Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Das übergeordnete Ziel der Injektion von Evans-Blau-Farbstoff und Fitzy-Dextrin in die gemeinsame Kardinalvene besteht darin, die Integrität der Skelettmuskelmembran in lebenden Zebrafischen zu beobachten, um Krankheitsmechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen Subtypen der Muskeldystrophie zu charakterisieren. Die Injektion von Evans-Blau-Farbstoff kann dazu beitragen, biologische Mechanismen aufzudecken, die zur Krankheitspathologie beitragen, wenn Tiermodelle der Muskeldystrophie charakterisiert werden; sie kann außerdem zum Verständnis potenzieller therapeutischer Mechanismen für die Krankheitsbehandlung beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie an lebenden Zebrafischen durchgeführt und analysiert werden kann.

Zusätzlich dient die Co-Injektion von Fitz Dextrin als Qualitätskontrolle für eine erfolgreiche Injektion, wodurch die Aussagekraft und Quantifizierung verbessert werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt in ihrer Nützlichkeit zur Validierung von Zebrafisch-Modellen für Muskelerkrankungen. Sie trägt außerdem zum Verständnis bei, wie bestimmte Mutationen zu Phänotypen von Muskelerkrankungen wie der Muskeldystrophie führen, was für die Entwicklung von Therapien und Heilmethoden von entscheidender Bedeutung ist.

Zur Herstellung von Agar-Injektionsplatten zwei bis 3 % Agar in E3-Medium aufkochen und die Lösung leicht abkühlen lassen. Etwa 35 Milliliter des abgekühlten Agars in jede 100-Millimeter-Petrischale geben. Anschließend ein Ende einer bevorzugten Injektionsform in die Lösung stellen, bevor der Rest der Form auf die Agar-Lösung gelegt wird.

Lassen Sie die Agar-Lösung etwa 30 Minuten lang entweder bei Raumtemperatur oder bei vier Grad Celsius erstarren. Trennen Sie dann mit einem Spatel ein Ende der Form vom festen Agar und entfernen Sie langsam den Rest der Form. Stellen Sie eine 1 %-Stammlösung von Evans-Blau-Farbstoff oder EBD in einer x-Ringer-Lösung her.

Bereiten Sie anschließend eine Stammlösung von Fitzy Dextrin in einer x Ringer-Lösung vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Zum Herstellen der Injektionsmischung verdünnen Sie EBD auf 0,1 % direkt in der Fitzy Dextrin-Stammlösung, wirbeln die Injektionsmischung gründlich um und schützen sie vor direktem Licht, indem Sie das Röhrchen vor der Injektion mit Aluminiumfolie umwickeln. Temperieren Sie die Injektionsplatte vorab auf Raumtemperatur.

Stellen Sie den Mikromanipulator auf eine Metallplatte und neben das Injektionsmikroskop. Schalten Sie den luftbetriebenen Mikroinjektionsregler ein. Füllen Sie dann die Injektionsnadel mit etwa zwei bis vier Mikrolitern der EBD-Mischung von hinten auf.

Als Nächstes kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit etwa fünf Nanolitern der EBD-Mischung. Anschließend befeuchten Sie die Injektionsplatte mit einer x Ringer-Lösung und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Vertiefungen. Behandeln Sie die Larven vor der Injektion mit einer 0,04 %igen Trica-Lösung, die in einer x Ringer-Lösung verdünnt ist, um die Larven vollständig zu immobilisieren. Bringen Sie die anesthetisierten Larven in die Vertiefungen der Auger-Injektionsplatte unter sicherer Stellung sicher, dass die Larven vollständig in den Vertiefungen liegen und auf der Seite ruhen.

Entfernen Sie die überschüssige Trica-Lösung, um die Bewegung der Larven in der Vertiefung zu minimieren, lassen Sie jedoch genügend Lösung zurück, um eine Austrocknung zu verhindern. Stellen Sie die Injektionsplatte mit den Larven unter ein Stereomikroskop und positionieren Sie die Injektionspipettenspitze, die EBD enthält. Mischen Sie über einer Zebrafischlarve in der Nähe des Herzens und in einem Winkel von etwa 45 Grad zur anterioren-posterioren Achse.

Führen Sie die Injektionsnadel in die Vena cardinalis communis oder CCV in der Nähe des vorderen Teils des Dotters ein, wo die Vene ursprünglich in dorsale Richtung abknickt. Injizieren Sie anschließend fünf Nanoliter der EBD-Mischung und halten Sie die Injektionsnadel fünf bis acht Sekunden lang in dieser Position. Um ein sofortiges Austreten der EBD-Mischung zu minimieren, sollte eine erfolgreiche Injektion Farbstoff in den Herzkammern sichtbar machen, und sie kann bei Bedarf wiederholt werden.

Wenn EB DMX unmittelbar nach einer erfolgreichen Injektion nicht im Herzen sichtbar ist, sammelt der Embryo Fitz Dextrin im Gefäßsystem, wie hier gezeigt. Nachdem die gewünschte Anzahl an Larven injiziert wurde, bringen Sie die Larven zur Erhöhung der Überlebensrate und Aufrechterhaltung der Signalstärke in eine x Ringer-Lösung ohne Trica in 100-Millimeter-Dishs zurück. Halten Sie die Dishs in Aluminiumfolie eingewickelt.

Die Larven bei 28,5 Grad Celsius vier bis sechs Stunden inkubieren, um eine effiziente EBD-Aufnahme sicherzustellen. Um EBD im Muskel zu visualisieren, die Larven vor der Betrachtung unter roter Fluoreszenz mit 0,04 % Trica anästhesieren. EBD wurde in die CCV von Sapia-homögenen Mutanten und wildtypischen Geschwistern am 3. Tag nach der Befruchtung injiziert; Injektionen, die wie hier gezeigt die Herzkammern füllten, wurden anschließend durch Visualisierung von Fitzy-Dextrin im Gefäßsystem unter grüner Fluoreszenz auf erfolgreiche Farbstoffperfusion analysiert.

Nach einer vierstündigen Inkubationszeit wurde die EBD-Aufnahme auf der Ebene der Somiten untersucht, wie in dieser Abbildung dargestellt. Wildtyp-Geschwister zeigten keine EBD-Fluoreszenz in irgendeiner sichtbaren Muskel­faser, während die sapia-homozygoten Mutanten eine EBD-Aufnahme aufwiesen, die auf eine Schädigung der Muskelmembran hinweist. Nachdem man die Injektion von Evans-Blau-Färbung in die gemeinsame Kardinalvene von Zebrafischen beherrscht hat, kann die Behandlung der Larven innerhalb von 30 bis 60 Minuten abgeschlossen werden, abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Larven.

Außerdem können experimentelle Ergebnisse an einem einzigen Tag erzielt werden, um die erforderliche Kompetenz sicherzustellen. Es ist wichtig, sorgfältig auf die Cardinalvene zu zielen, um konsistente und interpretierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies kann herausfordernd sein und erfordert vermutlich etwas Übung, wenn man diesem Verfahren folgt.

Es können auch andere Methoden durchgeführt werden, wie beispielsweise chemische und genetische Screens, um die molekularen Mechanismen zu ermitteln, die für die Membranschädigung im Zusammenhang mit Muskeldystrophien verantwortlich sind. Diese Experimente können dazu beitragen, neue therapeutische Strategien für Muskelerkrankungen nach deren Entwicklung zu etablieren. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Muskelerkrankungen den Weg, die Membranintegrität in Zebrafisch-Modellen der Muskeldystrophie zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie genau wissen, wie man Evans-Blau-Farbstoff in die A. cardinalis von Zebrafischlarven injiziert. Außerdem sollten Sie in der Lage sein, Muskelfasern mit Schäden an der Membran aufgrund der Anwesenheit von Evans-Blau-Farbstoff innerhalb der Fasern zu erkennen.