Name: Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte DNA-Extraktion aus FFPE-Referenzstandard-Zelllinien und die digitale Droplet-PCR zur Detektion von BRAF V600E-Mutationen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Analyse seltener Mutationen in der molekularen Onkologie.

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Diese Arbeit wurde von der F &amp; E-Programm für die Gesellschaft der National Research Foundation (NRF), durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Grant No 2013M3C8A1075908) finanziert unterstützt.

1. DNA-Extraktion aus FFPE Reference Standard-Zelllinien Hinweis: Bei diesem Verfahren wurde die DNA-Extraktion aus FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) unter Verwendung der FFPE Gewebe-DNA-Isolation Kit, wie in der unten beschriebenen Protokoll durchgeführt. Automatisierte DNA-Extraktion wurde nach Angaben des Herstellers für die gesamte DNA-Isolierung erreicht. <ol><li> Verwendung eines Mikrotoms und die ursprüngliche FFPE Block manuell frische Abschnitte vor der DNA-Extraktion und Analyse vorzubereiten, nach festgelegten Verfahren. Dass die Probe-Eingang für den Gewebeabschnitt (en) analysiert nicht eine kombinierte Gesamtdicke von 10 &amp; mgr; m überschreitet und die Fläche nicht 600 mm 2 für einen einzigen Abschnitt überschreiten. </li></ol> 1.2 TPS-Protokoll Hinweis: Die in Tabelle 1 angegebenen Mengen entsprechen der erforderlich ist, um 48 Proben zu verarbeiten Minimum, und das Verfahrendargestellt ist in Übereinstimmung mit den TPS-Richtlinien. Vor dem Start des Experiments nieder die FFPE-Proben in der E-Rohr durch Zentrifugation bei 600 · g, um den Verlust von Proben während der automatisiertes Programm zu vermeiden. <ol><li> Schalten Sie die automatisierte DNA-Isolierung Instrument und Computer. Öffnen Sie den Run Steuerungssoftware und legen Sie eine automatische Last Fach in den TPS-Deck Ladefläche. </li><li> Verzichtet Reagenzien in die entsprechenden Rinnen wie in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Legen Sie die 4 Proben (BRAF-WT, BRAF V600E 50%, 5% und 1%) in den Probenträger-Racks. </li><li> Setzen Sie die Spitze-Boxen in den Trögen in den Spalten 2 und 3 und überprüfen Sie die Tipps für die Anwesenheit von mehr als einem Filter pro Spitze, die den Lauf abbrechen wird. </li><li> Stellen Sie sicher, die richtige Mischung des Lysepuffer und Waschpuffer durch Umdrehen sie 3-5 mal und laden Sie sie in die entsprechenden Mulden in Spalte 4 (Abbildung 1). </li><li> Nach Invertierung für einige Male oder mild vortExing, laden Sie das Elutionspuffer, magnetische Kügelchen, und FFPE-Puffer in den kleinen Mulden in Spalte 5, wobei 1-Slot leer ist, wo angegeben (Abbildung 1, Tabelle 1). </li><li> Legen Sie eine 2 ml Deep Well Platte (DWP) auf den Plattenträger (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Führen Sie die folgenden letzten Schritte vor dem Start eines Lauf: <ol><li> Uncap alle Rohre und Reagenzien Tröge. Bestätigen Sie, dass ausreichende Kapazitäten in der flüssigen Abfallflasche erhältlich. Bestätigen, dass die Abfallflasche leer ist und mit einem Biohazard Tasche ausgekleidet. Bestätigen Sie, dass die Spitze Auswurfplatte wird in der Abfalleinheit zentriert ist. </li><li> Schließen Sie die vordere Abdeckung. </li></ol></li><li> Starten Sie die Software. Öffnen Sie die NA_Prep_Main_MLSTARlet.med Datei. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Der Gerätestatus wird vom Leerlauf zum Laufen wechseln. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Proben für diesen Lauf. Wählen Sie die gewünschte Methode für diesen Lauf (DNA = 0). Geben Sie die Position des ersten Hoch volume Spitze, die Auswahl von &quot;1&quot;, wenn alle Fächer voll sind. Geben Sie die Position des ersten Standard-Volumenspitze, die Auswahl von &quot;1&quot;, wenn alle Fächer voll sind. Hinweis: Das Gerät wird dann durch automatisierte Schritte laufen ohne Benutzereingriff. Eine detaillierte Arbeitsablauf ist in Abbildung 2 dargestellt. Wenn das Experiment beendet ist, werden Reagenz Abfälle und Tipps in den Abfallanordnung injiziert. </li><li> Quantifizierung gereinigter genomischer DNA unter Verwendung eines fluorometrischen Verfahrens. Anmerkung: DNA-Proben, die eine Mindestkonzentration von 3,3 ng / &amp; mgr; l enthalten, werden ddPCR Analyse (Teil 2) unterworfen. </li></ol> 2. DNA-Mutation Profilierung: ddPCR Protocol Hinweis: Das Protokoll für DNA-Mutation Profilierung aus 3 Hauptschritten: 1) Tröpfchenerzeugung, 2) Konventionelle PCR-Amplifikation, 3) Tröpfchen Lesen und 4) DNA-Mutation Profilierung. 2.1. Tröpfchenerzeugung Hinweis: ddPCR Supermix istempfohlen für ddPCR, da diese Mischung enthält Reagenzien für Tröpfchenerzeugung erforderlich. <ol><li> Um Verunreinigungen zu vermeiden, befolgen Sie Standard-Sicherheitsvorkehrungen, wie das Tragen von Handschuhen, mit einem sauberen PCR Haube, saubere Pipetten und low-Protein-bindenden Rohre. </li><li> Sicherzustellen, daß die Mindestkonzentration von humanen genomischen DNA-Probe beträgt 3,3 ng / ul. Anmerkung: Die Menge an gereinigter DNA-Probenkonzentration wird auf der Analyse% Mutationsfrequenz Detektions variieren. </li><li> Montieren Reaktionsmischungen in 96-Well-PCR-Platten. Auftauen und ins Gleichgewicht die Reaktionskomponenten auf RT. Bereiten PCR-Reaktionen durch die Kombination von 2X ddPCR Supermix (10 ul) und 20 Primer (vorwärts und rückwärts, 900 nM) und Sonde (250 nm) mit jedem gereinigten DNA-Probe (66ng / 2 ul) machen bis zu 20 &amp; mgr; l mit destilliertem Wasser (als pro Tröpfchenerzeugers Protokoll) </li><li> Vortexen Mischung gründlich bis zur Homogenität und kurz zentrifugieren, sicherzustellen, um den Inhalt am Boden des Rohres vor der Ausgabe zu sammeln. Last 20 &amp; #181; l auf die Kartusche für die Tröpfchenbildung. </li><li> Betrieb des Tropfengenerators, der nach Hersteller empfohlenen Protokoll <ol><li> Setzen Sie die Patrone in den Halter mit der Kerbe in der Patrone auf der oberen linken Seite des Halters positioniert. In 20 ul Reaktionsmischung, die Proben in der Mitte, und 70 &amp; mgr; l-Generator Öl in den Boden Brunnen. </li><li> Bringen Sie die Dichtung auf der Oberseite der Patrone. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung fest eingehakt an beiden Enden des Inhabers; andernfalls wird ein ausreichender Druck zur Tropfenerzeugung nicht erreicht werden. </li><li> Öffnen Sie den Tropfengenerator durch Drücken der grünen Taste auf der Oberseite des Gerätes und setzen Sie die Patrone. Wenn der Halter in der richtigen Position, sowohl die Leistung (links nach rechts) und Halter (Mitte rechts) leuchtet grün. </li><li> Drücken Sie die obere Taste auf dem Gerät erneut, um die Tür zu schließen und zu initiieren Tropfenerzeugung. Hinweis: Nach dem Drücken der button, einem Verteiler positioniert sich über die Austrittsbohrungen, Ziehöl und Proben durch die mikrofluidischen Kanälen, in denen Tröpfchen erzeugt werden. Droplets fließen in den Tröpfchen gut, wo sie akkumulieren. Die Tröpfchenkontrollleuchte (rechts) blinkt grün, nach 10 Sekunden, um anzuzeigen, dass Tropfenerzeugung ist im Gange. </li><li> Wenn Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, wechseln alle 3-Anzeige leuchtet dauerhaft grün; öffnen Sie die Tür durch Drücken der Taste, und nehmen Sie die Halterung vom Gerät ab. Entfernen Sie die Einwegdichtung aus der Halterung und entsorgen Sie sie. Hinweis: Die oberen Vertiefungen der Patrone enthalten, Tröpfchen, und die mittleren und unteren Brunnen sind fast leer, mit einer kleinen Menge an Restöl. </li></ol></li></ol> 2.2. Vorbereitung für die PCR <ol><li> Für jede Probe pipettieren Sie 40 ul der Tröpfchen Inhalt von oben auch die Patronen in einer einzigen Vertiefung einer empfohlenen 96-Well-PCR-Platte wie in Instrumentenprotokoll des Herstellers angegeben. Neinte: Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette ist ideal zum Übertragen der Tröpfchen Emulsionen. Langsam und sanft Aspiration von Tröpfchen wird empfohlen, Tropfenscher bei der Übertragung zu minimieren. </li><li> Verschließen Sie die PCR-Platte mit Folie sofort nach dem Übertragen von Tröpfchen, um Verdunstung zu vermeiden. Verwenden durchstechbare Folie Platte Dichtungen, die mit dem PCR Abklebefolie und den Nadeln in der Tröpfchen Reader kompatibel sind. Folgen Sie den Anweisungen in der PCR-Plattenversiegelung Gebrauchsanleitung. </li><li> Stellen Sie die Plattenversiegelung Temperatur bis 180 ° C und die Zeit, um 5 Sek. </li><li> Tippen Sie auf den Pfeil, um das Fach Tür zu öffnen. Positionieren Sie den Trägerblock auf dem Tablett mit dem 96-Loch-Seite nach oben. Legen Sie die 96-Lochplatte auf dem Trägerblock und sicherzustellen, dass alle Plattenvertiefungen werden mit dem Trägerblock ausgerichtet ist. </li><li> Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit 1 Blatt durchstechbare Foliendichtung. Sobald die 96-Lochplatte auf dem Trägerblock befestigt ist und mit dem durchstechbaren Siegelfolie abgedeckt, berühren Sie die Dichtung Taste. Die Schublade wird geschlossenund Heißsiegeln wird zu initiieren. </li><li> Beim Heißsiegeln abgeschlossen ist, öffnet sich die Tür automatisch; entfernen Sie die Platte aus dem Wärmeblock für Temperaturwechsel und dann den Wärmeblock. </li><li> Sicherstellen, dass alle Vertiefungen in der Platte werden durch Überprüfen, dass Vertiefungen in der Folie gibt über jedem offensichtlich gut abgedichtet. Einmal versiegelt ist die Platte bereit für thermische Zyklen. </li><li> Sobald Tröpfchen entfernt werden, drücken Sie die Verriegelungen an den Patronenhalter, um sie zu öffnen. Entfernen Sie die leere Kartusche und entsorgen Sie sie. </li><li> Führen herkömmliche PCR-Amplifikation durch Befolgen der in Tabelle 2 beschriebenen Parametern. </li></ol> 2.3 Droplet Lesung (gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll) Anmerkung: Nach der PCR-Amplifikation der Zielnukleinsäure in den Tröpfchen, analysiert die Tröpfchenleser Instrument jedes Tröpfchen einzeln mit einem 2-Farbdetektionssystem 13. Wir in der Regel eingestellt, um eine FAM erkennend VIC Reporter Fluorophore. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;System spülen&quot; prime die Tröpfchen Leser und machen sie bereit für ddPCR Analyse. </li><li> Legen Sie die Platte in die Tröpfchen Leser und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Der Tröpfchen Leser saugt jede Probe, die vereinzelt Tropfen und Ströme sie im Gänsemarsch vorbei an einer 2-Farben-Detektor. Der Detektor liest die Tröpfchen auf positive und negative Proben aufzuzählen. </li><li> Wenn Tröpfchen Lesen abgeschlossen ist, die Tür öffnen und die Plattenhalter aus dem Gerät zu entfernen. Entfernen Sie den 96-Well-PCR-Platte aus der Halterung und entsorgen Sie sie. </li><li> Für eine ordnungsgemäße Wartung, ersetzen Sie die Tröpfchen Leser Öl und leeren Sie den Abfallbehälter nach Bedarf. In 50 ml 10% Bleichmittel auf die Abfallflasche, um mikrobielles Wachstum zu verhindern. </li></ol> 2.4 DNA-Mutation Profilierung (gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll) Hinweis: PCR-positiv und PCR-negative Tröpfchen werden gezählt, um absolute quantific liefernation von Ziel BRAF V600E DNA-Mutationen in digitaler Form unter Verwendung der Datenanalyse-Software. <ol><li> Klicken Sie auf Setup, um Informationen über die Proben, Tests und Experimente geben. </li><li> Im Setup-Fenster, laden Sie eine Platte (filename.qlp), klicken Sie dann auf Analysieren Sie zu öffnen und die Daten analysieren. Ergebnisse Tabelle, Well Selector und verarbeiteten Daten / Grafische Darstellung: Die Analyse der Daten-Schnittstelle ist in drei Fenster getrennt. </li><li> In der verarbeiteten Daten-Fenster, Konzentrationsdaten für jedes Ziel werden in den Vertiefungen in der Platte Karte und werden in der Ergebnistabelle aufgeführt. Klicken Konzentration, um Daten in der Konzentration Plots visualisieren. </li></ol>

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<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim und Junge Deug Kim sind Mitarbeiter von ABION CRO.

Hier beleuchten wir die Anwendbarkeit der ddPCR und DNA-Isolierung aus FFPE Referenzstandard Zelllinie Proben für eine bestimmte Genmutation Beurteilung. In dieser Studie wird TPS automatischen DNA-Isolierungsverfahren verwendet werden, der leicht angepasst werden kann, automatisiert, und kann bis zu 48 verschiedene Proben gleichzeitig unterzubringen, so dass für größeren Maßstab Experimente und niedrigere Variabilität. Eine der Beschränkungen der DNA-Isolierung in der vorliegenden Arbeit ist, dass jedes FFPE Probe ist ...

Die Akkumulation von genetischen Mutationen in regulatorischen Schlüsselgenen verändert normalen Zellprogrammierung wie Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben, die zu Krebs führen. 1 Die RAS-RAF-MAP-Kinase-Weg vermittelt zellulären Reaktionen auf Wachstumssignale. Onkogenen BRAF-Mutationen können vom Fahrer Mutationen des BRAF-Gens, der die BRAF oncoprotein verursachen können überaktiven 2 zu werden, zur Folge haben. Mutationen im BRAF-Gen auch in überaktiven nachgeschalteten Signal über MEK und ERK 3, die wiederum führt zu einer übermäßigen Zellwachstum und -proliferation unabhängig Wachstumsfaktor-vermittelten Regulation 4-6 führen. Mehrere Werkzeuge sind für die DNA-Mutation Profilierung zur Verfügung, wie quantitative Echtzeit-BRAF-V600E-Mutationen in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien durch ddPCR. ddPCR ist eine PCR-basierte Methode zur absoluten Quantifizierungbietet eine höhere Genauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) 7,8. ddPCR auch höheren Auflösungsvermögen und die Genauigkeit für die Detektion von seltenen Mutationen in DNA-Matrizen, so dass mehr informative Krebsforschung und Diagnose 9. Weitere Vorteile gegenüber herkömmlichen ddPCR qPCR sind seine verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit bei der Untersuchung niedrigen Vorlage Kopienzahlen 10-12. Hierin ist ein Protokoll für die automatische Extraktion von DNA aus FFPE Referenzstandard Zellinien, gefolgt von der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Mutationen durch BRAF V600E ddPCR demonstriert. Die Verwendung von Software für die Datenanalyse und eine grafische Darstellung der Ergebnisse werden ebenfalls beschrieben. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und hängt von der Anzahl von Proben, die profiliert werden und die Anzahl der konventionellen PCR und ddPCR Maschinen erhältlich völlig. Das folgende Protokoll beschreibt Standardverfahren für die BR<html> AF V600E-positive FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) in einem vollautomatischen Instrument mit Hilfe des Tissue Preparation System (TPS) Protokoll. Anschließend werden isolierte DNA-Proben auf die Anwesenheit von Mutationen unter Verwendung BRAF V600E ddPCR System analysiert. Gezielte Mutation Analyse durchgeführt wird, nachdem alle Proben profiliert und die Daten in der Datenanalyse-Software geladen ist. Abhängig von der Anzahl der Proben / Gruppen untersucht, Datenanalyse kann von einem bis zu mehreren Stunden dauern. Die experimentelle Komponente der Methodik erfordert Genauigkeit bei der Handhabung <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Isolierung von Nukleinsäuren aus Hefe, ein JoVE Science Education Video erklärt mehr über über die Kontext-RNA">DNA</a> undlogischer Pipetten und Pipetten, ein JoVE Science Education Video erklärt mehr über über die Kontext Pipettieren &quot;&gt; Pipettieren in 96-Well-Platten, während der Datenanalyse wird unter Verwendung von Software.

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD-Gerät</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>Automatisiertes DNA-Isolationsgerät</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerator&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Konventionelles PCR-Gerät mit Rampenzeiteinstellung</td><td></td><td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR-Plattenversiegeler</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft-Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Isolationskit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reagenzien für die Gewebevorbereitung Kasten 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reagenzien für die Gewebevorbereitung Box 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE Tipps</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Mutationsanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3010</td><td>2-fache Konzentration</td></tr><tr><td>DG8 Kartusche&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchengeneratoröl</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Dichtung</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchen-Leseöl</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung digitaler droplet pcr zu braf v600e mutationen in formalin-fixierte paraffin reference standard-zelllinien detect

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR ist eine hochempfindliche PCR-Methode, die ein Wasser-Öl-Emulsionssystem verwendet. Mit Hilfe eines Tröpfchengenerators wird eine extrahierte Nukleinsäureprobe in ~20.000 nanogroße Wasser-in-Öl-Tröpfchen aufgeteilt, und die PCR-Amplifikation erfolgt in einzelnen Tröpfchen. Der ddPCR-Ansatz besteht in der Identifizierung von Sequenzmutationen, Veränderungen der Kopienzahl und ausgewählten strukturellen Umlagerungen, an denen Zielgene beteiligt sind. Hier demonstrieren wir den Einsatz der ddPCR als leistungsfähige Technik zur präzisen Quantifizierung seltener BRAF V600E-Mutationen in FFPE-Referenzstandardzelllinien, die bei der Identifizierung von Krebspatienten hilfreich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ddPCR-Technik das Potenzial bietet, die spezifischen seltenen Mutationen in verschiedenen Genen in verschiedenen Arten von FFPE-Proben genau zu profilieren.

Für unsere ddPCR Analyse, untersuchten wir die BRAF-V600E-Mutation FFPE Referenz-Standard-Zelllinien. Die Tröpfchen Leser verbindet sich mit einem Laptop-Computer mit Datenanalyse-Software. Jeder einzelne Tropfen wird auf der Basis der Fluoreszenzamplitude als entweder positiv oder negativ definiert. Die vom Hersteller bereitgestellten Software ermöglicht außerdem ein benutzerdefinierter Grenz eingegeben werden, um den Grenzbereich zwischen der positiven und negativen Tröpfchen zu definieren. Die Anzahl der pos...

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, menschliche genomische DNA aus formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Referenzstandardzelllinien mithilfe eines Gewebepräparationssystems zu isolieren und anschließend die BRAF V600E-Mutationen in der genomischen DNA mittels digitaler Tropfen-PCR zu analysieren. Die digitale Tropfen-PCR (ddPCR) kann helfen, zentrale Fragen in der molekularen Onkologie zu beantworten, beispielsweise die Anwesenheit und Häufigkeit von RAS-Sequenzmutationen sowie die Quantifizierung von Nukleinsäuren bei geringer Vorlagenkopienzahl. Obwohl diese Methode hier an Referenzstandardzelllinien demonstriert wird, kann sie ebenfalls auf andere biologische Proben angewandt werden, wobei jedoch sichergestellt werden muss, dass die Bedingungen für die Isolierung der gewünschten DNA optimiert sind.Mit diesem Gewebeprotektionssystem können innerhalb von vier Stunden bis zu 48 Proben kontaminationsfreier humaner genomischer DNA isoliert werden, verglichen mit anderen manuellen Verfahren. Das System ist für die Probenvorbereitung etwas teuer, da magnetische Kügelchen verwendet werden. Es ist jedoch sicherer und liefert hochwertige Ergebnisse mit hoher Ausbeute. Die Demonstration der Methode erfolgt durch ssu A und einen Techniker aus unserem Labor.Die DNA-Extraktion wird mit einem vollautomatischen DNA-Isolationsgerät unter Verwendung des Gewebepräparationssystems oder des TPS-Protokolls durchgeführt. Schalten Sie zunächst das Gerät und den Computer ein. Öffnen Sie die Steuerungssoftware für den Laufbetrieb und setzen Sie ein automatisches Ladeblech in den Ladebereich der TPS-Plattform ein.Als Nächstes pipettieren Sie die Reagenzien in die entsprechenden Troughs, wie in dieser Abbildung dargestellt, und platzieren Sie die vier Proben in den Probenträgerhalter. Stellen Sie sicher, dass der Lysepuffer und die Waschpuffer durch dreimaliges bis fünfmaliges Umstülpen gut gemischt werden, und geben Sie sie anschließend in die jeweiligen Troughs der vierten Spalte. Nach mehrmaligem Umstülpen oder sanftem Vortexen füllen Sie den Elutionspuffer, die magnetischen Perlen und den FFPE-Puffer in die kleinen Troughs der fünften Spalte, wobei zwei Plätze an den angegebenen Stellen frei bleiben.Laden Sie eine 2 ml-Tiefbrunnenplatte auf den Plattenhalter. Verschließen Sie vor dem Start eines Durchlaufs alle Röhrchen und Reagenzienrinnen mit UNC-Caps. Stellen Sie sicher, dass im Flüssigabfallbehälter ausreichend Kapazität vorhanden ist und der Feststoffabfallbehälter leer ist und mit einer Bioabfallschutzfolie ausgekleidet ist.Überprüfen Sie, ob die Spitzen-Auswurfplatte in der Abfallvorrichtung zentriert ist. Schließen Sie die Frontabdeckung, starten Sie die Software und öffnen Sie das NA-Präp-Hauptmodul für den ML-Starlet. Führen Sie die mittlere Datei aus.Klicken Sie auf „Start“. Der Gerätestatus wechselt von „im Leerlauf“ zu „wird ausgeführt“. Geben Sie die Anzahl der Proben für diesen Durchlauf ein.Wählen Sie die gewünschte Methode für diesen Durchlauf aus. Geben Sie die Position der ersten Hochvolumen-Pipettenspitze an, indem Sie eine auswählen. Wenn alle Tabletts voll sind, geben Sie die Position der ersten Standardvolumen-Pipettenspitze an, indem Sie eine auswählen.Wenn alle Tabletts voll sind, führt das Gerät die automatisierten Schritte ohne Benutzerinteraktion durch. Ein detaillierter Arbeitsablauf wird hier dargestellt, um Kontaminationen zu vermeiden. Befolgen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und die Verwendung einer sauberen PCR-Werkbank.Reinigen Sie Pipetten und Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Stellen Sie die Reaktionsgemische in PCR-Röhrchenstreifen zusammen, tauchen Sie die Reagenzien auf und lassen Sie sie auf Raumtemperatur anwärmen. Die humane genomische DNA-Probe für die digitale Tropfen-PCR- oder D-D-P-C-R-Analyse muss eine Mindestkonzentration von 3,3 Nanogramm pro Mikroliter aufweisen.Bereiten Sie die PCR-Reaktionen vor. Kombinieren Sie die beiden X-D-D-P-C-R-Supermischungen 20 x mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern sowie der Sonde mit jeder gereinigten DNA-Probe und ergänzen Sie mit destilliertem Wasser auf 20 Mikroliter. Vortexen Sie die Mischung gründlich, um eine Homogenität zu gewährleisten, und zentrifugieren Sie kurz, um den Inhalt am Boden der Röhrchen zu sammeln, bevor Sie dosieren.Betreiben Sie den Tropfengenerator gemäß der vom Hersteller empfohlenen Anleitung. Setzen Sie die Kartusche in den Halter ein, wobei die Kerbe an der Kartusche sich in der oberen linken Seite des Halters befindet. Geben Sie 20 µL Reaktionsgemisch, das die Proben enthält, in die mittleren Vertiefungen und 70 µL Generatoröl in die unteren Vertiefungen. Befestigen Sie die Dichtung über der Oberseite der Kartusche. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung an beiden Enden des Halterungsrohrs sicher eingehakt ist. Andernfalls wird ein ausreichender Druck für die Tropfenbildung nicht erreicht.Öffnen Sie den Tropfengenerator, indem Sie die grüne Taste an der Oberseite des Geräts drücken. Setzen Sie die Kartusche ein, wenn sich der Halter in der korrekten Position befindet. Sowohl die Netz- als auch die Halter-Indikatorleuchten sind grün.Drücken Sie erneut die obere Taste am Gerät, um die Tür zu schließen und die Tröpfchengenerierung zu starten. Nach 10 Sekunden blinkt die Tröpfchen-Anzeige grün, um anzuzeigen, dass die Tröpfchengenerierung läuft. Wenn die Tröpfchengenerierung abgeschlossen ist, wechseln alle drei Anzeigelampen auf durchgehend grün.Öffnen Sie die Tür, indem Sie den Knopf drücken, und nehmen Sie den Halter aus dem Gerät heraus. Entfernen Sie die Einwegdichtung vom Halter und entsorgen Sie sie. Beachten Sie, dass sich in den oberen Vertiefungen der Kartusche die Tröpfchen befinden, während die mittleren und unteren Vertiefungen nahezu leer sind und nur eine geringe Menge Restöl nach der Tröpfchenbildung enthalten.Bereiten Sie die konventionelle PCR-Amplifikation vor. Für jede Probe pipettieren Sie 40 Mikroliter des Tröpfcheninhalts aus dem oberen Kanal der Kartuschen in eine einzelne Vertiefung einer empfohlenen 96-Loch-PCR-Platte, wie in der Instrumentenanleitung des Herstellers angegeben. Aspirieren Sie den Tropfen langsam und vorsichtig, um eine Scherung der Tröpfchen während der Übertragung zu minimieren. Unmittelbar nach der Übertragung der Tröpfchen muss die PCR-Platte versiegelt werden, um Verdunstung zu vermeiden.Stellen Sie die Temperatur des Plattenverschlusses auf 180 Grad Celsius und die Zeit auf fünf Sekunden ein. Berühren Sie den Pfeil, um die Fachtür zu öffnen. Positionieren Sie den Stützblock mit der 96-Loch-Seite nach oben auf dem Fach.Stellen Sie die 96-Loch-Platte auf den Halteblock und stellen Sie sicher, dass alle Plattenlöcher mit der Abdeckung des Halteblocks ausgerichtet sind. Die 96-Loch-Platte mit einem Blatt Folienverschluss. Verwenden Sie parabelförmige Folienplattenverschlüsse, die mit einem PCR-Plattenversiegler und den Nadeln im Tropfenanalysator kompatibel sind. Sobald die 96-Loch-Platte sicher auf dem Halteblock befestigt und mit einem aushärtbaren Folienverschluss abgedeckt ist.Berühren Sie die Dichtungstaste. Das Fach schließt sich und die Heizung wird aktiviert. Wenn die Wärmeversiegelung abgeschlossen ist, öffnet sich die Tür automatisch.Entfernen Sie die Platte vom Heizblock und anschließend den Heizblock. Stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen in der Platte versiegelt sind, indem Sie die Vertiefungen überprüfen. Die Folie ist über jeder Vertiefung deutlich sichtbar.Nach dem Versiegeln ist die Platte bereit für den thermischen Zyklenprozess. Führen Sie die konventionelle PCR-Amplifikation gemäß den in der Protokollbeschreibung detaillierten Parametern durch. Sobald die PCR-Amplifikation des nukleinsäurehaltigen Zielmoleküls in den Tröpfchen abgeschlossen ist.Der nächste Schritt besteht darin, jeden Tropfen einzeln mithilfe eines Zweifarben-Detektionssystems zu analysieren. Üblicherweise wird das Tropfenlesegerät so eingestellt, dass es die Fluoreszenzfarbstoffe FAM und VIC erkennt. Klicken Sie auf „System spülen“, um das Tropfenlesegerät vorzubereiten und für die D-D-P-C-R-Analyse bereitzustellen.Laden Sie die Platte in den Tropfenleser ein und klicken Sie auf Start. Wenn das Lesen der Tropfen abgeschlossen ist, öffnen Sie die Tür und nehmen Sie den Plattenträger aus dem Gerät heraus. Entfernen Sie die 96er-Platte aus dem Träger und entsorgen Sie sie.Führen Sie anschließend die DNA-Mutationsprofilierung mithilfe einer Datenanalyse-Software wie im Protokolltext beschrieben durch. In dieser D-D-P-C-R-Analyse wurden die RAF V 600 E-Mutationen untersucht. Die Fluoreszenz wurde detektiert und in eine zweidimensionale Streudiagrammdarstellung verarbeitet.Es wurde eine benutzerdefinierte Software verwendet, um geeignete Tore zu zeichnen, und die Anzahl der Tröpfchen innerhalb jedes Tores wurde gezählt. Tröpfchen, die durch blaue Punkte oberhalb der rosa Grenzlinie für alle Proben dargestellt werden, sind positiv. Für mutierten RAF V600E Wildtyp BRA werden Tröpfchen in beiden Diagrammen durch grüne Punkte dargestellt.Die grauen Punkte unten gelten als Fluoreszenz-Hintergrund. Die Gesamtanteile der mutierten Allele wurden anschließend anhand der relativen Prozentsätze der nachgewiesenen Konzentrationen der Wildtyp- und brav V600E-Vorlagen berechnet. Eine semestergerechte HR-Analyse kann innerhalb von vier Stunden nach dieser Vorgehensweise durchgeführt werden.Andere Proben wie eine PPT-Liquid-Biopsie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Überwachung des Krebsfortschritts nach der Erkrankungsentwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der begleitenden Diagnostik, um verschiedene Mutationserkennungen im Bereich der molekularen Onkologie zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Gewebeproduktionssystem und die digitale Tropfen-PCR-SA für die spezifische Detektion von Punkt-DNA-Mutationen durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Die Wildtyp-Blocking-PCR mit anschließender direkter Sequenzierung bietet eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von niederfrequenten somatischen Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Nachweis von zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) aus Blut besteht ein ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Hier beschreiben wir Methoden, die cRNA von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Patienten mit empfindlichen und spezifischen digitalen Polymerase-Kettenreaktion zu charakterisieren. Die Tests treffen Entwurfsanforderungen zu Fusion Varianten innerhalb von 72 Stunden zu erkennen.

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode zur Visualisierung der Genamplifikation in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben.

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Identifizierung von Mechanismen, die Schädigung der Muskulatur ist von entscheidender Bedeutung. Hier präsentieren wir die histologische Technik zur Herstellung Paraffin eingebetteten und Gefrierschnitten von Drosophila Brustmuskeln. Dies ermöglicht die Analyse von Muskel-Morphologie und Lokalisation von Proteinen und anderen Zellbestandteilen Muskel.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Erfahren Sie die automatisierte DNA-Extraktion aus FFPE-Referenzstandard-Zelllinien und die digitale Droplet-PCR zur Detektion von BRAF V600E-Mutationen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Analyse seltener Mutationen in der molekularen Onkologie.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

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