Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Das übergeordnete Ziel der Injektion von Evans Blue Dye und Fitzy Dextrin in die gemeinsame Kardinalvene ist es, die Integrität der Skelettmuskelmembran bei lebenden Zebrafischen zu beobachten, um die krankheitsverursachenden Mechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen Subtypen der Muskeldystrophie zu charakterisieren. Die Injektion von Evans blauem Farbstoff kann dazu beitragen, biologische Mechanismen aufzudecken, die zur Krankheitspathologie beitragen. Bei der Charakterisierung von Tiermodellen für Muskeldystrophie kann sie auch zu unserem Verständnis potenzieller therapeutischer Mechanismen für die Behandlung von Krankheiten beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit lebenden Zebrafischen durchgeführt und analysiert werden kann.

Darüber hinaus zeigt die Co-Injektion von Fitz Dextrin eine Qualitätskontrolle für eine erfolgreiche Injektion, die die Strenge und Quantifizierung verbessert. Die Implikationen dieser Technik beziehen sich auf den Nutzen bei der Validierung von Zebrafischmodellen für Muskelerkrankungen. Sie verbessern auch das Verständnis, wie bestimmte Mutationen zu Phänotypen von Muskelerkrankungen führen, wie z. B. Muskeldystrophie, die für die Suche nach Behandlungen und Heilmitteln entscheidend ist.

Zur Herstellung von Agar-Injektionsplatten zwei bis 3 % Aro in E drei mittlerer Stufe kochen und die Lösung auf dem Tisch etwas abkühlen lassen. Gießen Sie etwa 35 Milliliter des abgekühlten Agros in jede 100-Millimeter-Schale. Setzen Sie dann ein Ende einer bevorzugten Spritzgussform in die Lösung ein, bevor Sie den Rest der Form auf die Agro-Lösung legen.

Lassen Sie die Agrolösung entweder bei Raumtemperatur oder bei vier Grad Celsius etwa 30 Minuten lang erstarren. Trennen Sie dann mit einem Spachtel ein Ende der Form von der festen Agros und entfernen Sie langsam den Rest der Form. Stellen Sie eine Brühe von 1% Evan's Blue Dye oder EBD in einer x Ringerlösung her.

Bereiten Sie dann eine Stammlösung von Fitzy Dextrin in einer x Ringerlösung vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Um eine Injektionsmischung herzustellen, verdünnen Sie EBD auf 0,1 % direkt in Fitz Dextrin-Stammlösung, wirbeln Sie die Injektionsmischung gründlich vor und halten Sie sie von direktem Licht fern, indem Sie die Tube vor der Injektion mit Aluminiumfolie umwickeln. Die Injektionsplatte auf Raumtemperatur vorwärmen.

Ordnen Sie den Mikromanipulator auf einer Metallplatte an und stellen Sie sich neben das Injektionsmikroskop. Schalten Sie den druckluftbetriebenen Mikroeinspritzregler ein. Füllen Sie dann die Injektionsnadel mit etwa zwei bis vier Mikrolitern EBD-Mischung auf.

Kalibrieren Sie anschließend das Injektionsvolumen mit etwa fünf Nanolitern EBD-Mix. Verwenden Sie dann eine x Ringerlösung, um die Injektionsplatte zu befeuchten, und entfernen Sie überschüssige Lösung aus den Vertiefungen, behandeln Sie die Larven mit 0,04 % Trica, verdünnt in einer x Ringerlösung, um die Larven vor der Injektion mit einer Glaspipette vollständig zu immobilisieren. Legen Sie die betäubten Larven in die Vertiefungen der Schneckeninjektionsplatten und stellen Sie sicher, dass sich die Larven vollständig in den Vertiefungen befinden und auf der Seite liegen.

Entfernen Sie die überschüssige Trica-Lösung, um die Bewegung der Larven in der Vertiefung zu minimieren, aber lassen Sie genug, um eine Austrocknung zu verhindern. Legen Sie die Injektionsplatte der Larven auf ein Präparierrohr und positionieren Sie die Injektionspipettennadel mit dem EBD. Mischen Sie über eine Zebrafischlarve in der Nähe des Herzens und etwa 45 Grad von der vorderen hinteren Achse entfernt.

Führen Sie die Injektionsnadel in die Vena cardinal communis oder CCV in der Nähe des vorderen Teils des Eigelbs ein, wo sich die Vene zunächst in dorsaler Richtung dreht. Injizieren Sie anschließend fünf Nanoliter EBD-Mischung und halten Sie die Injektionsnadel fünf bis acht Sekunden lang in Position. Um das unmittelbare Austreten des EBD-Gemisches zu minimieren, zeigt eine gute Injektion Farbstoff in den Herzkammern und kann wiederholt werden.

Wenn EB DMX unmittelbar nach einer erfolgreichen Injektion nicht im Herzen zu sehen ist, reichert der Embryo Fitz Dextrin im Gefäßsystem an, wie hier gezeigt. Nachdem die gewünschte Anzahl von Larven injiziert wurde, geben Sie die Larven in 100-Millimeter-Schalen in eine x Ringerlösung ohne Trica zurück, um die Überlebensrate zu erhöhen und die Signalstärke zu erhalten. Bewahren Sie das Geschirr in Alufolie eingewickelt auf.

Inkubieren Sie die Larven vier bis sechs Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius, um eine effiziente EBD-Aufnahme zu gewährleisten. Um EBD im Muskel sichtbar zu machen, verwenden Sie 0,04% Trica, um die Larven zu betäuben, bevor Sie die Larven unter roter Fluoreszenz betrachten. EBD wurde in das CCV von Sapia-homogenen Mutanten injiziert, und Wildtyp-Geschwister wurden bei 3D-PF-Injektionen, die die Herzkammern füllten, wie hier gezeigt, und dann auf eine erfolgreiche Perfusion analysiert, indem Fitzy Dextrin im Gefäßsystem unter grüner Fluoreszenz sichtbar gemacht wurde.

Nach einer vierstündigen Inkubationszeit wurde die EBD-Aufnahme auf der Ebene der Milben untersucht, wie in dieser Abbildung gezeigt. Wildtyp-Geschwister zeigten keine EBD-Fluoreszenz innerhalb sichtbarer Muskelfasern, während die homozygoten Sapia-Mutanten eine EBD-Aufnahme zeigten, die auf eine Schädigung der Muskelmembran hinweist. Sobald die Injektion des Evans-Blau-Farbstoffs in die gemeinsame Kardinalvene des Zebrafisches beherrscht ist, können die Larven je nach Anzahl der injizierten Larven innerhalb von 30 bis 60 Minuten fertiggestellt werden.

Darüber hinaus können experimentelle Ergebnisse an einem einzigen Tag erzielt werden, um die Kompetenz sicherzustellen. Es ist wichtig, daran zu denken, sorgfältig auf die Kardinalvene zu zielen, um konsistente und interpretierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies kann eine Herausforderung sein und wird wahrscheinlich Übung erfordern, wenn Sie dieses Verfahren befolgen.

Es können auch andere Methoden durchgeführt werden, wie z. B. chemische und genetische Screenings, um molekulare Mechanismen zu bestimmen, die für die Membranschäden im Zusammenhang mit Muskeldystrophien verantwortlich sind. Diese Experimente können dazu beitragen, neue therapeutische Strategien für Muskelerkrankungen nach ihrer Entwicklung zu entwickeln. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Erforschung von Muskelerkrankungen den Weg, um die Membranintegrität in Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gründliches Verständnis dafür haben, wie man Evans blauen Farbstoff in die gemeinsame Kardinalvene von Zebrafischlarven injiziert. Sie sollten auch verstehen, wie Sie Muskelfasern mit Membranschäden aufgrund des Vorhandenseins von Evans blauem Farbstoff in den Fasern identifizieren können.