Name: Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Evans-Blue-Dye-Injektion zur Analyse der Skelettmuskelintegrität bei lebenden Zebrafisch-Larven. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Muskeldystrophie-Modellen und die Entwicklung neuer Therapien.

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Wir möchten Trent Waugh für seine technische Unterstützung danken. Wir die Abteilung für Pädiatrie an der Klinik erkennen auch für kranke Kinder und Cure kongenitaler Muskeldystrophie (CMD) für die großzügige Finanzierung für dieses Projekt.

1. Herstellung von Agar Injection Plates (Dauer: 45 min) <ol><li> Kochen Sie 2% bis 3% Agarose in E3 Medien und ermöglichen Lösung leicht auf der Bank zu kühlen. Anmerkung: Die Anzahl der Einspritzplatten vorbereitet bestimmt die Menge an Agarose erforderlich. Jedes Injektionsplatte muss ca. 35 ml der Agarose-Lösung. </li><li> Nach dem Auskochen die Agarose zu kühlen, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist (z. B. 45 ° C) nach der Spritzgießform Herstellers. </li><li> Gib ca. 35 ml der Agarose in einen 100-mm-Schale abgekühlt. </li><li> Platzieren Sie ein Ende der bevorzugten Spritzgussform in Lösung, dann lag Rest der Form auf Agarose-Lösung (dies wird dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen). </li><li> Damit die Agarose-Lösung entweder bei RT oder bei 4 ° C für ca. 30 min verfestigt. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um ein Ende der Form aus dem festen Agarose zu trennen. Entfernen Sie langsam den Rest des m<html> alt. </li></ol> 2. Herstellung von Evans Blue-Farbstoff (EBD) Injection Mix (Dauer: 30 min) <ol><li> Einen 1% Vorrat an EBD in 1X Ringerlösung (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl 2; 1 mM MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose; pH 7,2), welches bei RT gelagert werden können. </li><li> Machen Sie eine Stammlösung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Dextran MW 10.000 kDa bei 25 mg / ml in 1X Ringer-Lösung und bei -20 ° C </li><li> Bereiten Injektionsmischung durch Verdünnen EBD auf 0,1% direkt im Stammlösung von FITC-Dextran Lager (dh für eine endgültige Arbeitsvolumen von 100 &amp; mgr; l. Mischen Sie 10 ul 1% EBD in 90 &amp; mgr; l FITC-Dextran Lager). </li><li> Gründlich Wirbelinjektions Mix (es sollte grün) und vor direktem Licht zu halten durch Umwickeln Injektionsmischrohr mit Aluminiumfolie. </li></ol> 3. EBD Injektionspräparat (Dauer: ca. 30 min) ent &quot;&gt; Hinweis: Protokoll funktioniert am besten mit Larven aus 3-7 Tage nach der Befruchtung (DPF). <ol><li> Pre-warmen Einspritzplatte auf RT. </li><li> Einrichten Einspritzvorrichtung durch Anordnen von Mikromanipulator auf Metallplatte und stehen neben dem Mikroskop wird zur Injektion verwendet. Schalten Sie Luft angetrieben Mikroinjektion Controller. Hinweis: Die bevorzugte Injektionssystem wird von Labor variieren und sollte Ergebnis der Analyse nicht ändern. </li><li> Zurück zu füllen Injektionsnadel mit rund 2-4 ul der EBD-Mix. </li><li> Kalibrieren Injektionsvolumen etwa 5 nl der EBD-Mix. Hinweis: Injektionsvolumen Kalibrierung wird am Kalibrierungsverfahren abhängen. Ein Kolben angetrieben Injektion kann direkt an einen bestimmten Einspritzmenge eingestellt werden, wohingegen Gasdruck-Injektoren die Einspritzmenge über Volumen-Bolus mit dem Einsatz von einem Mikrometer kalibriert benötigen. </li><li> Wet Spritz Platte mit 1X Ringer-Lösung und entfernen Sie überschüssiges aus Brunnen. </li><li> Pre-Treat-Larven, die mit 0,04% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat salt (Tricaine) in 1X Ringerlösung Larven vor dem Beginn der Einspritzung zu immobilisieren verdünnt. Hinweis: Die Gewährleistung der Larven sind komplett unbeweglich ist wichtig, da die Injektions ist schwierig mit jeder Restbewegung. </li><li> Zeigen anästhesiert Larven in die Vertiefungen der Agar-Einspritzplatten unter Verwendung einer Glaspipette. Stellen Sie sicher, dass die Larven sind vollständig in den Brunnen und auf ihrer Seite liegen. Anmerkung: Die Zahl der Larven pro Vertiefung bis zu den Experimentator. </li><li> Nach Larven werden in den Vertiefungen setzen, entfernen Sie überschüssige Ringer-Lösung, um Larven Bewegung innerhalb der gut zu minimieren. Lassen Sie eine Restmenge an Lösung, so dass Larven nicht zu dehydrieren. </li></ol> 4. Pericardial Injektion von Zebrafisch-Larven mit EBD (Time: Abhängig von der Anzahl der Larven injizierende, schätzungsweise 1-3 h) <ol><li> Legen Sie die Einspritzplatte, die die Larven auf einem Binokular, wo die Injektionen durchgeführt. </li><li> Positionieren Sie die Injektionspipette Nadel enthält,die EBD-Mix über einen Zebrafisch-Larven. </li><li> Re-Position der Einspritzplatte durch Drehen, so dass die Injektionsnadel in der Nähe Herzen der Larven und etwa 45 ° ventral von der Vorwärts-Rückwärts-Achse. </li><li> Einfügen der Injektionsnadel in die gemeinsame Cardinalvene (CCV) im Bereich der Vene am vorderen Teil des Eigelbs, wo die Ader wird zunächst Drehen in dorsaler Richtung (Figur 1). Hinweis: Eine Vergrößerung von bis zu 40x kann nützlich sein, deutlich sehen, die CCV sein. </li><li> Injizieren Sie 5 nl der EBD-Mix und halten Injektionsnadel in Position für 5-8 Sekunden, um sofortige Leckage von EBD-Mix zu minimieren. Anmerkung: Eine gute Einspritzung Farbstofffärbung in den Herzkammern gesehen (Figur 1) aufweisen. Wenn EBD Mischung nicht im Herz beobachtet, dann Einspritzen einer zusätzlichen 5 nl des EBD Mischung kann ausreichen, um die Farbstoffaufnahme induzieren. Alternativ kann die Embryos verworfen. Hinweis: In einigen Situationen kann der Herzschlag zu stoppen. Wenn diese occurs, weiterhin die Larven für 20-40 sec überwachen. In der Regel nimmt der Herzschlag, wie der Farbstoff durch das Kreislaufsystem bewegt. </li><li> Gehen Sie zum nächsten Larven und wiederholen. </li><li> Identifizierung erfolgreich injizierten Embryonen durch Beobachten der Gegenwart von FITC-Dextran in die Vaskulatur unmittelbar nach der Injektion (Figur 2). </li></ol> 5. Inkubation und EBD Aufnahme (Time: 4-6 h) <ol><li> Nachdem die gewünschte Anzahl von Larven injiziert Rück injiziert Larven auf 1X Ringerlösung ohne Tricaine in 100 mm-Schalen. </li><li> Halten Sie Speisen in Aluminiumfolie eingewickelt. Hinweis: Halten Sie injizierten Larven in der Dunkelheit deutlich erhöht Überlebensraten und gewährleistet die größte Konsistenz in der Signalstärke. Wickel in Aluminiumfolie ist besonders wichtig für die Zeitspanne, die die Larven sich außerhalb des Inkubators. </li><li> Erlauben Larven bei 28,5 ° C für 4-6 Stunden inkubiert, um eine ausreichende EBD Aufnahme zu gewährleisten. </li></ol&gt; 6. Visualisierung der EBD im Muskel (Time: Abhängig von der Anzahl der Larven injizierende und Art der Mikroskopie, geschätzte 0,5 bis 3 h) <ol><li> Vor der Bilderzeugung, betäuben die Larven mit 0,04% Tricaine um Bewegung zu verhindern. </li><li> Ansicht Larven unter rote Fluoreszenz zu bestimmen, ob EBD-Aufnahme in Skelettmuskel (3) auftritt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Zebrafisch als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der neuromuskulären Erkrankungen 2,29 Schwellen. Bis heute hat der Zebrafisch-System verwendet worden, um neue Muskel krankheitsverursachende Mutationen 16,17,30 validieren, aufzuklären neue Pathomechanismen 18 und identifizieren potenziell neue Therapeutika 12,24. Diese gemeinsamen Anstrengungen haben den Nutzen der Zebrafisch die menschliche neuromuskuläre Krankheiten Modell etabliert. Doch trotz der Fortschritte mit Zebrafischen und Säugetieren Modellen, gibt es begrenzte Behandlungsmöglichkeiten für Patienten in das breite Spektrum der neuromuskulärer Krankheiten. Daher besteht eine hohe Nachfrage nach Therapieentwicklung für diese Gruppe von verheerenden Krankheiten. Parallel zu dieser Nachfrage nach Therapeutika ist die entsprechende Notwendigkeit einer laufenden experimentellen Innovationen sowie rigorose Analyse, neue Tiermodelle und vermeintlichen therapeutischen Strategien zu überprüfen. EBD-Analyse wird häufig in Maus-Modellen verwendetStudie Gewebe und Zellschäden im Gehirn, Herz und Skelettmuskel 27,31. Am auffälligsten ist, EBD ausgiebig in Mausmodellen von verschiedenen Muskeldystrophie Subtypen verwendet werden, um den Schweregrad der Muskelmembran Instabilität zeigen und 8 beschädigen. Die Verwendung von EBD, um Muskelmembranschäden aufzudecken ist eine unterstützende Parameter Gründung Ähnlichkeiten des Tiermodell für das menschliche Krankheitszustand 9. Die Macht der EBD in Maus hat mehrere Labors, einschließlich unserer eigenen führte, zu entwickeln und anzuwenden, um EBD Zebrafisch Modelle von neuromuskulären Erkrankungen. Aufgrund der Anwendbarkeit der EBD-Analyse wird diese Technik aktiv umgesetzt, um Zebrafisch-Modelle auf den menschlichen Krankheitszustand 11,15,22,24,32 mauern. Larven mit beschädigten Muskelmembranen müssen EBD-Aufnahme und damit rote Fluoreszenz in Muskelfasern. Fluoreszenz in dem Raum zwischen den Fasern beobachtet, jedoch nicht im einzelnen Muskelfasern kann auch informative Faser Ablösen von der Basalmembran in t seiner Abwesenheit von Membranschäden, die nützliche diagnostische Details. EBD-Analyse hat mögliche Anwendung außerhalb Tiermodellvalidierung. Die Bemühungen von unserem Labor haben kürzlich gezeigt, dass EBD-Analyse ist von Vorteil bei der Validierung potenziell neuartigen Therapien 24. Feststellung, ob potenzielle therapeutische Behandlungen reduzieren oder abzuschaffen EBD-Aufnahme in neuromuskuläre Erkrankung Modelle können relevante therapeutische Wirkung 8 bedeuten. Diese Art der Analyse kann helfen, die Mechanismus (n) von Therapeutika und dehnt die Anwendung der EBD-Analyse. Wie bei vielen Techniken, hat EBD Analysen haben mehrere Einschränkungen, die während experimentellen Design und Praxis eingehalten werden. Zum Beispiel kann es schwierig sein, die CCV identifizieren aufgrund der Verdickung des Gewebes mit dem Alter. Zusätzlich ist es einfach zu Larven in Vorbereitung beschädigen vor und während des perikardialen Injektion Reduktions experimentellen Zählungen und erhöhen den Bedarf an einer großen Anzahl von Larven prep.Außerdem können mechanische Schäden die Larven während der Handhabung und Einspritzung erfolgen in false positives Ergebnis als beschädigt Muskel aufnehmen kann EBD. Um einige dieser Hindernisse zu überwinden, haben wir ein Co-Einspritzstrategie in diesem Video-Artikel, der eine einfache und zuverlässige Identifikation von Larven mit sofort erfolgreich Farbstoff Infusion nach der Injektion und vor der anschließenden Analyse erlaubt beschrieben. Die FITC-Dextran Coinjektion Steuerungen für erfolgreiche Injektion indem Bestätigung EBD im Gefäßsystem vor der Aufnahme durch die Muskelfasern. Dies kann besonders nützlich sein, da EBD Fluoreszenz wird nach mehreren Stunden, wenn nicht in den Muskelfasern gesammelt stark diffuse in Larven; Als solches ist es schwierig zu erkennen sein. Darüber hinaus fehlt der CCV und Injizieren EBD in den Dotter oder Körperhöhle kann nach der Inkubation ergeben diffuse rote Fluoreszenz ähnlich Embryonen zu steuern, noch mit der verringerten Wahrscheinlichkeit der Aufnahme durch beschädigte Muskelfasern. Gemeinsam sind diese Höhlenats vorschlagen EBD Injektion erfordert Geduld und Praxis, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. In all beschreiben wir eine praktische und einfache Methode, um EBD-Analyse auf Zebrafisch-Larven durchzuführen. Bisher hat sich die Verwendung von Zebrafisch als Modellsystem, vor allem als Mensch Krankheitsmodell, wurde schnell wachsenden. Diese Expansion ist zum Teil auf die weitere Entwicklung und Veränderung der experimentellen Techniken, die auf den gegenwärtigen Vorteile der Zebrafisch-System zu verbessern. Die EBD Injektionstechnik stellt eine zusätzliche und leistungsfähiges Werkzeug, um eines Forschers Arsenal für die Validierung und Untersuchung der Zebrafisch Muskelkrankheitsmodellen. Die laufende Umsetzung und Änderung dieser Technik hat das Potenzial, zu helfen aufzudecken neuer Therapiestrategien sowie krankheitsverursachenden Mechanismen.

Muskeldystrophien stellen eine Gruppe von weit verbreiteten und heterogenen menschlichen Muskelerkrankungen mit spezifischen histopathologischen Merkmalendar 1,2. Zu den typischen Symptomen, die mit dieser verheerenden Gruppe von Krankheiten in Verbindung gebracht werden, gehören Muskelschwäche, Muskeldegeneration, Verlust der Beweglichkeit und frühe Mortalität1,3. Die primären Pathomechanismen von Muskeldystrophien sind der Verlust von Proteinen, die das Sarkolemma stabilisieren, Transmembrankomplexe verankern und die Zellsignalübertragung über die Membranvermitteln 4-6. Zum Beispiel führt der vollständige Verlust des Proteins Dystrophin, eines primären Gerüstproteins des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes, zu einer Destabilisierung der Muskelmembran bei der Duchenne-Muskeldystrophie7. Aufgrund der Tatsache, dass die meisten Muskeldystrophien auf Mutationen in Proteinen zurückzuführen sind, die an der Verbindung zwischen der extrazellulären Matrix und dem sarkolemmalen Zytoskelett beteiligt sind, ist eine häufige Beobachtung auf zellulärer Ebene der Verlust der sakrolemmalen Integrität8,9. Dieses Verständnis der primären Pathomechanismen, die mit Muskeldystrophien assoziiert sind, ist das Ergebnis langjähriger Forschung unter Verwendung von Tiermodellsystemen2,10-15. Trotz Fortschritten auf diesem Gebiet gibt es jedoch immer noch begrenzte therapeutische Optionen für die Behandlung oder das Management des Spektrums der Dystrophie-Subtypen. Diese Einschränkung der praktikablen Therapien ist auf mehrere Schlüsselfaktoren zurückzuführen: 1) die Schwierigkeit der Gentherapiestrategien, 2) eine hohe Häufigkeit von De-novo-Krankheitsfällen und der entsprechende Mangel an übertragbaren Tiermodellen und 3) das Fehlen rigoroser Strategien, um die physiologischen Folgen mutmaßlicher Therapeutika mit klaren und reproduzierbaren Ergebnismaßen zu testen.
Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, verwenden zahlreiche Laboratorien, einschließlich unseres eigenen, den Zebrafisch als System, um menschliche neuromuskuläre Erkrankungen zu modellieren und zu untersuchen2. Bisher haben sich Zebrafische als wertvolles Werkzeug in der Krankheitsforschung erwiesen. Das Zebrafischmodell wurde verwendet, um neuartige krankheitsverursachende Mutationen beim Menschen zu identifizieren und zu validieren16,17, nicht charakterisierte krankheitsverursachende Mechanismenaufzuklären 17,18 und neue therapeutische Strategienzu identifizieren 12,19. Diese Fortschritte wurden zum Teil durch die kanonischen Stärken des Zebrafischsystems erzielt, wie z. B. seine optische Klarheit, die einfache genetische Manipulation und die Fähigkeit, sich in großer Zahl zu vermehren20. Zebrafische haben sich zusätzlich als geeignet für groß angelegte Wirkstoffscreeningserwiesen 21, eine wertvolle Methode zur Identifizierung neuartiger Therapeutika22-24. In Bezug auf die Erforschung von Muskelerkrankungen werden diese Stärken durch die Fähigkeit ergänzt, einzelne Skelettmuskelfasern des Zebrafisches über Dissoziation25 zu isolieren, und durch die Fähigkeit, die Myofaserorganisation in vivo mit Hilfe des optischen Phänomens namens Doppelbrechung26 zu untersuchen, das zusammen eine schnelle Bestimmung der makroskopischen Muskelintegrität ermöglicht. Unabhängig von diesen verfügbaren Dienstprogrammen ist eine kontinuierliche Weiterentwicklung des Tools erforderlich, um die Untersuchung voranzutreiben.
Wir und andere haben ein Protokoll für die EBD-Injektion und -Analyse im Zebrafischmodell angepasst. EBD ist ein lebenswichtiger, zelldurchlässiger Farbstoff, der von geschädigten, entarteten oder apoptotischen Zellen aufgenommen und dann unter Fluoreszenzsichtbar gemacht wird 27. Bisher wurde die EBD-Analyse ausgiebig zur Analyse der Muskelmembranintegrität in Mausmodellen für Skelettmuskel- und Herzerkrankungen eingesetzt8,9,27. Bei Säugetierpräparaten erfordert der entnommene Muskel jedoch in der Regel ein mühsames Schneiden oder Sezieren vor der Analyse. Beim Zebrafisch ist eine direkte Analyse in hoher Zahl mit lebenden und intakten Tieren möglich. In diesem Videoartikel zeigen wir die Methodik zur Durchführung von EBD-Injektionen und -Analysen in lebenden Zebrafischlarven mit repräsentativen Bildern der EBD-Aufnahme in der Zebrafischdystrophie-Mutantenlinie sapje15,28. Darüber hinaus stellen wir eine Co-Injektionsstrategie vor, die eine bessere Quantifizierung von EBD-Präparaten ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran MW 10.000</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Evan's Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875712</td><td>Spritzgussboden</td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Für Injektionsnadel</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Spritzgussform</td></tr><tr><td>Mikrospritzgussform</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Spritzgussform</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Magnessiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Ringer-Lösung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C1061</td><td>Ringer-Lösung</td></tr></tbody></table>

analyse von zebrafisch-larven skelettmuskel integrität mit evans blue dye

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Das Zebrafischmodell ist ein aufstrebendes System zur Untersuchung neuromuskulärer Erkrankungen. Bei der Erforschung neuromuskulärer Erkrankungen ist die Integrität der Muskelmembran eine entscheidende Determinante für die Erkrankung. Bis heute zeigen zahlreiche neuromuskuläre Erkrankungen degenerierende Muskelfasern mit abnormaler Membranintegrität; Dies wird am häufigsten bei Muskeldystrophien beobachtet. Evans Blue Dye (EBD) ist ein lebenswichtiger, zelldurchlässiger Farbstoff, der schnell in degenerierende, geschädigte oder apoptotische Zellen aufgenommen wird. Im Gegensatz dazu wird es von Zellen mit einer intakten Membran nicht aufgenommen. Die EBD-Injektion wird häufig eingesetzt, um die Muskelintegrität in Mausmodellen für neuromuskuläre Erkrankungen zu ermitteln. Solche EBD-Experimente erfordern jedoch eine Muskeldissektion und/oder -sektion vor der Analyse. Im Gegensatz dazu wird die EBD-Aufnahme im Zebrafisch in lebenden, intakten Präparaten sichtbar gemacht. Hier zeigen wir eine einfache und unkomplizierte Methodik für die Durchführung von EBD-Injektionen und -Analysen in lebenden Zebrafischen. Darüber hinaus demonstrieren wir eine Co-Injektionsstrategie, um die Wirksamkeit der EBD-Analyse zu erhöhen. Insgesamt bietet dieser Videoartikel einen Überblick über die Durchführung von EBD-Injektionen und die Charakterisierung in Zebrafischmodellen für neuromuskuläre Erkrankungen.

Die EBD Injektion Mischung wurde bei 3 dpf in die CCV von sapje homozygote Mutanten und Wildtyp-Geschwister injiziert. Injektionen, die den Herzkammern (1B) gefüllt wurden dann für eine erfolgreiche Injektion durch die Visualisierung von FITC-Dextran in die Vaskulatur unter grüne Fluoreszenz (Figur 2) untersucht. Nach 4 Stunden Inkubationszeit wurde EBD Aufnahme an der Somitenstufe mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Wildtypgeschwister zeigte keine EBD Fluoreszenz innerhalb sichtbare Muskelfasern (3A), wohingegen die sapje homozygoten Mutanten zeigten EBD Aufnahme, was Schäden an der Muskelmembran 15 (3B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> Abbildung 1. Spritzen EBD Injektion Mischung in den gemeinsamen Kardinal Vene (CCV) eines Zebrafisch embryo. (A) nicht-injizierten Embryo. Pfeil zeigt den idealen Standort für CCV Injektion. (B) Erfolgreiche Injektion in den CCV. Der Farbstoff dringt in die Herzkammern (Pfeil) und beginnt, durch das Gefäßsystem gepumpt werden. (C) Ein erfolgloser CCV Injektion wird in einigen oder allen der Farbstoff Eingabe der Dottersack des Embryos (Pfeil) zur Folge haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Embryos können für eine erfolgreiche Injektion durch Beobachtung FITC-Dextran Verteilung unter grüne Fluoreszenz im gesamten Gefäßsystem unmittelbar nach der Injektion und vor der EBD Aufnahme sortiert werden.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> Abbildung 3: EBD wird durch Fasern mit beschädigten Membranen (A) Wildtyp Geschwistern zeigt keine EBD Fluoreszenz in Muskelfasern entnommen werden.. (B) Sapje ​​homozygote Mutante mit EBD Fluoreszenz in mehreren Muskelfasern (Pfeile). Alle Larven wurden mit dem EBD Injektions Mischung injiziert und nach 4 h Inkubation bei 3 dpf analysiert. Geschwister und Mutanten wurden durch Muskelfaserablösung vor dem CCV Injektions sortiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Das übergeordnete Ziel der Injektion von Evans-Blau-Farbstoff und Fitzy-Dextrin in die gemeinsame Kardinalvene besteht darin, die Integrität der Skelettmuskelmembran in lebenden Zebrafischen zu beobachten, um Krankheitsmechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen Subtypen der Muskeldystrophie zu charakterisieren. Die Injektion von Evans-Blau-Farbstoff kann dazu beitragen, biologische Mechanismen aufzudecken, die zur Krankheitspathologie beitragen, wenn Tiermodelle der Muskeldystrophie charakterisiert werden; sie kann außerdem zum Verständnis potenzieller therapeutischer Mechanismen für die Krankheitsbehandlung beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie an lebenden Zebrafischen durchgeführt und analysiert werden kann.Zusätzlich dient die Co-Injektion von Fitz Dextrin als Qualitätskontrolle für eine erfolgreiche Injektion, wodurch die Aussagekraft und Quantifizierung verbessert werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt in ihrer Nützlichkeit zur Validierung von Zebrafisch-Modellen für Muskelerkrankungen. Sie trägt außerdem zum Verständnis bei, wie bestimmte Mutationen zu Phänotypen von Muskelerkrankungen wie der Muskeldystrophie führen, was für die Entwicklung von Therapien und Heilmethoden von entscheidender Bedeutung ist.Zur Herstellung von Agar-Injektionsplatten zwei bis 3 % Agar in E3-Medium aufkochen und die Lösung leicht abkühlen lassen. Etwa 35 Milliliter des abgekühlten Agars in jede 100-Millimeter-Petrischale geben. Anschließend ein Ende einer bevorzugten Injektionsform in die Lösung stellen, bevor der Rest der Form auf die Agar-Lösung gelegt wird.Lassen Sie die Agar-Lösung etwa 30 Minuten lang entweder bei Raumtemperatur oder bei vier Grad Celsius erstarren. Trennen Sie dann mit einem Spatel ein Ende der Form vom festen Agar und entfernen Sie langsam den Rest der Form. Stellen Sie eine 1 %-Stammlösung von Evans-Blau-Farbstoff oder EBD in einer x-Ringer-Lösung her.Bereiten Sie anschließend eine Stammlösung von Fitzy Dextrin in einer x Ringer-Lösung vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Zum Herstellen der Injektionsmischung verdünnen Sie EBD auf 0,1 % direkt in der Fitzy Dextrin-Stammlösung, wirbeln die Injektionsmischung gründlich um und schützen sie vor direktem Licht, indem Sie das Röhrchen vor der Injektion mit Aluminiumfolie umwickeln. Temperieren Sie die Injektionsplatte vorab auf Raumtemperatur.Stellen Sie den Mikromanipulator auf eine Metallplatte und neben das Injektionsmikroskop. Schalten Sie den luftbetriebenen Mikroinjektionsregler ein. Füllen Sie dann die Injektionsnadel mit etwa zwei bis vier Mikrolitern der EBD-Mischung von hinten auf.Als Nächstes kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit etwa fünf Nanolitern der EBD-Mischung. Anschließend befeuchten Sie die Injektionsplatte mit einer x Ringer-Lösung und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Vertiefungen. Behandeln Sie die Larven vor der Injektion mit einer 0,04 %igen Trica-Lösung, die in einer x Ringer-Lösung verdünnt ist, um die Larven vollständig zu immobilisieren. Bringen Sie die anesthetisierten Larven in die Vertiefungen der Auger-Injektionsplatte unter sicherer Stellung sicher, dass die Larven vollständig in den Vertiefungen liegen und auf der Seite ruhen.Entfernen Sie die überschüssige Trica-Lösung, um die Bewegung der Larven in der Vertiefung zu minimieren, lassen Sie jedoch genügend Lösung zurück, um eine Austrocknung zu verhindern. Stellen Sie die Injektionsplatte mit den Larven unter ein Stereomikroskop und positionieren Sie die Injektionspipettenspitze, die EBD enthält. Mischen Sie über einer Zebrafischlarve in der Nähe des Herzens und in einem Winkel von etwa 45 Grad zur anterioren-posterioren Achse.Führen Sie die Injektionsnadel in die Vena cardinalis communis oder CCV in der Nähe des vorderen Teils des Dotters ein, wo die Vene ursprünglich in dorsale Richtung abknickt. Injizieren Sie anschließend fünf Nanoliter der EBD-Mischung und halten Sie die Injektionsnadel fünf bis acht Sekunden lang in dieser Position. Um ein sofortiges Austreten der EBD-Mischung zu minimieren, sollte eine erfolgreiche Injektion Farbstoff in den Herzkammern sichtbar machen, und sie kann bei Bedarf wiederholt werden.Wenn EB DMX unmittelbar nach einer erfolgreichen Injektion nicht im Herzen sichtbar ist, sammelt der Embryo Fitz Dextrin im Gefäßsystem, wie hier gezeigt. Nachdem die gewünschte Anzahl an Larven injiziert wurde, bringen Sie die Larven zur Erhöhung der Überlebensrate und Aufrechterhaltung der Signalstärke in eine x Ringer-Lösung ohne Trica in 100-Millimeter-Dishs zurück. Halten Sie die Dishs in Aluminiumfolie eingewickelt.Die Larven bei 28,5 Grad Celsius vier bis sechs Stunden inkubieren, um eine effiziente EBD-Aufnahme sicherzustellen. Um EBD im Muskel zu visualisieren, die Larven vor der Betrachtung unter roter Fluoreszenz mit 0,04 % Trica anästhesieren. EBD wurde in die CCV von Sapia-homögenen Mutanten und wildtypischen Geschwistern am 3. Tag nach der Befruchtung injiziert; Injektionen, die wie hier gezeigt die Herzkammern füllten, wurden anschließend durch Visualisierung von Fitzy-Dextrin im Gefäßsystem unter grüner Fluoreszenz auf erfolgreiche Farbstoffperfusion analysiert.Nach einer vierstündigen Inkubationszeit wurde die EBD-Aufnahme auf der Ebene der Somiten untersucht, wie in dieser Abbildung dargestellt. Wildtyp-Geschwister zeigten keine EBD-Fluoreszenz in irgendeiner sichtbaren Muskel­faser, während die sapia-homozygoten Mutanten eine EBD-Aufnahme aufwiesen, die auf eine Schädigung der Muskelmembran hinweist. Nachdem man die Injektion von Evans-Blau-Färbung in die gemeinsame Kardinalvene von Zebrafischen beherrscht hat, kann die Behandlung der Larven innerhalb von 30 bis 60 Minuten abgeschlossen werden, abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Larven.Außerdem können experimentelle Ergebnisse an einem einzigen Tag erzielt werden, um die erforderliche Kompetenz sicherzustellen. Es ist wichtig, sorgfältig auf die Cardinalvene zu zielen, um konsistente und interpretierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies kann herausfordernd sein und erfordert vermutlich etwas Übung, wenn man diesem Verfahren folgt.Es können auch andere Methoden durchgeführt werden, wie beispielsweise chemische und genetische Screens, um die molekularen Mechanismen zu ermitteln, die für die Membranschädigung im Zusammenhang mit Muskeldystrophien verantwortlich sind. Diese Experimente können dazu beitragen, neue therapeutische Strategien für Muskelerkrankungen nach deren Entwicklung zu etablieren. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Muskelerkrankungen den Weg, die Membranintegrität in Zebrafisch-Modellen der Muskeldystrophie zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie genau wissen, wie man Evans-Blau-Farbstoff in die A. cardinalis von Zebrafischlarven injiziert. Außerdem sollten Sie in der Lage sein, Muskelfasern mit Schäden an der Membran aufgrund der Anwesenheit von Evans-Blau-Farbstoff innerhalb der Fasern zu erkennen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Der Zebrafisch ist mittlerweile ein etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug zur Modellierung von Muskeldystrophien, angeborenen Myopathien und verwandten neuromuskulären Erkrankungen. Doppelbrechung und berührungsevoziertes Fluchtverhalten sind zwei gängige nicht-invasive Assays, die verwendet werden, um den Grad der Muskeldesorganisation und der Beeinträchtigung des Bewegungsapparates von Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung zu bestimmen.

Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen C. elegans

Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um Muskelfunktionen und -krankheiten zu untersuchen. Während der frühen Embryogenese beginnen Zebrafische regelmäßige Muskelkontraktionen, die ein rhythmisches Schwimmverhalten erzeugen, das sich verändert, wenn der Muskel gestört wird. Hier beschreiben wir einen berührungsevozierten Reaktions- und Fortbewegungsassay, um die Schwimmleistung als Maß für die Muskelfunktion zu untersuchen.

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Die Finite-Elemente-Analyse ist ein häufig verwendetes Werkzeug, um die mechanische Leistung von Strukturen unter Last zu untersuchen. Hier wenden wir seine Verwendung an, um die Biomechanik des Kiefers des Zebrafisches zu modellieren.

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Hier haben wir die Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat eine Veränderung der Knochenmasse bei Zebrafischlarven verursacht. Diese Färbemethode kann an die Untersuchung des Knochenverlustes bei Zebrafischlarven angepasst werden, der durch andere gefährliche Giftstoffe induziert wird.

Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Dieses Protokoll beschreibt ein Kryoverletzungsmodell, um eine tiefgreifende Schädigung mehrerer kaudaler Myomere in erwachsenen Zebrafischen zu induzieren. Diese Methode bietet einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Skelettmuskelregeneration nach starkem Gewebeverlust bei Nicht-Säugetier-Wirbeltieren.

Ein Kryoverletzungsmodell zur Untersuchung der Skelettmuskelregeneration des Schwanzstiels bei erwachsenen Zebrafischen

Erfahren Sie die Evans-Blue-Dye-Injektion zur Analyse der Skelettmuskelintegrität bei lebenden Zebrafisch-Larven. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Muskeldystrophie-Modellen und die Entwicklung neuer Therapien.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

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