Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zeitliche Entwicklung einer Dysregulation des Calciumhaushalts im endoplasmatischen Retikulum mithilfe eines sezernierten Reportereiweißes zu überwachen. Dies wird durch eine virale Vektor-vermittelte Transgenese des Zielgewebes, insbesondere der Leber, erreicht. In diesem Beispiel wird nach der Expression des Gai-Luciferase-Circa-Reporters eine biologische Körperflüssigkeit wie beispielsweise Blut gesammelt, um die Menge des aus dem Gewebe freigesetzten Circa zu bestimmen. Anschließend wird das Luciferase-Substrat zu den Plasma-Proben hinzugefügt und die Lumineszenz gemessen, um den Kalziumverlust im ER zu ermitteln.

Die Ergebnisse zeigen eine Dysregulation des Calciumhaushalts im ER, wie durch erhöhte Spiegel von PlasmacAMP angezeigt wird. Der Calciumhaushalt im ER kann über längere Zeiträume hinweg durch wiederholte Entnahme kleiner Mengen biologischer Flüssigkeiten überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie niedrig-affinen Calciumfarbstoffen oder genetisch kodierten Calciumindikatoren besteht darin, dass der Calciumhaushalt im ER über die Zeit hinweg in vivo mittels eines minimalinvasiven Verfahrens überwacht werden kann. Es gibt zwei therapeutische Ansatzpunkte für diese Technik.

Die erste Methode besteht darin, Wirkstoffe zu screenen, die die Kalziumhomöostase im endoplasmatischen Retikulum (ER) im normalen physiologischen Zustand aufrechterhalten oder wiederherstellen können. Der zweite Ansatz zielt darauf ab, therapeutische Proteine so zu modifizieren, dass sie zu therapeutischen AMPs werden, deren Sekretion als Reaktion auf eine Kalziumverarmung im ER erfolgt. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Dysregulation der ER-Kalziumhaushaltsregulation in der Leber liefern.

Es kann auch auf andere Organsysteme wie Gehirn, Herz, Muskulatur oder Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Nach der Anästhesie einer Sprague-Dawley-Ratte gemäß dem beschriebenen Protokoll Augensalbe auftragen und einen Schwanzquetschtest durchführen, um die Anästhesie zu überprüfen. Den Bereich des Abdomens leicht unterhalb der Rippen bis zum mittleren Bauchbereich rasieren und die Operationsstelle dreimal abwechselnd mit Betadine und 70 %igem Ethanol desinfizieren. Anschließend die Ratte in Rückenlage auf einem sterilen Operationsfeld platzieren, mit sterilen Operationsabdeckungen abdecken und eine a v gluc samp auf die vom Anwender optimierte Konzentration verdünnen.

In diesem Fall verwendeten wir 7,6 × 10⁹ virale Genome pro Milliliter und mischten die Lösung durch mehrmaliges Umkippen des Reaktionsrohrs. Danach pipettieren Sie 105 µL des verdünnten AAV in eine sterile Schale und sammeln das Virus mit einer Nadel der Größe 30 Gauge in einer Spritze auf. Markieren Sie die gezielte Schnittstelle, um die Leber für die Injektion mit einem Skalpell freizulegen.

Führen Sie einen horizontalen Schnitt von etwa zwei bis drei Zentimetern Länge unterhalb des Rippenbogens durch. Lösen Sie das Bindegewebe vom Hypodermis durch stumpfe Dissektion. Durchtrennen Sie die Bauchmuskulatur, um das rechte mediale Leberlappen freizulegen.

Als Nächstes bringen Sie das Tier unter ein Operationsmikroskop und justieren es so, dass das rechte mediale Leberlappen im Sichtfeld liegt. Injizieren Sie dann mit der Spritze ein Drittel des Gesamtvolumens des Virus an drei Stellen in das Parenchym des rechten medialen Leberlappens, wobei die Nadel nach der Injektion fünf bis zehn Sekunden im Gewebe verbleibt, um eine vollständige Applikation des Injektionsvolumens sicherzustellen. Nähen Sie danach den Bauchmuskel und den Schnitt und tragen Sie mit einem Wattestäbchen Neosporin auf. Stellen Sie die Ratte in eine Erholungskammer, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt und in der Lage ist, eine aufrechte Position beizubehalten, bevor Sie das Tier in einen einzelnen Käfig zurückbringen.

Vier bis sieben Tage nach der Injektion. Bereiten Sie die Blutentnahmeröhrchen vor, indem Sie sie beschriften und vorwiegen. Geben Sie dann jeweils 50 µL einer Heparinlösung mit 1000 Einheiten pro Milliliter in jedes Röhrchen.

Nach der Anästhesie der Ratte gemäß dem Textprotokoll einen Schwanzreiz testen, um die Sedierung zu überprüfen, und mit sterilen Scheren die Schwanzspitze etwa ein bis zwei Millimeter vom Ende entfernt abschneiden. Mehr als 100 Mikroliter Blut tropfenweise in ein vorab mit Heparin befülltes Gefäß sammeln, um die Blutung zu stoppen.

Verwenden Sie einen feuchten Wattetupfer, um STIC-Pulver auf den Schwanz aufzutragen. Reinigen Sie die Schere mit einem Ethanol-Tupfer und desinfizieren Sie sie durch Aufglühen zwischen den einzelnen Probenentnahmen. Lagern Sie die Blutröhrchen bei vier Grad Celsius.

Wenn nachfolgende Proben gesammelt werden, wiegen Sie die Sammelröhrchen und passen Sie das Heparin an, um ein Verhältnis von zwei Teilen Blut zu einem Teil Heparin zu erhalten. Dieser Schritt standardisiert die Menge an Heparin in jeder Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Überführen Sie das plasmatische Überstand in ein frisches Röhrchen und lagern Sie es bis zu 72 Stunden bei vier Grad Celsius oder langfristig bei minus 80 Grad Celsius für den Luciferase-Assay, um Thaa Garin als positiven Kontrollstoff zu verwenden. Verdünnen Sie in Ethanol auf eine Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter. Anschließend injizieren Sie intraperitoneal im unteren Bauchbereich mit ein Milligramm pro Kilogramm.

Entnehmen Sie die erste Blutprobe 24 Stunden nach der Injektion, wie oben beschrieben. Um die Lumineszenz zu messen, bereiten Sie das Selen Ezine-Arbeitssubstrat gemäß dem Textprotokoll vor und inkubieren es 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.

Unterdessen alle Proben auf Eis auftauen und 10 Mikroliter Plasma mit einem Plattenreader, der in der Lage ist, Biolumineszenz zu messen und mit einem Substrat-Injektor ausgestattet ist, in eine opake Mikrotiterplatte überführen. Die Leitungen mit Substrat spülen. 100 Mikroliter Substrat in eine Vertiefung injizieren.

Schütteln Sie für fünf Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit und messen Sie die Lichtemission für in-vitro-Proben. Integrieren Sie die Lichtemission über 0,5 Sekunden für den Re-Schritt und für in-vivo-Proben über fünf Sekunden, wobei der Lese-Schritt zur Beurteilung der Calciumhomöostase dient. Mithilfe der Gluc-SAR-cAMP-Methode können mehrere Kontrollen einbezogen werden, wie beispielsweise ein konstitutiv sekretierter Reporter, in diesem Fall Gluc Noag.

Ein Anstieg der extrazellulären Konzentrationen sowohl von GLUC SAR camp als auch von Gluc noag als Reaktion auf experimentelle Bedingungen würde als eindeutiges Ergebnis betrachtet. Hingegen deutet ein Anstieg der Gluc SAR camp-Sekretion ohne gleichzeitige Reaktion von Gluc noag auf ein Ereignis hin, das von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum abhängig ist. Pharmakologische Modulatoren des Calciumspeichers im endoplasmatischen Retikulum können verwendet werden, um den Beitrag von ER-Calcium zur Freisetzung von SAR camp in neuen Versuchsansätzen zu bestätigen.

Beispielsweise hemmt Dantrolen, ein INE-Rezeptorantagonist, der das Kalzium im ER stabilisiert, die Freisetzung von SAR-cAMP als Reaktion auf Thic-Argon. Bei In-vitro-Studien unter Verwendung von gluc-basiertem SAR-cAMP sollte die durch die Behandlung hervorgerufene Reaktion am besten über einen Zeitverlauf hinweg bewertet werden. Durch die Verfolgung von Änderungen der relativen Antwort innerhalb einer Platte im Vergleich zu Kontrollen ist es nicht ratsam, Rohwerte über mehrere Platten hinweg zu vergleichen, da der Zerfall des Substrats zu Veränderungen der Rohwerte führen kann. Bei In-vivo-Studien sollten die Daten für jedes Tier einzeln ausgewertet werden, wobei jedes Tier als eigene Vorbehandlungskontrolle dient.

Dies ist erforderlich, um die Variabilität in der Transgenübertragung und -expression zwischen den Tieren zu berücksichtigen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mithilfe der Sircam-Technologie die Kalziumregulation im endoplasmatischen Retikulum in Nagetiermodellen der Lebererkrankung untersuchen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.