirt zu studieren.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von orthotopischen Xenograft-Modellen durch intravesische Instillation hochwertiger urotheliaaler Zellkarzinomzellen oder intrarekt injizierende Darmkrebszellen in nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID) Mäuse für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von Lymphknoten-Stromalzellen, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen imitieren.

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Die Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erstellung eines minimalinvasiven orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodells durch ultraschallgesteuerte Injektion menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und die anschließende Überwachung des Tumorwachstums in vivo durch Ultraschallbildgebung.

Generierung eines orthotopen Xenografts von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen durch ultraschallgeführte Injektion

Die Heterogenität des Prostatakarzinoms und die Resistenz gegen die Behandlung bleiben Herausforderungen. Wir beschreiben ein Protokoll zur Generierung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die wichtige elterliche Tumoreigenschaften erhalten. Dieses standardisierte Modell unterstützt das Wirkstoffscreening und die Weiterentwicklung der Präzisionsmedizin.

Etablierung und Pflege von patienteneigenen Prostatakrebs-Organoiden: Ein detailliertes experimentelles Protokoll

Lernen Sie die Generierung von Prostatakrebs-Patienten-Xenografts aus zirkulierenden Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die molekulare Charakterisierung und Entwicklung neuer Biomarker.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

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