Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten
20. November 2015
Die Frühgeborenen-Enzephalopathie umfasst die Anomalien des Zentralnervensystems, die mit Verletzungen durch Frühgeburten verbunden sind. Dieser Bericht beschreibt ein klinisch relevantes Rattenmodell der in utero transienten systemischen Hypoxie-Ischämie und der intraamniotischen Lipopolysaccharid-Verabreichung (LPS), das die Chorioamnionitis nachahmt, und den damit verbundenen Einfluss von infektiösen Reizen und Plazenta-Unterperfusion auf die ZNS-Entwicklung.
Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, ein reproduzierbares Modell für Hirnverletzungen im Zusammenhang mit extrem Frühgeburten zu liefern, und zwar durch die Induktion von in utero, vorübergehender systemischer Hypoxie, Ischämie und intraamniotischer Entzündung zur Rekapitulation, Plazentainsuffizienz und Chorioamnioitis bei Ratten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Pathogenese perinataler Hirnverletzungen zu beantworten, die durch intrauterine Prozesse entstehen, und die Entwicklung gezielter therapeutischer Strategien erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die systemische Verletzung induziert, die intrauterine Insulte sowohl durch Infektionen als auch durch Hypoxie nachahmt, wobei die Ischämie bei der ausgewachsenen Ratte zu funktionellen neurologischen Defiziten führt.
Dieses Modell eignet sich besonders gut, um die Mechanismen von Verletzungen im Zusammenhang mit Entzündungen zu analysieren. Da Hypoxie, Ischämie und infektiöse Reize einzeln oder als kombinierte Verletzung getestet werden können, wird das Verfahren von Lindsey Chan, einer Technikerin aus unserem Labor, demonstriert. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, verwenden Sie eine Kleintierschermaschine, um alle Haare aus der unteren Bauchregion eines embryonalen Tages zu entfernen.
18 trächtige Ratten in einem rechteckigen Muster, wobei darauf zu achten ist, dass die Brustwarzen nicht eingekerbt werden oder Rasurausschlag entsteht. Schrubben Sie anschließend die Haut mit sterilen Wattestäbchen dreimal abwechselnd mit Povidon, Jod und 70 % Ethanol. Wenn die Haut trocken ist, bestätigen Sie die entsprechende Anästhesietiefe mit den Zehen, kneifen und drapieren Sie das Tier.
Dann machen Sie mit einem Skalpell einen drei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie im Bauch des Tieres, gefolgt von einem stumpfen Sezieren der Hautschicht von der Bauchfaszie mit einer Schere. Mit Pinzette und chirurgischer Schere. Heben Sie die Bauchfaszienschicht an und machen Sie einen Schnitt durch den avaskulären linearen Ellenbogen.
Wenn die Bauchhöhle freigelegt ist, legen Sie chirurgische Gaze auf die Außenseite des Schnitts und befeuchten Sie die Gaze mit steriler Kochsalzlösung. Entfernen Sie dann mit einer stumpfen Zange und äußerem Druck auf den Bauch vorsichtig die Gebärmutterhörner aus der Bauchhöhle und ordnen Sie die Hörner auf der angefeuchteten Gaze an. Achten Sie darauf, dass sich der Darm nicht verheddert und mit dem Darm in Berührung kommt, und verwenden Sie nur das Muskelgewebe zwischen den einzelnen Fruchtblasen, um die Föten anzuordnen.
Legen Sie dann mit einer stumpfen Dissektion die vier Gebärmutterarterien frei und isolieren Sie sie. Achten Sie darauf, die mütterlichen Gefäße nicht zu beschädigen, wenn die Arterien isoliert wurden. Platzieren Sie einen 30-Gauge-Rattenaneurysmaclip auf jedem Gefäß Bevor Sie die Clips anbringen, ist es wichtig sicherzustellen, dass das gesamte umgebende Gewebe vollständig frei ist.
Befestigen Sie sie beim Platzieren der Clips mit der stumpfen Pinzette und platzieren Sie sie dann parallel. Das Beobachten des Aufhörens des Pulses ist entscheidend, um eine vollständige Hypoxie-Ischämie zu gewährleisten, wenn alle Clips platziert wurden. Bestätigen Sie das Aufhören der proximalen und distalen Impulse und die Verdunkelung der Gebärmuttergefäße, auch in den einzelnen Plazenten.
Decken Sie dann das gesamte Operationsfeld mit Gaze ab und spülen Sie das Gewebe mit steriler Kochsalzlösung. Entfernen Sie nach 60 Minuten alle 10 Minuten eine Stunde lang die Gaze und bewässern Sie das Feld erneut. Wenn die Gebärmutterhörner und -gefäße ausreichend befeuchtet sind, verwenden Sie eine Pinzette, um jeden Aneurysmaclip vorsichtig zu entfernen, wobei Sie darauf achten, dass das Gefäß nicht traumatisiert wird und die Gewebeintegrität erhalten bleibt.
Dann die Hörner und das Feld gründlich bewässern. Achten Sie ein letztes Mal darauf, verirrte Gazefäden von den Fruchtblasen zu entfernen. Um die Föten mit LPS zu behandeln, verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um jede Fruchtblase zu stabilisieren und zu drehen, so dass die Basis jeder einzelnen Fruchtblase sichtbar ist.
Laden Sie dann eine ultrafeine 0,3-Milliliter-Insulinspritze mit einer daran befestigten Acht-Millimeter-Nadel mit 31 Gauge mit LPS-Lösung und injizieren Sie 100 Mikroliter der Lösung direkt vor jeder Plazentaplatte. Wenn die Nadel entfernt wird, üben Sie direkten Druck auf die Fruchtblase aus, um ein Austreten von Flüssigkeit zu verhindern. Das Einführen einer ultrafeinen 31-Gauge-Nadel an der Basis der Fruchtblase ist entscheidend für eine ordnungsgemäße LPS-Abgabe, ohne dass Fruchtwasser entweichen kann.
Nachdem Sie die Gebärmutterhörner dreimal mit steriler Kochsalzlösung gespült haben, verwenden Sie eine Pinzette, um die Hörner wieder in die Bauchhöhle zu bringen. Verwenden Sie dann eine laufende Drei-Oh-Seidennaht, um die Ränder der Muskulofaszienschicht wieder zu approximieren, ohne in oder durch einen Sack zu nähen, gefolgt von einem Verschluss der Haut mit einer weiteren laufenden 3.0-Seidennaht. Verwenden Sie anschließend eine 26-Gauge-Nadel, um subkutan zu behandeln.
Injizieren Sie einen Milliliter 0,125% Bupivacain um die Wundränder. Trocknen Sie die Ratte bei Bedarf mit einem Handtuch ab und injizieren Sie 0,1 Milligramm Buprenorphin pro Kilogramm in den Nacken. Setzen Sie das Tier in einen sauberen Heimkäfig mit Überwachung, bis es sich vollständig erholt hat.
Nach vorübergehender systemischer Hypoxie-Ischämie- und LPS-Verabreichung am embryonalen Tag 18, wie gerade gezeigt, zeigt die Het- und Eosin-Färbung signifikante histopathologische Anomalien sowohl in der Plazenta als auch im Gehirn. In der Tat sind die Plazenta, die an den embryonalen Tagen 19 und 21 untersucht werden, stark emittiert mit Mikroblutungen und Nekrosen in der gesamten Dezidua und im Labyrinth. Ein signifikantes entzündliches Infiltrat und eine erhöhte Vaskularität werden ebenfalls beobachtet.
Weitere Gehirne, die am zweiten postnatalen Tag untersucht wurden, zeigten eine ventrikuläre Magalie sowie den Verlust der weißen Substanz und des Neuronenverlusts unter der Platte im Vergleich zu Scheinen, vorübergehender systemischer Hypoxie, Ischämie und LPS verringerten auch signifikant die Expression des Kaliumchlorid-Cotransporter-Zwei-Proteins, eines Chlorid-Cotransporters, der für die Entwicklung der GABAergen Hemmung im Kortex am postnatalen Tag 15 von zentraler Bedeutung ist. Dies steht im Einklang mit der beeinträchtigten Hochregulierung der Entwicklung, die während der kritischen postnatalen Phase der Zirkelreifung beobachtet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie diese Operation bei trächtigen Ratten durchgeführt wird und wie man eine pränatale vorübergehende Hypoxie-Ischämie über einen Uterusarterienverschluss mit einer In-utero-Entzündung durch intraamniotische Injektion von Lipopolysaccharidlösung induziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 90 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Rattenmodell vor, das eine durch extrem frühzeitige Geburt verursachte Hirnschädigung simuliert, indem eine vorübergehende systemische Hypoxie-Ischämie in utero und eine intraamniale Entzündung ausgelöst werden. Das Modell zielt darauf ab, die Mechanismen perinataler Hirnschädigungen im Zusammenhang mit Infektionen und plazentarer Insuffizienz aufzuklären.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Perinatale Medizin
Hintergrund
- Die Enzephalopathie der Frühgeburtlichkeit beinhaltet zentrale Nervensystem-(ZNS-)Abnormalitäten infolge einer Frühgeburt.
- Chorioamnionitis und eine unzureichende Plazentaperfusion sind bedeutende Faktoren für die Entwicklung des ZNS.
- Das Verständnis dieser Faktoren ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien.
- Intrauterine Prozesse können zu funktionellen neurologischen Defiziten führen.
Zweck der Studie
- Ein reproduzierbares Modell einer Hirnverletzung bei extrem vorzeitig geborenen Ratten erstellen.
- Die Auswirkungen systemischer Verletzungen untersuchen, die intrauterine Noxen nachahmen.
- Die Pathogenese perinataler Hirnverletzungen erforschen.
Verwendete Methoden
- Induktion einer vorübergehenden systemischen Hypoxie in utero.
- Induktion von Ischämie und intraamnialer Entzündung.
- Verwendung eines Rattenmodells zur Untersuchung der Effekte kombinierter Verletzungen.
- Beurteilung funktioneller neurologischer Defizite bei ausgewachsenen Ratten.
Hauptergebnisse
- Das Modell bildet erfolgreich die Effekte einer Infektion sowie der Hypoxie-Ischämie ab.
- Zeigte die Möglichkeit, die Einzel- und Kombinationswirkungen von Verletzungen zu testen.
- Lieferte Erkenntnisse über die Mechanismen von entzündungsbedingten Verletzungen.
- Erleichterte die Entwicklung gezielter therapeutischer Strategien.
Schlussfolgerungen
- Dieses Modell ist wertvoll für die Untersuchung der Mechanismen perinataler Hirnschädigungen.
- Es kann helfen, die Auswirkungen intrauteriner Bedingungen auf die Entwicklung des ZNS zu verstehen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können dieses Modell nutzen, um therapeutische Interventionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses pränatale Rattenmodell schließt eine entscheidende Lücke in der Forschung zur Enzephalopathie der Frühgeburtlichkeit, indem es eine vorübergehende systemische Hypoxie-Ischämie mit einer intraamniotischen Entzündung kombiniert, um eine mangelhafte Durchblutung der menschlichen Plazenta und eine Chorioamnionitis nachzuahmen. Es ermöglicht die mechanistische Aufschlüsselung unterschiedlicher Verletzungsformen – ischämisch versus infektiös – und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen sowie die Entdeckung von Biomarkern im Bereich des perinatalen Neuroschutzes. Die Fähigkeit des Modells, funktionelle Defizite bei adulten Ratten hervorzurufen, die klinischen Phänotypen ähneln, erhöht das Vorhersagevertrauen für präklinische therapeutische Screening-Verfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Isolierung von Hypoxie-Ischämie- und entzündlichen Signalwegen in einem kombinierten Verletzungsmodell.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen anhand quantifizierbarer Schäden im zentralen Nervensystem, einschließlich des Verlusts von weißer Substanz, Subplattenneuronen und Oligodendrozyten.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten durch Modellierung konvergierender pathophysiologischer Prozesse, wie sie bei extrem frühgeborenen Säuglingen beobachtet werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt krankheitsrelevante neuroanatomische und funktionelle Messgrößen (Gangstörungen, Ventrikelmorphologie, Herunterregulation von KCC2) zur Assay-Standardisierung.
- Operationaler Wert: Bietet reproduzierbare, quantifizierbare Ergebnisse über Plazenta- und Fetalkompartimente hinweg, um eine hochpräzise Wirkstoffscreening zu ermöglichen.
- Plattformnutzen: Ermöglicht die sequenzielle Untersuchung einzelner und kombinierter Noxen, um mechanistische Unschärfen bei der Leitstrukturidentifizierung auszuschließen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erfüllt mehrere Kriterien für EoP – neuronaler/axonaler Verlust, Subplattendegeneration und anhaltende funktionelle Defizite – und erhöht dadurch die translative Validität.
- Operativer Wert: Ermöglicht den Zusammenhang zwischen pränatalem Insult und postnatalen Phänotyp und unterstützt die longitudinale Verfolgung von Biomarkern.
- Risikominderung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem kombinierte Ursachen wie Plazentainsuffizienz und Entzündungen modelliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über das phänotypische Screening bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für neuroprotektive Wirkstoffe, die entzündliche oder hypoxisch-ischämische Signalwege anvisieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem sie die Untersuchung von Entzündungen bei unterschiedlichen Verletzungsarten (ischämisch vs. infektiös) in utero ermöglicht.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative histopathologische und verhaltensbezogene Ergebnisse, die für die Reproduzierbarkeit von Assays und die Bewertung von Wirkstoffen unerlässlich sind.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich der Schwere von Verletzungen mittels plazentarer Histopathologie, fetaler Gehirnhistologie und postnataler neurofunktioneller Assays.
- Translationale Forschung: Orientiert sich an der klinischen Pathophysiologie der EoP und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern sowie die Kontinuität von präklinischen zu klinischen Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von Monotherapien und Kombinationsinterventionen über verschiedene Verletzungsmodalitäten hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unklarheit bei perinatalen Hirnverletzungen, indem synergistische plazentare und fetale Noxen modelliert werden.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit durch standardisierte chirurgische Zeitpunkte (E18), Klammerplatzierung und LPS-Dosierungsprotokolle sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch der Entwicklung, indem multifaktorielle Ursachen modelliert werden, die für das späte Versagen neuroprotektiver Substanzen in der klinischen Prüfung verantwortlich sind.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikobasierte Priorisierung von Wirkstoffen entsprechend ihrer Wirksamkeit bei ischämischen, entzündlichen oder kombinierten Verletzungsmodellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mikrochirurgie an Nagetieren, der Isolierung der Uterusarterien und dem Umgang mit dem Amnionsack.
- Benötigt präzise Instrumente: Aneurysmakenklammern mit 30 Gauge, Insulinspritzen mit 31 Gauge und die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes.
- Setzt eine standardisierte Zusammenarbeit zwischen chirurgischen, histologischen und verhaltensanalytischen Teams für eine konsistente Phänotypisierung voraus.
- Die Übertragung auf andere Modelle erfordert die Validierung der plazentaren Perfusion und der entzündlichen Dosis-Wirkungs-Beziehung.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die chirurgische Variabilität bei der Platzierung der Klammern und der Diffusion von LPS, die durch die Überprüfung des Pulscessations und durch Spülung mit Kochsalzlösung kontrolliert werden müssen.
