Name: Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Erfahren Sie optimierte Verarbeitungsmethoden für menschliche Gewebeproben in der translationalen Krebsforschung. Diese Techniken maximieren Datenqualität und -quantität aus begrenztem Material für zuverlässige Ergebnisse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der philanthropischen Beiträge der John G. und Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grants # 0727033) und dem Melanoma Research Alliance unterstützt. Die Autoren danken der University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) für die Koordinierung der Gewebeverteilung und Sammlung und die Erleichterung der translationalen Forschung, wie Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, dem MD Anderson Cancer Center Department of danken, sowie Pathologie und der Melanom-Mond-Schuss-Programm. Schließlich sind die Autoren danken allen Patienten und Familien, die von Melanom betroffen anzuerkennen.

Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wird von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt. 1. Probenbeschaffung <ol><li> Sammeln Forschung Gewebeproben von Tumorüberschuss und damit verbundene normale Gewebe 10-12. Lagern Sie die Proben auf nassem Eis, um Autolyse zu vermeiden. </li><li> Senden Sie alle Gewebe, medizinische Geräte und Fremdkörper während eines chirurgischen Eingriffs an der Abteilung für Pathologie für notwendige Untersuchung entnommen, um eine pathologische Diagnose zu erleichtern. </li><li> Griff Gewebe für die Forschung in Übereinstimmung mit den geltenden Forschung und Gewebebanken Richtlinien und Verfahren zugeordnet. HINWEIS: Biospecimen Sammlung beinhaltet die Koordination der Pathologen, Pathologen Assistenten, histotechnologists und Gewebebeschaffungsspezialisten. </li></ol> 2. Pathologie Qualitätssicherung (QS) <ol><li> Vervollständigen und überprüfen Patientenakten als Früh QA Maßnahme und konsultieren Sie einen Pathologen zu Diagnose pa überprüfentienten Aufzeichnungen (Pathologie Berichten Gewebeschnitten, etc.) und Gewebeproben. Richter Gewebeproben auf morphologische Merkmale von Interesse, wie Prozentsatz der Tumor-Nekrose, Gewebetumor-Schnittstelle, etc. Dies ist in Übereinstimmung mit Biobanken Best Practices 10-12. </li><li> Nach der ersten Überprüfung, führen regelmäßige Überprüfungen von Biobanken Daten und Forschungs Proben während der gesamten Dauer des Aufenthalts der Bioprobe. </li><li> Link Ergebnisse und Anmerkungen von histopathologischen und weitere Untersuchungen zu den Proben und geben diese Daten an die Forscher über eine proprietäre Biobanken-Software-System. HINWEIS: QA Prozesse gewährleistet die Integrität sowohl der klinischen und technischen Aspekte der Biobanken Operationen. </li><li> Führen genetischen und molekularen Tests, um zu überprüfen und zu charakterisieren, die Proben für die klinische Anwendung. </li><li> Sammeln und Daten basierend auf Feedback von Forschern, die mit Hilfe wurden die Proben für Laborversuche zu analysieren. VerfolgenProben mittels Barcode-Technologie. Diese elektronische Tracking-System ist auch in biorespository Best Practices 10-12 befürwortet. </li></ol> 3. Proben / Gewebeverarbeitung <ol><li> So schnell wie möglich immer frische Gewebeproben auf nassem Eis und Prozess zu speichern, um die Änderungen, die durch Extraktion der Gewebeprobe aus seiner natürlichen Umgebung induzierten begrenzen. Prozess normalen tumor abgestimmt und Tumorgewebeproben separat um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. HINWEIS: Basierend auf Forschungsprotokollen kann Bioprobe Verarbeitungs Sammlung von Proben in einem oder mehreren Medientypen beinhalten. </li><li> Vor Beginn des Prozesses, bereiten eine sterile Petrikulturschale, ein Skalpell, sowie eine Nadel oder Pinzette zur Gewebeverarbeitung. Stellen Sie sicher, dass Röhrchen wurden hergestellt, etikettiert und durchgeführt, um Zeit der Probenverarbeitung (Abbildung 2) zu begrenzen gelegt. </li><li> Alle relevanten Gewebe Daten wie Patientenname, Anzahl, Behandlung, DatumChirurgie, und andere relevante Informationen, wie sie für das Studium geeignet sein, sollte in einem institutionellen Gewebedatenbank leicht zugänglich gemacht werden. Begrenzte Patientendaten sollten im Labor auf Papier oder in Tabellenform gehalten werden. ANMERKUNG:. Nur zu sammeln, die für die Art der Forschung, nämlich Bioprobe Informationen biomedizinischen Grundlagenforschung, klinische Forschung, translationale Forschung, usw. Für krankheitsspezifischen Informationen, die Biobanken Mitarbeiter sollten Daten, die von der aktuellen Literatur für notwendig erachtet und Regierungsorganisationen zu sammeln sicherzustellen, die richtige Diagnose und sinnvolle Forschung. Dies umfasst, ist aber nicht an Tumororten und Cancer Staging Informationen. </li><li> Planen alle gewünschten nachfolgenden Experimenten im Voraus auf der Größe der Gewebeschnitte für jeden Typ der Analyse, sowie die Lage der Ausschnitte erforderlich zu entscheiden. Im Idealfall, wenn auch nicht möglich ist, alle Analysen sollten repräsentativ für die gesamte Gewebeschnitt, um die für die Gewebe heterogenei Konto seinty und Grenze Vorspannung der Downstream-Analysen. Legen Sie alle erforderlichen Produkte im Voraus, wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Legen Sie die Gewebeprobe in der offenen Petrikulturschale, flach an der Oberfläche. Hinweis: Lassen Sie nur autorisierte Biobanken Mitarbeiter identifiziert Proben handhaben und zu identifiziereGesundheitsDaten zu überprüfen. Die Ermittler sollten nur die Patientenkennungen wie von den unterzeichneten informierte Zustimmungen dürfen und wie durch den IRB regulierten Zugang. Alle Proben müssen ausreichend gekennzeichnet sein und sollte mindestens ein einzigartiges Gewebe Identifikationsnummer und Gewebetyp gehören. Sind keine PHI in den Etiketten gemäß HIPAA-Vorschriften. </li><li> Überprüfen Sie die Probe von allen Seiten, um ein besseres Verständnis ihrer Struktur und Dimensionen zu gewinnen. Pin der Probe auf den Boden der Schale mit der Nadel, und fahren Sie um das Gewebe entlang der größten und am besten Vertreter Achse halbieren. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück Gewebe und legen Sie sie in einem sterilen 1,5 ml microcentrifuge Rohr 1 ml RNA-Stabilisierungslösung enthält. Kann diese Probe auf Eis für den Rest des Verfahrens eingebracht und bei 4 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. HINWEIS: Bei der Arbeit mit RNA, Schutzhandschuhe sollten immer getragen werden, und RNAse-freier Filterspitzen sollten verwendet werden, um die Chancen des Abbaus und RNA-Kontaminationen zu begrenzen. </li><li> Legen Sie eine offene und pre-markierten Biopsie-Kassette in den Deckel der Petrikulturschale. Schneiden Sie ein Stück Gewebe nicht dicker als 3 bis 5 mm und überträgt es auf der Kassette. Setzen Sie die Kassette in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für mindestens 72 Stunden. Übertragen Sie die Kassette in 70% Ethanol für langfristige Lagerung vor der Paraffineinbettung. HINWEIS: Beschriftung von Kassetten sollten in Bleistift oder mit empfohlenen Marker als Verwendung von Xylol während der Verarbeitung sonst Etiketten zu löschen durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie ein Stück Gewebe und legen Sie sie in einer Gewebeform. Bedecken Sie den Gewebeschnitt im optimalen Schneidtemperatur (OAT) Verbindung, und frieren Sie es sofortbei -20 ° C für Kryoschneiden. Dieser Gewebeschnitt kann bei -20 ° C, bis sie zur Kryoschneiden gespeichert werden. </li><li> Schnitten eine oder mehrere Gewebestücke und übertragen sie in ein 50 ml Röhrchen mit MACS-Puffer (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 0,5% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) für die nachfolgende Durchflusszytometrieanalyse . Für die Durchflusszytometrie können größere Proben zu bevorzugen sein, wie Zellen können während der Tumor Dissoziation, Zell Fixierung und Permeabilisierung verloren, wenn erforderlich. Allgemeiner kann dieser Abschnitt am Ende entnommen werden, sobald die noch andere Stücke verarbeitet wurden. Übrig gebliebenen kann repräsentativ Tumorprobe für die Durchflusszytometrie verwendet werden. Gegebenenfalls kann diese Röhrchen bei 4 ° CO gespeichert / N oder zur durchflusszytometrischen Färbung unmittelbar nach der Spaltung in eine Zellsuspension (siehe Schritt 4 - Durchflusszytometrischer Färbung) verwendet. </li><li> Geschnitten restliche Gewebe in Stücke nicht größer als eine maximale Größe von 0,5 mm x 0,5 mm und sie auf kryogeneFläschchen für sofortige Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Diese Schnapp gefrorenen Proben kann verwendet werden für zukünftige Analysen und kollaborative Zwecke. HINWEIS: Besondere Sorgfalt sollte beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff als direkten Kontakt können schwere Verletzungen verursachen genommen werden. Augen sollten mit Schutzbrille mit Seitenschutz oder mit einem Gesichtsschutz geschützt werden. Kryo-Handschuhe auch getragen werden, um von flüssigem Stickstoff Verbrennungen durch Spritzwasser und direkter Kontakt zu schützen. Handschuhe sollten richtig passen, aber locker genug sein sollte, um schnell mit flüssigem Stickstoff splash in sie entfernt werden. </li></ol> 4. Durchflusszytometrische Färbung <ol><li> Gewebehomogenisierung <ol><li> Vorbereitung Digestionsmedium mit DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) und Kollagenase I (2 mg / ml). Platzieren frisch oder O / N-gespeicherten Tumor in MACS-Puffer in dem Deckel einer Petrischale, und tauchen mit Digestionsmedium. HINWEIS:. Unterschiedliche Aufschlussmethoden existieren, die jeweils mit Vorteilen (zB Zelloberflächenprotein abpression, Lebensfähigkeit). Stellen Sie sicher, die richtige Methode für Ihr gewünschtes nachgeschalteten Anwendung haben. </li><li> Pin Tumor zum Boden der Schale mit einer Nadel und geschnitten von der Außenseite mit einem Skalpell zu zentrieren, bis der Tumor hat eine pastenartige Textur. Bringen Tumor Mischung in ein 50-ml-Tube, Dichtung und legen Sie in einem Plastikbeutel, um Lecks zu vermeiden. Überführungsrohr in einen Inkubator, und drehen bei 225 RPM, 37 ° C, 1 h. </li><li> Filter Tumorzellsuspension durch ein 70 um Zellsieb. Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g, 4 ° C, 5 min. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M Stamm EDTA, 10 ml FCS oder FBS). </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren in einer Konzentration von 1x10 &amp; sup7; Zellen / ml. Transfer 100 ul pro Vertiefung (10 6 Zellen) in einer 96-Well-Rundbodenplatte für die Färbung. </li></ol></li><li> Lebensfähigkeit und Antikörper-Färbung <ol><li> Fügen Sie 200 ul der Lebensfähigkeit Fleckenlösung in jede Vertiefung und mischen. IncuBeize für 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. Spin down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. </li><li> In Antikörpermischung bei empfohlenen / titriert Konzentration (nach Hersteller) für die Oberflächenantigene in 200 ul FACS-Puffer. Inkubieren Zellen bei 4 ° C, 30 min, in der Dunkelheit. Spin down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. </li><li> Mit 200 ul FACS-Puffer waschen, Spin-down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. Die Zellen in 200 ul FACS-Puffer, und fahren Sie Durchflusszytometer zur Erfassung und Analyse fließen. HINWEIS: Bei der Durchführung der intrazellulären Durchflusszytometrie Färbung, führen Fixierung und Permeabilisierung Schritte und intrazelluläre Färbung zwischen den Schritten 4.2.2 und 4.2.3. Wenn die Durchführung Zytokin-Färbung sollte Zellen voraktivierten vorhergehenden Färbung wie empfohlen und ein Inhibitor der intrazellulären Proteintransport und Sekretion wie Monensin sollten bei der Aktivierung verwendet werdensicherzustellen Eigentums lösliche Faktoren. Fixierte Zellen können kurzfristige (eine Woche) bei 4 ° C im Dunkeln nach der Akquisition mit einem Durchflusszytometer gespeichert werden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li>
<li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).</li>
<li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li>
<li>Woolf, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+translational+research+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The meaning of translational research and why it matters.</a> JAMA. 299, 211-213 (2008).</li>
<li>Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockbank%2C+KG+%22Advances+in+Biopreservation%22">Advances in Biopreservation</a>. , 157-159 (2006).</li>
<li>Bulmer, M. The ethics of social research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBulmer%2C+M+%22Researching+social+life%22">Researching social life</a>. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).</li>
<li>Penslar, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPenslar%2C+RL+%22IRB+guidebook%22">IRB guidebook</a>. , US Government Printing Office. (1993).</li>
<li>Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25">http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25</a> (2011).</li>
<li>HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm">http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm</a> (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MD+Anderson+Cancer+Center+Institutional+Tissue+Bank+Standard+Operating+Procedures%22">MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures</a>. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).</li>
<li>Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf">http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf</a> (2011).</li>
<li>NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf">http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf</a> (2011).</li>
<li>Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li>
<li>Chung, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li>
<li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li>
<li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li>
<li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li>
<li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+thermodynamic+stability+of+DNA%2C+RNA%2C+and+DNA%3ARNA+hybrid+duplexes%3A+relationship+with+base+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Letztlich müssen die Verfahren zur Verarbeitung von durch die gewünschte Hypothese diktiert und erwarteten technischen Assays (Figur 1) ausgeführt werden kann. Der folgende Abschnitt dient als Überblick über potenzielle Assays, die auf solchen Gewebeschnitten durchgeführt werden können, zu beschreiben. Es ist keineswegs eine erschöpfende Übersicht, sondern soll Führungsprobenverarbeitungsmethoden und Wahl der Downstream-Assays mit der Beschreibung Techniken und Listing ihre Stärken und Schwächen zu helf...

Medizinische Forschung immens aus dem Studium der sowohl menschliche Zelllinien und Tiermodellen profitiert. Zelllinien ermöglichen eine bessere Steuerung der Komponenten in einem System, sowie die Verwendung von Zellen aus dem richtigen Organismus. Arbeiten mit menschlichen Zellen, während repräsentativer, präsentiert eine drastisch vereinfacht Momentaufnahme der Mechanismen, die für die Gesundheit und Krankheit verantwortlich sein können, denn Zelllinien möglicherweise nicht die Auswirkungen von anderen Zellen, Stromazellen Komponenten und Organe, die Reaktionen 1 auswirken können rekapitulieren. Auf der anderen Seite, Tiermodelle, die aber nicht völlig genau bei der Wiedergabe menschlicher Erkrankungen und genetische Heterogenität bieten weitere Einsicht, indem für die Eingabe von ganzen Tiersystemen in den meisten Modellen 2,3. Mängel beiseite, beide Methoden haben ihre Vorteile und ergänzen. Allerdings bleibt das Hauptziel, die menschliche Zellen und Organen, in einem vollen Körper, Multi-Organ-System zu studieren. Dementsprechend hat der translationalen Forschung taken große Fortschritte bei der Erleichterung der Untersuchung von menschlichen Organen und Geweben von Patienten extrahiert werden, um besser zu verstehen, die Mechanismen zugrunde liegenden Krankheit. Translationale Forschung bietet den Vorteil, das Studium der Folge der Behandlungen und Krankheiten in der gesamten Körper und in geeignete Zellen, wodurch das Beste aus beiden Welten zwischen Zell- und Tier Arbeiten 4. Translationale Forschung ist auch nicht ohne Mängel. Geernteten Proben von menschlichen Patienten, bei der Entnahme aus dem Host sofort auf Ischämie und andere externe Faktoren, aus denen sie sonst geschützt unterzogen. Dies kann zu Stress-induzierten molekularen und genetischen Veränderungen führen und verursachen Verzerrungen bei der nachfolgenden Studien. Daher wurde viel Mühe in Gewinnung und Verarbeitung Gewebe durch strenge Methoden zur Organ- und Zellintegrität zu bewahren besten für nachgelagerten Studien 5 gesetzt. Wichtig ist, dass zukünftige Anwendungen eng bei der Auswahl von Methoden o berücksichtigt werdenf Verarbeitung menschlichen Proben, wie bestimmte Methoden können sich negativ auf zelluläre Komponenten und Signalwege bei der Sparsamkeit andere. Für jede Forschung mit menschlichen Geweben, müssen Regulierungsfragen angesprochen werden. Nach den Tuskegee und Belmont Berichte gab es eine wachsende Akzeptanz der Tatsache, dass die biomedizinische Forschung wurde mit inhärenten Risiken häufig zu unvermeidbaren ethischen Dilemmata 6 verbunden. Das Bedürfnis nach nationalen Standards erkannt wurde und die Bundesregierung erstellt Institutional Review Boards (IRBs) als Mittel, um die Prinzipien der Belmont Bericht zu wahren (Achtung der Personen, Wohltätigkeit, Justiz). IRB jeder Institution ist ein Ausschuss von Ärzten, Forschern und Mitgliedern der Gemeinschaft für den Schutz der Studienteilnehmer verantwortlich sind. Es erfordert, dass freiwillige Zustimmung aller Teilnehmer der biomedizinischen Forschung Studien erhalten werden kann, und dass diese Zustimmung in einer informierten Einwilligung fo dokumentiert werden<html> rm. Die Einwilligungsprozess zielt darauf ab, eine angemessene Information an einen Teilnehmer bereitzustellen, so dass eine fundierte Entscheidung treffen können, ob oder nicht, in einer Studie aufnehmen, oder die Teilnahme fortsetzen werden. In diesem Zusammenhang muss die Einwilligungsdokument gute Lesbarkeit und sollte in der Sprache, die leicht von der Zielgruppe verstanden werden kann (6. bis 8. Klasse Leseniveau) geschrieben werden. Die Möglichkeit, Nötigung oder unzulässigen Beeinflussung minimiert werden müssen, und das Thema muss ausreichend Zeit gegeben, um die Teilnahme zu erwägen. Der Teilnehmer muss außerdem die Möglichkeit haben, ihr Recht auf Zustimmung zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verlaufs der Studie ohne Strafe zurückziehen auszuüben. Freiwillige Einwilligung nach Aufklärung ist eine obligatorische Voraussetzung für die Teilnahme einer Person in der Forschung und es ist auch rechtswirksam 7. Gemäß den Vorschriften für den Schutz der menschlichen Probanden 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), muss die Studienteilnehmer der Zweck der Untersuchung informiert werden, die Verfahren in der Forschung, Alternativen zur Teilnahme Alle erkennbaren Risiken und Beschwerden (einschließlich nicht nur zu Verletzungen, sondern auch psychologische, soziale oder wirtschaftliche Schaden, Beschwerden oder Unannehmlichkeiten), Nutzen der Forschung für die Gesellschaft und gegebenenfalls für den Einzelnen, wie lange das Thema wird erwartet, zu beteiligen, Person, die Antworten auf Ihre Fragen oder im Falle eines Forschungsbedingten Verletzungen oder Notfall, die Erklärung, dass die Teilnahme freiwillig zu kontaktieren und dass die Weigerung zur Teilnahme werden nicht in irgendwelche Folgen oder den Verlust von Leistungen wie einen Kompromiss in regelmäßigen klinischen Versorgung führen dass die Teilnehmer sonst berechtigt, als Ergebnis seiner / ihrer Diagnosen eine Erklärung über das Recht des Patienten auf Vertraulichkeit und Recht, von zurückzutreten erhalten, und schließlichdie Studie jederzeit ohne Folgen. Gewebeproben von Teilnehmern, die im Verlauf der Studie Einwilligung widerrufen sollte nicht angeschüttet werden und muss sofort verbraucht werden. Verzicht auf eines oder mehrere Elemente der Einwilligung kann von dem IRB für einige Forschungsprojekte, die in der Praxis nicht ohne eine Änderung der benötigten Elemente oder für Untersuchungen, bei denen erforderlichen Elemente sind nicht anwendbar getan werden konnte, erhalten werden. Muss darauf geachtet werden, um die Vertraulichkeit der Daten zu gewährleisten. Der Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) ist ein Bundesgesetz, das der Nutzung oder Offenlegung &quot;geschützte Gesundheitsdaten&quot; (PHI) ohne schriftliche Genehmigung von den Teilnehmern verhindert. PHI umfasst, ist jedoch nicht zu Gesundheitsinformationen übertragen lassen oder in irgendeiner Form oder Medium und enthält Felder, die verwendet werden könnten, um eine individuelle Identifizierung 9 begrenzt. Durch diese Arbeit wollen wir das Protokoll, die während tissu befolgt werden müssen skizzierene Verarbeitung - einschließlich der Beschaffung und Lagerung und betonen, wie wichtig die folgenden strengen Richtlinien, um die Verzerrungen, die durch die Spannungen ein Gewebe, auf Extraktion unterworfen führen können, zu minimieren. Wir bemühen uns auch um eine kurze Übersicht über die nachgeschaltete Tests oder Analysen (Abbildung 1), die auf solchen Proben durchgeführt werden könnte, so dass Leser können eine qualifizierte Entscheidung über welche Assay (n) am besten ihren Bedürfnissen zu machen.

<table><tbody><tr><td>Nadeln</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpelle</td><td>aus Edelstahl Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Biopsiekassetten</td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>RNA-stabilisierende Lösung</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Röhrchen</td><td>Phenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Tuben Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>StatLab Medical Products</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>Formalinbehälter</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur Lösung (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m Zellsiebe</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 Well runde Bodenplatten</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Lebende/Tote Fleckenlösung</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

arbeiten mit menschlichen geweben für translationale krebsforschung

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medizinische Forschung zum Nutzen des Menschen wird durch die Notwendigkeit menschlicher Gewebe und Probanden stark behindert. Bei der Einholung der Zustimmung für menschliche Proben müssen wertvolle Proben jedoch mit größter Sorgfalt behandelt werden, um die Integrität von Organen, Geweben und Zellen in höchstem Maße zu gewährleisten. Leider erfordert die Gewebeverarbeitung per definitionem die Extraktion von Geweben aus dem Wirt, eine Veränderung, die großen zellulären Stress verursachen und große Auswirkungen auf nachfolgende Analysen haben kann. Diese Spannungen könnten dazu führen, dass die Probe nicht mehr repräsentativ für die Stelle ist, an der sie entnommen wurde. Daher muss bei der Verarbeitung dieser Proben ein strenges Protokoll eingehalten werden, um die Repräsentativität zu gewährleisten. Der/die gewünschte(n) Assay(s) muss ebenfalls berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass eine optimale Technik für die Probenverarbeitung verwendet wird. Hier wird ein Protokoll für die Gewebegewinnung, -verarbeitung und verschiedene Analysen skizziert, die an aufbereitetem Gewebe durchgeführt werden können, um die nachgelagerte Produktion von begrenzten Gewebeproben zu maximieren.

<html> Die Ergebnisse angezeigt unten zeigen Durchflusszytometrie Gating-Strategie für die breite Immun Phänotypisierung auf einem verarbeiteten Melanomtumor. Der Tag der Färbung wurde Gewebeprobe unter 225 RPM Dreh verdaut und homogenisiert mit Collagenase I und DNase I Inkubation für 60 min bei 37 ° C. Nach dem Verdau wurde die Zellsuspension durch ein 70 um Sieb filtriert, um Zelltrümmer zu beseitigen, und die Zellen wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern Durchflusszytometrie für die Immunzelle Phänotypisierung ...

Translationale Krebsforschung ist auf die Extraktion von menschlichem Gewebe angewiesen. Viel Arbeit wurde in die Optimierung der Extraktionsmethoden für die ex vivo-Analyse gesteckt. Hier beschreiben wir Gewebeaufbereitungsmethoden, die eine maximale Datenausgabe aus begrenzten Proben ermöglichen.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Qualität und Umfang der aus Gewebeproben gewonnenen Daten zu maximieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der translationalen Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise welche Mutationen vorliegen, welche Signalwege aktiviert sind und welche Untergruppen von Immunzellen menschliche Tumore infiltrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine große Menge an Daten aus einer einzigen chirurgischen Resektion menschlichen Gewebes generiert werden kann.Einer der wichtigsten Schritte vor der Probenvorbereitung ist die Sicherstellung der Probenqualität und die Validierung der Anwesenheit von lebensfähigem Tumorgewebe durch eine pathologische Beurteilung, wie im Protokolltext beschrieben. Alle relevanten Informationen zur Probe oder zum Gewebe, wie Patientenname, -nummer, Behandlung und Operationsdatum, sollten in einer institutionellen Gewebedatenbank leicht zugänglich gemacht werden. Frische Gewebeproben sollten stets auf nassem Eis aufbewahrt und so schnell wie möglich verarbeitet werden, um Veränderungen, die durch die Entnahme der Gewebeprobe aus ihrem natürlichen Milieu entstehen, zu begrenzen. Normales, tumormatchendes und Tumorgewebeproben sollten getrennt verarbeitet werden.Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, bereiten Sie eine sterile Petrischale, ein Skalpell sowie eine Nadel oder Pinzette für die Gewebeverarbeitung vor. Um die Bearbeitungszeit der Probe zu begrenzen, legen Sie im Voraus alle benötigten Gegenstände wie hier dargestellt bereit. Legen Sie die Gewebeprobe flach in die offene Petrischale auf die Unterlage. Untersuchen Sie die Probe aus allen Blickwinkeln, um ihre Struktur und Abmessungen besser zu verstehen. Befestigen Sie die Probe mit der Nadel am Boden der Petrischale und schneiden Sie das Gewebe entlang seiner größten und repräsentativsten Achse in zwei Hälften. Schneiden Sie ein kleines Stück Gewebe heraus und geben Sie es in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das ein Milliliter RNA-Stabilisierungslösung enthält.Stellen Sie diese Probe für den Rest des Verfahrens auf Eis und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt wird. Legen Sie eine offene und vorab beschriftete Biopsiekassette auf den Deckel der Petrischale. Schneiden Sie eine Gewebeprobe mit einer Dicke von nicht mehr als drei bis fünf Millimetern aus und überführen Sie sie in die Kassette.Stellen Sie die Kassette für mindestens 72 Stunden in 10 % gepuffertes neutrales Formalin. Schneiden Sie bei Raumtemperatur ein Gewebestück aus und legen Sie es in eine Gewebekassette. Bedecken Sie den Gewebeschnitt mit einer optimalen Schneidtemperatur-Verbindung und frieren Sie ihn sofort bei minus 20 Grad Celsius ein, bis er zur Kryoschnittherstellung bereit ist.Schneiden Sie ein oder mehrere Gewebestücke aus und überführen Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das Max-Puffer enthält. Das Gewebe kann frisch verwendet oder über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert werden, um eine Durchflusszytometrie-Analyse durchzuführen. Schneiden Sie den Rest des Gewebes in Stücke, die nicht größer als 0,5 Millimeter mal 0,5 Millimeter sind, und überführen Sie diese in kryogene Röhrchen.Gefrieren Sie die Gewebe sofort in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung ein. Bereiten Sie zur Durchführung dieses Verfahrens ein Verdauungsmedium mit DM EMD NS one und Kollagenase vor. Geben Sie ein frisches oder über Nacht gelagertes Tumorstück in max-Puffer in den Deckel einer Petrischale und übergießen Sie es mit dem Verdauungsmedium.Nehmen Sie den Tumor mit einer Nadel am Boden der Schale fest und schneiden Sie mit einem Skalpell von außen nach innen, bis der Tumor eine pastöse Konsistenz aufweist. Überführen Sie das Tumorgewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen und verschließen Sie das Röhrchen, um Leckagen zu vermeiden. Stellen Sie das Röhrchen in einen Inkubator und schütteln Sie es eine Stunde lang bei 225 U/min und 37 °C.Nach einer Stunde filtrieren Sie die Tumorzellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Zellfilter, zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 ×g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter Fax-Puffer. Nach der Bestimmung der Zellzahl mit einem Hämozytometer resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter.Übertragen Sie 100 Mikroliter oder 106 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Rundbodenplatte. Geben Sie 200 Mikroliter der Vitalitätsfärbungslösung zu jeder Vertiefung hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nach 30 Minuten werden die Zellen fünf Minuten bei 250 × g und vier Grad Celsius abzentrifugiert.Den Überstand abpipettieren. Die Antikörpermischung in einer empfohlenen titrierten Konzentration für Oberflächenantigene in 200 µL Fax-Puffer hinzufügen. Die Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten und saugen Sie den Überstand ab. Waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Fax-Puffer und zentrifugieren Sie erneut. Saugen Sie danach den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Fax-Puffer. Die Zellen sind nun bereit für die Analyse per Durchflusszytometrie. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen die Gating-Strategie der Durchflusszytometrie für eine umfassende Immunphänotypisierung an aufbereiteten Melanomtumorproben, die wie dargestellt aufbereitet und über Nacht in Max-Puffer bei vier Grad Celsius gelagert wurden, wobei eine äußerst geringe Mortalität beobachtet wurde.Außerdem wird die Gewebeverarbeitung demonstriert. Ermöglicht eine multicolorfähige, umfassende Phänotypisierung von Immunzellsubpopulationen im Melanom, wie B-Zellen, CD-vier-T-Zellen, CD-acht-T-Zellen, Gamma-delta-T-Zellen und K-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen, Basophile, Neutrophile und Eosinophile, sobald die Methode beherrscht ist. Diese Technik kann innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie korrekt angewendet wird.

working-with-human-tissues-for-translational-cancer-research

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Eingehende Analysen von Krebszellproteomen erleichtern die Identifizierung neuer Wirkstoffziele und diagnostischer Biomarker. Wir beschreiben einen experimentellen Workflow zur quantitativen Analyse von (Phospho-)Proteomen in Krebszell-Subpopulationen, die aus flüssigen und festen Tumoren stammen. Dies wird durch die Kombination von zellulären Anreicherungsstrategien mit quantitativer Super-SILAC-basierter Massenspektrometrie erreicht.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

Biobank für translationale Medizin: Standardarbeitsanweisungen für optimales Probenmanagement

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur schnellen Dissoziation von menschlichen und Maustumorproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Dissoziation von humanen und Maus-Tumorgewebeproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Eine einzigartige Methode zur chirurgischen Entfernung von oralen Plattenepithelkarzinomtumoren, die in der Mundhöhle etabliert wurden, wird hier gezeigt.

Translational relevantes Tumorresektionsmodell für murine präklinische Modelle des oralen Plattenepithelkarzinoms

Erfahren Sie optimierte Verarbeitungsmethoden für menschliche Gewebeproben in der translationalen Krebsforschung. Diese Techniken maximieren Datenqualität und -quantität aus begrenztem Material für zuverlässige Ergebnisse.

Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung

Weitere Videos entdecken