Name: Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte DNA-Extraktion aus FFPE-Referenzstandard-Zelllinien und die digitale Droplet-PCR zur Detektion von BRAF V600E-Mutationen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Analyse seltener Mutationen in der molekularen Onkologie.

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Diese Arbeit wurde von der F &amp; E-Programm für die Gesellschaft der National Research Foundation (NRF), durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Grant No 2013M3C8A1075908) finanziert unterstützt.

1. DNA-Extraktion aus FFPE Reference Standard-Zelllinien Hinweis: Bei diesem Verfahren wurde die DNA-Extraktion aus FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) unter Verwendung der FFPE Gewebe-DNA-Isolation Kit, wie in der unten beschriebenen Protokoll durchgeführt. Automatisierte DNA-Extraktion wurde nach Angaben des Herstellers für die gesamte DNA-Isolierung erreicht. <ol><li> Verwendung eines Mikrotoms und die ursprüngliche FFPE Block manuell frische Abschnitte vor der DNA-Extraktion und Analyse vorzubereiten, nach festgelegten Verfahren. Dass die Probe-Eingang für den Gewebeabschnitt (en) analysiert nicht eine kombinierte Gesamtdicke von 10 &amp; mgr; m überschreitet und die Fläche nicht 600 mm 2 für einen einzigen Abschnitt überschreiten. </li></ol> 1.2 TPS-Protokoll Hinweis: Die in Tabelle 1 angegebenen Mengen entsprechen der erforderlich ist, um 48 Proben zu verarbeiten Minimum, und das Verfahrendargestellt ist in Übereinstimmung mit den TPS-Richtlinien. Vor dem Start des Experiments nieder die FFPE-Proben in der E-Rohr durch Zentrifugation bei 600 · g, um den Verlust von Proben während der automatisiertes Programm zu vermeiden. <ol><li> Schalten Sie die automatisierte DNA-Isolierung Instrument und Computer. Öffnen Sie den Run Steuerungssoftware und legen Sie eine automatische Last Fach in den TPS-Deck Ladefläche. </li><li> Verzichtet Reagenzien in die entsprechenden Rinnen wie in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Legen Sie die 4 Proben (BRAF-WT, BRAF V600E 50%, 5% und 1%) in den Probenträger-Racks. </li><li> Setzen Sie die Spitze-Boxen in den Trögen in den Spalten 2 und 3 und überprüfen Sie die Tipps für die Anwesenheit von mehr als einem Filter pro Spitze, die den Lauf abbrechen wird. </li><li> Stellen Sie sicher, die richtige Mischung des Lysepuffer und Waschpuffer durch Umdrehen sie 3-5 mal und laden Sie sie in die entsprechenden Mulden in Spalte 4 (Abbildung 1). </li><li> Nach Invertierung für einige Male oder mild vortExing, laden Sie das Elutionspuffer, magnetische Kügelchen, und FFPE-Puffer in den kleinen Mulden in Spalte 5, wobei 1-Slot leer ist, wo angegeben (Abbildung 1, Tabelle 1). </li><li> Legen Sie eine 2 ml Deep Well Platte (DWP) auf den Plattenträger (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Führen Sie die folgenden letzten Schritte vor dem Start eines Lauf: <ol><li> Uncap alle Rohre und Reagenzien Tröge. Bestätigen Sie, dass ausreichende Kapazitäten in der flüssigen Abfallflasche erhältlich. Bestätigen, dass die Abfallflasche leer ist und mit einem Biohazard Tasche ausgekleidet. Bestätigen Sie, dass die Spitze Auswurfplatte wird in der Abfalleinheit zentriert ist. </li><li> Schließen Sie die vordere Abdeckung. </li></ol></li><li> Starten Sie die Software. Öffnen Sie die NA_Prep_Main_MLSTARlet.med Datei. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Der Gerätestatus wird vom Leerlauf zum Laufen wechseln. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Proben für diesen Lauf. Wählen Sie die gewünschte Methode für diesen Lauf (DNA = 0). Geben Sie die Position des ersten Hoch volume Spitze, die Auswahl von &quot;1&quot;, wenn alle Fächer voll sind. Geben Sie die Position des ersten Standard-Volumenspitze, die Auswahl von &quot;1&quot;, wenn alle Fächer voll sind. Hinweis: Das Gerät wird dann durch automatisierte Schritte laufen ohne Benutzereingriff. Eine detaillierte Arbeitsablauf ist in Abbildung 2 dargestellt. Wenn das Experiment beendet ist, werden Reagenz Abfälle und Tipps in den Abfallanordnung injiziert. </li><li> Quantifizierung gereinigter genomischer DNA unter Verwendung eines fluorometrischen Verfahrens. Anmerkung: DNA-Proben, die eine Mindestkonzentration von 3,3 ng / &amp; mgr; l enthalten, werden ddPCR Analyse (Teil 2) unterworfen. </li></ol> 2. DNA-Mutation Profilierung: ddPCR Protocol Hinweis: Das Protokoll für DNA-Mutation Profilierung aus 3 Hauptschritten: 1) Tröpfchenerzeugung, 2) Konventionelle PCR-Amplifikation, 3) Tröpfchen Lesen und 4) DNA-Mutation Profilierung. 2.1. Tröpfchenerzeugung Hinweis: ddPCR Supermix istempfohlen für ddPCR, da diese Mischung enthält Reagenzien für Tröpfchenerzeugung erforderlich. <ol><li> Um Verunreinigungen zu vermeiden, befolgen Sie Standard-Sicherheitsvorkehrungen, wie das Tragen von Handschuhen, mit einem sauberen PCR Haube, saubere Pipetten und low-Protein-bindenden Rohre. </li><li> Sicherzustellen, daß die Mindestkonzentration von humanen genomischen DNA-Probe beträgt 3,3 ng / ul. Anmerkung: Die Menge an gereinigter DNA-Probenkonzentration wird auf der Analyse% Mutationsfrequenz Detektions variieren. </li><li> Montieren Reaktionsmischungen in 96-Well-PCR-Platten. Auftauen und ins Gleichgewicht die Reaktionskomponenten auf RT. Bereiten PCR-Reaktionen durch die Kombination von 2X ddPCR Supermix (10 ul) und 20 Primer (vorwärts und rückwärts, 900 nM) und Sonde (250 nm) mit jedem gereinigten DNA-Probe (66ng / 2 ul) machen bis zu 20 &amp; mgr; l mit destilliertem Wasser (als pro Tröpfchenerzeugers Protokoll) </li><li> Vortexen Mischung gründlich bis zur Homogenität und kurz zentrifugieren, sicherzustellen, um den Inhalt am Boden des Rohres vor der Ausgabe zu sammeln. Last 20 &amp; #181; l auf die Kartusche für die Tröpfchenbildung. </li><li> Betrieb des Tropfengenerators, der nach Hersteller empfohlenen Protokoll <ol><li> Setzen Sie die Patrone in den Halter mit der Kerbe in der Patrone auf der oberen linken Seite des Halters positioniert. In 20 ul Reaktionsmischung, die Proben in der Mitte, und 70 &amp; mgr; l-Generator Öl in den Boden Brunnen. </li><li> Bringen Sie die Dichtung auf der Oberseite der Patrone. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung fest eingehakt an beiden Enden des Inhabers; andernfalls wird ein ausreichender Druck zur Tropfenerzeugung nicht erreicht werden. </li><li> Öffnen Sie den Tropfengenerator durch Drücken der grünen Taste auf der Oberseite des Gerätes und setzen Sie die Patrone. Wenn der Halter in der richtigen Position, sowohl die Leistung (links nach rechts) und Halter (Mitte rechts) leuchtet grün. </li><li> Drücken Sie die obere Taste auf dem Gerät erneut, um die Tür zu schließen und zu initiieren Tropfenerzeugung. Hinweis: Nach dem Drücken der button, einem Verteiler positioniert sich über die Austrittsbohrungen, Ziehöl und Proben durch die mikrofluidischen Kanälen, in denen Tröpfchen erzeugt werden. Droplets fließen in den Tröpfchen gut, wo sie akkumulieren. Die Tröpfchenkontrollleuchte (rechts) blinkt grün, nach 10 Sekunden, um anzuzeigen, dass Tropfenerzeugung ist im Gange. </li><li> Wenn Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, wechseln alle 3-Anzeige leuchtet dauerhaft grün; öffnen Sie die Tür durch Drücken der Taste, und nehmen Sie die Halterung vom Gerät ab. Entfernen Sie die Einwegdichtung aus der Halterung und entsorgen Sie sie. Hinweis: Die oberen Vertiefungen der Patrone enthalten, Tröpfchen, und die mittleren und unteren Brunnen sind fast leer, mit einer kleinen Menge an Restöl. </li></ol></li></ol> 2.2. Vorbereitung für die PCR <ol><li> Für jede Probe pipettieren Sie 40 ul der Tröpfchen Inhalt von oben auch die Patronen in einer einzigen Vertiefung einer empfohlenen 96-Well-PCR-Platte wie in Instrumentenprotokoll des Herstellers angegeben. Neinte: Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette ist ideal zum Übertragen der Tröpfchen Emulsionen. Langsam und sanft Aspiration von Tröpfchen wird empfohlen, Tropfenscher bei der Übertragung zu minimieren. </li><li> Verschließen Sie die PCR-Platte mit Folie sofort nach dem Übertragen von Tröpfchen, um Verdunstung zu vermeiden. Verwenden durchstechbare Folie Platte Dichtungen, die mit dem PCR Abklebefolie und den Nadeln in der Tröpfchen Reader kompatibel sind. Folgen Sie den Anweisungen in der PCR-Plattenversiegelung Gebrauchsanleitung. </li><li> Stellen Sie die Plattenversiegelung Temperatur bis 180 ° C und die Zeit, um 5 Sek. </li><li> Tippen Sie auf den Pfeil, um das Fach Tür zu öffnen. Positionieren Sie den Trägerblock auf dem Tablett mit dem 96-Loch-Seite nach oben. Legen Sie die 96-Lochplatte auf dem Trägerblock und sicherzustellen, dass alle Plattenvertiefungen werden mit dem Trägerblock ausgerichtet ist. </li><li> Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit 1 Blatt durchstechbare Foliendichtung. Sobald die 96-Lochplatte auf dem Trägerblock befestigt ist und mit dem durchstechbaren Siegelfolie abgedeckt, berühren Sie die Dichtung Taste. Die Schublade wird geschlossenund Heißsiegeln wird zu initiieren. </li><li> Beim Heißsiegeln abgeschlossen ist, öffnet sich die Tür automatisch; entfernen Sie die Platte aus dem Wärmeblock für Temperaturwechsel und dann den Wärmeblock. </li><li> Sicherstellen, dass alle Vertiefungen in der Platte werden durch Überprüfen, dass Vertiefungen in der Folie gibt über jedem offensichtlich gut abgedichtet. Einmal versiegelt ist die Platte bereit für thermische Zyklen. </li><li> Sobald Tröpfchen entfernt werden, drücken Sie die Verriegelungen an den Patronenhalter, um sie zu öffnen. Entfernen Sie die leere Kartusche und entsorgen Sie sie. </li><li> Führen herkömmliche PCR-Amplifikation durch Befolgen der in Tabelle 2 beschriebenen Parametern. </li></ol> 2.3 Droplet Lesung (gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll) Anmerkung: Nach der PCR-Amplifikation der Zielnukleinsäure in den Tröpfchen, analysiert die Tröpfchenleser Instrument jedes Tröpfchen einzeln mit einem 2-Farbdetektionssystem 13. Wir in der Regel eingestellt, um eine FAM erkennend VIC Reporter Fluorophore. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;System spülen&quot; prime die Tröpfchen Leser und machen sie bereit für ddPCR Analyse. </li><li> Legen Sie die Platte in die Tröpfchen Leser und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Der Tröpfchen Leser saugt jede Probe, die vereinzelt Tropfen und Ströme sie im Gänsemarsch vorbei an einer 2-Farben-Detektor. Der Detektor liest die Tröpfchen auf positive und negative Proben aufzuzählen. </li><li> Wenn Tröpfchen Lesen abgeschlossen ist, die Tür öffnen und die Plattenhalter aus dem Gerät zu entfernen. Entfernen Sie den 96-Well-PCR-Platte aus der Halterung und entsorgen Sie sie. </li><li> Für eine ordnungsgemäße Wartung, ersetzen Sie die Tröpfchen Leser Öl und leeren Sie den Abfallbehälter nach Bedarf. In 50 ml 10% Bleichmittel auf die Abfallflasche, um mikrobielles Wachstum zu verhindern. </li></ol> 2.4 DNA-Mutation Profilierung (gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll) Hinweis: PCR-positiv und PCR-negative Tröpfchen werden gezählt, um absolute quantific liefernation von Ziel BRAF V600E DNA-Mutationen in digitaler Form unter Verwendung der Datenanalyse-Software. <ol><li> Klicken Sie auf Setup, um Informationen über die Proben, Tests und Experimente geben. </li><li> Im Setup-Fenster, laden Sie eine Platte (filename.qlp), klicken Sie dann auf Analysieren Sie zu öffnen und die Daten analysieren. Ergebnisse Tabelle, Well Selector und verarbeiteten Daten / Grafische Darstellung: Die Analyse der Daten-Schnittstelle ist in drei Fenster getrennt. </li><li> In der verarbeiteten Daten-Fenster, Konzentrationsdaten für jedes Ziel werden in den Vertiefungen in der Platte Karte und werden in der Ergebnistabelle aufgeführt. Klicken Konzentration, um Daten in der Konzentration Plots visualisieren. </li></ol>

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<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim und Junge Deug Kim sind Mitarbeiter von ABION CRO.

Hier beleuchten wir die Anwendbarkeit der ddPCR und DNA-Isolierung aus FFPE Referenzstandard Zelllinie Proben für eine bestimmte Genmutation Beurteilung. In dieser Studie wird TPS automatischen DNA-Isolierungsverfahren verwendet werden, der leicht angepasst werden kann, automatisiert, und kann bis zu 48 verschiedene Proben gleichzeitig unterzubringen, so dass für größeren Maßstab Experimente und niedrigere Variabilität. Eine der Beschränkungen der DNA-Isolierung in der vorliegenden Arbeit ist, dass jedes FFPE Probe ist ...

Die Akkumulation von genetischen Mutationen in regulatorischen Schlüsselgenen verändert normalen Zellprogrammierung wie Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben, die zu Krebs führen. 1 Die RAS-RAF-MAP-Kinase-Weg vermittelt zellulären Reaktionen auf Wachstumssignale. Onkogenen BRAF-Mutationen können vom Fahrer Mutationen des BRAF-Gens, der die BRAF oncoprotein verursachen können überaktiven 2 zu werden, zur Folge haben. Mutationen im BRAF-Gen auch in überaktiven nachgeschalteten Signal über MEK und ERK 3, die wiederum führt zu einer übermäßigen Zellwachstum und -proliferation unabhängig Wachstumsfaktor-vermittelten Regulation 4-6 führen. Mehrere Werkzeuge sind für die DNA-Mutation Profilierung zur Verfügung, wie quantitative Echtzeit-BRAF-V600E-Mutationen in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien durch ddPCR. ddPCR ist eine PCR-basierte Methode zur absoluten Quantifizierungbietet eine höhere Genauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) 7,8. ddPCR auch höheren Auflösungsvermögen und die Genauigkeit für die Detektion von seltenen Mutationen in DNA-Matrizen, so dass mehr informative Krebsforschung und Diagnose 9. Weitere Vorteile gegenüber herkömmlichen ddPCR qPCR sind seine verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit bei der Untersuchung niedrigen Vorlage Kopienzahlen 10-12. Hierin ist ein Protokoll für die automatische Extraktion von DNA aus FFPE Referenzstandard Zellinien, gefolgt von der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Mutationen durch BRAF V600E ddPCR demonstriert. Die Verwendung von Software für die Datenanalyse und eine grafische Darstellung der Ergebnisse werden ebenfalls beschrieben. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und hängt von der Anzahl von Proben, die profiliert werden und die Anzahl der konventionellen PCR und ddPCR Maschinen erhältlich völlig. Das folgende Protokoll beschreibt Standardverfahren für die BR<html> AF V600E-positive FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) in einem vollautomatischen Instrument mit Hilfe des Tissue Preparation System (TPS) Protokoll. Anschließend werden isolierte DNA-Proben auf die Anwesenheit von Mutationen unter Verwendung BRAF V600E ddPCR System analysiert. Gezielte Mutation Analyse durchgeführt wird, nachdem alle Proben profiliert und die Daten in der Datenanalyse-Software geladen ist. Abhängig von der Anzahl der Proben / Gruppen untersucht, Datenanalyse kann von einem bis zu mehreren Stunden dauern. Die experimentelle Komponente der Methodik erfordert Genauigkeit bei der Handhabung <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Isolierung von Nukleinsäuren aus Hefe, ein JoVE Science Education Video erklärt mehr über über die Kontext-RNA">DNA</a> undlogischer Pipetten und Pipetten, ein JoVE Science Education Video erklärt mehr über über die Kontext Pipettieren &quot;&gt; Pipettieren in 96-Well-Platten, während der Datenanalyse wird unter Verwendung von Software.

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD-Gerät</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>Automatisiertes DNA-Isolationsgerät</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerator&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Konventionelles PCR-Gerät mit Rampenzeiteinstellung</td><td></td><td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR-Plattenversiegeler</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft-Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Isolationskit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reagenzien für die Gewebevorbereitung Kasten 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reagenzien für die Gewebevorbereitung Box 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE Tipps</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Mutationsanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3010</td><td>2-fache Konzentration</td></tr><tr><td>DG8 Kartusche&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchengeneratoröl</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Dichtung</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchen-Leseöl</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung digitaler droplet pcr zu braf v600e mutationen in formalin-fixierte paraffin reference standard-zelllinien detect

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR ist eine hochempfindliche PCR-Methode, die ein Wasser-Öl-Emulsionssystem verwendet. Mit Hilfe eines Tröpfchengenerators wird eine extrahierte Nukleinsäureprobe in ~20.000 nanogroße Wasser-in-Öl-Tröpfchen aufgeteilt, und die PCR-Amplifikation erfolgt in einzelnen Tröpfchen. Der ddPCR-Ansatz besteht in der Identifizierung von Sequenzmutationen, Veränderungen der Kopienzahl und ausgewählten strukturellen Umlagerungen, an denen Zielgene beteiligt sind. Hier demonstrieren wir den Einsatz der ddPCR als leistungsfähige Technik zur präzisen Quantifizierung seltener BRAF V600E-Mutationen in FFPE-Referenzstandardzelllinien, die bei der Identifizierung von Krebspatienten hilfreich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ddPCR-Technik das Potenzial bietet, die spezifischen seltenen Mutationen in verschiedenen Genen in verschiedenen Arten von FFPE-Proben genau zu profilieren.

Für unsere ddPCR Analyse, untersuchten wir die BRAF-V600E-Mutation FFPE Referenz-Standard-Zelllinien. Die Tröpfchen Leser verbindet sich mit einem Laptop-Computer mit Datenanalyse-Software. Jeder einzelne Tropfen wird auf der Basis der Fluoreszenzamplitude als entweder positiv oder negativ definiert. Die vom Hersteller bereitgestellten Software ermöglicht außerdem ein benutzerdefinierter Grenz eingegeben werden, um den Grenzbereich zwischen der positiven und negativen Tröpfchen zu definieren. Die Anzahl der pos...

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, menschliche genomische DNA aus formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Referenzstandardzelllinien mithilfe eines Gewebepräparationssystems zu isolieren und anschließend die BRAF V600E-Mutationen in der genomischen DNA mittels digitaler Tropfen-PCR zu analysieren. Die digitale Tropfen-PCR (ddPCR) kann helfen, zentrale Fragen in der molekularen Onkologie zu beantworten, beispielsweise die Anwesenheit und Häufigkeit von RAS-Sequenzmutationen sowie die Quantifizierung von Nukleinsäuren bei geringer Vorlagenkopienzahl. Obwohl diese Methode hier an Referenzstandardzelllinien demonstriert wird, kann sie ebenfalls auf andere biologische Proben angewandt werden, wobei jedoch sichergestellt werden muss, dass die Bedingungen für die Isolierung der gewünschten DNA optimiert sind.Mit diesem Gewebeprotektionssystem können innerhalb von vier Stunden bis zu 48 Proben kontaminationsfreier humaner genomischer DNA isoliert werden, verglichen mit anderen manuellen Verfahren. Das System ist für die Probenvorbereitung etwas teuer, da magnetische Kügelchen verwendet werden. Es ist jedoch sicherer und liefert hochwertige Ergebnisse mit hoher

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Die Wildtyp-Blocking-PCR mit anschließender direkter Sequenzierung bietet eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von niederfrequenten somatischen Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Nachweis von zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) aus Blut besteht ein ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Hier beschreiben wir Methoden, die cRNA von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Patienten mit empfindlichen und spezifischen digitalen Polymerase-Kettenreaktion zu charakterisieren. Die Tests treffen Entwurfsanforderungen zu Fusion Varianten innerhalb von 72 Stunden zu erkennen.

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode zur Visualisierung der Genamplifikation in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben.

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Isolierung seltener Krebszellen aus einer künstlichen Probe mit Vollblut und Spitzen in Lungenkrebszellen veranschaulicht. Das Protokoll nutzt eine halbautomatisierte, labelfreie Zellisolationsplattform. Angereicherte Zellen werden anschließend mittels Tropfen-Digital-PCR auf Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors untersucht.

Profilierung von DNA-Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in zirkulierenden seltenen Zellen mittels eines Zellisolationssystems und der digitalen PCR des Tröpfchens

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

Erfahren Sie die automatisierte DNA-Extraktion aus FFPE-Referenzstandard-Zelllinien und die digitale Droplet-PCR zur Detektion von BRAF V600E-Mutationen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Analyse seltener Mutationen in der molekularen Onkologie.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

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