Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, die zur Erzeugung von von Prostatakrebspatienten abgeleiteten Xenotransplantaten (PDXs) aus zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) verwendet wird. Die Generierung von PDX-Modellen aus CTCs bietet ein alternatives experimentelles Modell zur Untersuchung von Prostatakrebs; Der am häufigsten diagnostizierte Tumor und eine häufige Todesursache durch Krebs bei Männern.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Protokolls ist die Entstehung von Prostatakrebs. Der Patient erhielt ein Xenotransplantat aus zirkulierenden Tumorzellen. Dies wird erreicht, indem zunächst peripheres Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs entnommen wird.

In einem zweiten Schritt wird das mononukleäre Zellkompartiment des Blutes isoliert, in dem sich die zirkulierenden Tumorzellen befinden. Anschließend werden die mononukleären Zellen mit einem CD 45 ZI-Antikörper gefärbt. Um die zirkulierenden Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie auszuwählen, werden die Zellen anschließend in immungeschwächte Mäuse injiziert. Die Ergebnisse zeigen die Generierung von Prostatakrebs-Xenotransplantaten auf der Grundlage der Injektion von zirkulierenden Tumorzellen, die mittels Durchflusszytometrie aus dem peripheren Blut von Prostatakrebspatienten isoliert wurden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich Prostatakrebs zu beantworten, indem sie neue experimentelle Modelle generiert, die für die molekulare Charakterisierung von Prostatakrebs und die Entwicklung neuer Biomarker verwendet werden können. Williams, ein Student aus dem Labor, und Omada, ein Forscher aus der onkologischen Abteilung hier am Mount Sinai, werden das Verfahren demonstrieren. Um mit der Entnahme von Vollblut von ausgewählten Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs zu beginnen, da sie das Potenzial haben, eine hohe Anzahl zirkulierender Tumorzellen in ihrem peripheren Blut zu haben. Übertragen Sie mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette das Vollblut zusammen mit der Hank-Saldosalzlösung in ein konisches 50-Milliliter-Polystyrolröhrchen.

Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis, um sie zu homogenisieren. Geben Sie als Nächstes 15 Milliliter einer FI-Call-Pack-Lösung in ein leeres konisches 50-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig 20 Milliliter des verdünnten Vollbluts mit der niedrigsten Einstellung auf der Lösung, um eine deutliche Deckschicht zu bilden.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 400 G für 30 Minuten. Stellen Sie bei Raumtemperatur die Verzögerung der Zentrifuge auf die niedrigste Stufe, um ein Vermischen der Lösungen nach der Trennung zu verhindern. Identifizieren Sie nach der Zentrifugation den dünnen, weißen, grauen Streifen von mononukleären Zellen im peripheren Blut und zirkulierenden Tumorzellen, die zwischen der oberen Plasmaschicht und der Trennlösung eingeklemmt sind.

Am Boden des Röhrchens sammeln Sie vorsichtig die Zellen von dem weißgrauen Streifen und geben sie in ein 50-Milliliter-Styroporröhrchen. Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff und fügen Sie dann Hank's hinzu. Balancieren Sie die Salzlösung auf die isolierten Zellen für ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern.

Die Mischung erneut bei 400 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Um die Zellen zu waschen, entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diese Wäsche. Treten Sie noch einmal ein.

Nach dem zweiten Waschen den Überstand entsorgen. Suspendieren Sie das restliche Pellet in fünf Millilitern Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen und inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Anschließend wird die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g zentrifugiert und der Lysepuffer durch Verwerfen des Überstands entfernt.

Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet vor der Färbung in einem Milliliter PBS, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt ist. Quantifizieren Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen mit der Standardmethode des Trian-Blau-Ausschlusses auf einem Hämo-, Zytometer- oder automatisierten Zellzähler. Verdünnen Sie dann die Zellen auf 1 Million Zellen pro Milliliter in PBS mit 10% FBS und legen Sie sie eine Stunde lang auf Eis.

Um eine unspezifische Bindung zu blockieren, verteilen Sie die Zellsuspension auf zwei separate Röhrchen. Beschriften Sie ein Röhrchen für Kontrollzellen und eines für CD 45-Färbezellen im Kontrollröhrchen. Fügen Sie IgG ein Kappa Zi in einer Verdünnung von eins bis 250 bis zu einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu.

Im Färberohr CD 45. Geben Sie CD 45 ZI konjugierten Primärantikörper in der gleichen Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Zellsuspensionen 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend drei Minuten lang bei 400 g bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie dann den Snat.

Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie jedes Pellet in sterilem PBS suspendieren, das mit 10 % FBS ergänzt ist, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der Reanimation suspendieren Sie die Zellen in einer Ein-Milliliter-Lösung von PBS, die 10 Mikrogramm pro Milliliter Feuchtfleck enthält. Filtern Sie die durch 35-Mikrometer-Siebkappen in 12 Millimeter x 75 Millimeter große Polystyrolröhrchen, um Zellverklumpungen oder Ablagerungen auszuschließen.

Schließen Sie dann die CD-45-positiven Zellen und toten Zellen aus der Suspension aus, indem Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung verwenden, um sie zu entfernen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie die sortierte Prostatatumorzellsuspension mit extrazellulären Matrixproteinen im Verhältnis eins zu eins und legen Sie die Mischung auf Eis. Als nächstes betäuben Sie einen acht bis 10 Wochen alten männlichen immundefizienten Mund gemäß den institutionellen Richtlinien mit 5% inhaliertem Iso-Fluor in einem Liter Sauerstoff pro Minute.

Stellen Sie eine angemessene Anästhesie sicher, indem Sie bei der Maus auf Verlust des Hornhaut- und Zehenreflexes prüfen. 250 Mikroliter der Zellsuspension werden mit einer 25-Gauge-Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze entnommen. Injizieren Sie dann das gesamte Volumen der extrazellulären Matrixzellsuspension subkutan in beide oberen Flanken der Mausmonitortumoren, indem Sie wöchentlich die Injektionsstellen der Maus abtasten, um das Wachstum der subkutanen knotigen Dichten zu erreichen.

Basierend auf der in diesem Protokoll verwendeten negativen Selektionsmethode ist es notwendig, tote Zellen mit DAPI-Färbung auszuschließen. Wie hier gezeigt, ist der Anteil der CD 45 negativen Zellen von den verbleibenden lebensfähigen Zellen variabel und hängt von der Tumorlast des Patienten ab, lässt sich aber leicht von den CD 45 positiven Zellen trennen. Wenn das richtige Gating angewendet wird, werden nach der Implantation der Prostatatumorzellsuspension subkutane knotige Dichten an beiden Flanken der Maus sichtbar.

Jede knotige Dichte stellt das Wachstum des Xenotransplantats dar und kann im Unterschied zu gesundem Gewebe wahrgenommen werden, da sie aus der dorsalen Muskulatur der Maus herausragt und eine festere Textur aufweist. Von Patienten abgeleitete Xenotransplantatmodelle, die aus zirkulierenden Tumorzellen erzeugt wurden, rekapitulieren menschliche Prostatatumoren, wie sie durch Hämat-, Toin- und Eosin-Färbung und durch Immunhistochemie für prostataspezifische zelluläre Marker wie Androgenrezeptor und prostataspezifisches Membranantigen nach der Generierung der Xenotransplantate gesehen wurden. Andere Protokolle wie die Erstellung von Gen- oder Proteinexpressionsprofilen können durchgeführt werden, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zur Aggressivität von Prostatakrebs beitragen.