Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein Gaussia Luciferase SERCaMP

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Kalziumdysregulation des endoplasmatischen Retikulums über die Zeit mit Hilfe eines sezernierten Reporterproteins zu überwachen. Dies wird durch eine virale Vektor-vermittelte Transgenese des Zielgewebes, insbesondere der Leber, erreicht. In diesem Beispiel mit dem Gai-Luciferase-Circa-Reporter wird als nächstes biologische Flüssigkeit, wie z. B. Blut, gesammelt, um die Menge an circa zu messen, die aus dem Gewebe freigesetzt wird, dann wird das Luciferase-Substrat zu den Plasmaproben hinzugefügt und die Lumineszenz gemessen, um den ER-Kalziummangel zu bestimmen.

Die Ergebnisse zeigen, dass die ER-Kalzium-Dysregulation, die durch erhöhte Plasma-C-Camp-ER-Homöostase angezeigt wird, über längere Zeiträume durch wiederholte Probenahme kleiner Mengen biologischer Flüssigkeiten überwacht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie niedrigaffinen Calciumfarbstoffen oder genetisch kodierten Calciumindikatoren besteht darin, dass die Calciumhomöostase in vivo über einen Zeitraum über ein minimalinvasives Verfahren überwacht werden kann. Es gibt zwei therapeutische Wege für diese Technik.

Die erste besteht darin, nach Arzneimitteln zu suchen, die die Kalziumhomöostase aufrechterhalten oder in einen normalen physiologischen Zustand versetzen können. Der zweite Ansatz besteht darin, therapeutisches Protein so zu modifizieren, dass es zu therapeutischen Ampern wird, bei denen die Sekretion als Reaktion auf den Kalziummangel auftritt. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die Dysregulation des Kalziums in der Leber geben.

Es kann auch auf andere Organsysteme wie Gehirn, Herz, Muskeln oder Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Nach der Anästhesie trägt eine Sprotten-Ratte gemäß dem Textprotokoll eine Augensalbe auf und führt eine Schwanzkneifung durch, um die Anästhesie zu überprüfen, rasiert den Bereich des Bauches etwas unterhalb der Rippen bis zur mittleren Bauchregion und schrubbt den Operationsbereich dreimal, abwechselnd Betadin und 70% Ethanol. Legen Sie dann die Ratte in Rückenlage auf eine sterile Operationsfläche und bedecken Sie sie mit sterilen OP-Tüchern, verdünnen Sie sie mit einem Gluc-Verstärker auf die vom Benutzer optimierte Konzentration.

In diesem Fall haben wir 7,6 mal 10 bis das neunte Virusgenom pro Milliliter verwendet und durch Invertieren im Röhrchen gemischt. Pipettieren Sie dann 105 Mikroliter des verdünnten A bis V in eine sterile Schale und verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das Virus in einer Spritze zu sammeln. Markieren Sie mit einem Skalpell die Zielschnittstelle, um die Leber für die Injektion freizulegen.

Machen Sie einen horizontalen Schnitt von etwa zwei bis drei Zentimetern Länge unterhalb des Brustkorbs. Stumpfes Präparieren, um das Bindegewebe von der Unterhaut zu trennen. Durchtrennen des Bauchmuskels, der den rechten medialen Lappen der Leber freilegt.

Legen Sie das Tier anschließend unter ein Operationsmikroskop und stellen Sie es so ein, dass der richtige mediale Lappen der Leber im Sichtfeld ist. Injizieren Sie dann mit der Spritze ein Drittel des Gesamtvolumens des Virus in drei Stellen im Parenchym des rechten medialen Lappens, lassen Sie die Nadel nach der Injektion fünf bis 10 Sekunden lang im Gewebe, um die Abgabe des gesamten Injektionsvolumens sicherzustellen, nähen Sie den Bauchmuskel und den Einschnitt und verwenden Sie einen Applikator mit Wattespitze, um Neosporin aufzutragen. Bringen Sie die Ratte in eine Aufwachkammer, bis sie wieder zu Bewusstsein gekommen ist und sie in der Lage ist, eine aufrechte Position einzunehmen, bevor Sie das Tier in einen einzigen Käfig zurückbringen.

Vier bis sieben Tage nach der Injektion. Bereiten Sie Blutentnahmeröhrchen vor, indem Sie sie etikettieren und vorwiegen. Dann bei 50 Mikrolitern von 1000 Einheiten pro Milliliter Heparin auf jedes Röhrchen.

Nachdem Sie die Ratte gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, führen Sie eine Schwanzkneifung durch, um die Sedierung zu überprüfen, und verwenden Sie eine sterile Schere. Schneide die Spitze des Schwanzes etwa ein bis zwei Millimeter vom Ende entfernt ab. Sammeln Sie mehr als 100 Mikroliter Blut tropfenweise in ein mit Heparin vorgefülltes Röhrchen, um die Blutung zu stoppen.

Verwenden Sie einen feuchten Baumwollapplikator, um STIC-Pulver auf den Schwanz aufzutragen. Verwenden Sie ein Ethanol-Pad, um die Schere abzuwischen und die Beads zwischen den Sammlungen. Lagern Sie die Blutröhrchen bei vier Grad Celsius.

Wenn Sie nachfolgende Proben entnehmen, wiegen Sie die Entnahmeröhrchen und passen Sie das Heparin an, um ein Verhältnis von Blut zu Heparin von zwei zu eins zu erhalten. In diesem Schritt wird die Menge an Heparin in jeder Probe normalisiert. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Der Plasmaüberstand wird in ein frisches Röhrchen überführt und bis zu 72 Stunden lang bei vier Grad Celsius oder langfristig bei minus 80 Grad Celsius gelagert, damit der Luciferase-Assay Thaa Garin als Positivkontrolle verabreichen kann. In Ethanol auf eine Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter verdünnen. Dann injizieren Sie mit einem Milligramm pro Kilogramm intraperitoneal in den Unterbauch.

Nehmen Sie die erste Blutprobe 24 Stunden nach der Injektion wie oben beschrieben. Zur Messung der Lumineszenz. Bereiten Sie das Selen-Ezine-Arbeitssubstrat gemäß dem Textprotokoll vor und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt.

In der Zwischenzeit tauen Sie alle Proben auf Eis auf und übertragen Sie 10 Mikroliter Plasma auf eine undurchsichtige Wandplatte mit einem Plattenreader, der die Biolumineszenz überwachen kann und mit einem Substratinjektor ausgestattet ist. Grundieren Sie die Linien mit Substrat. Injizieren Sie 100 Mikroliter Substrat in eine Vertiefung.

Schütteln Sie fünf Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit und messen Sie die Lichtemission für In-vitro-Proben. Integrieren Sie die Lichtemission über 0,5 Sekunden für den Re-Schritt und für In-vivo-Proben, integrieren Sie über fünf Sekunden, wo der Leseschritt zur Beurteilung der Kalziumhomöostase erfolgt. Mit der Gluc SAR Camp-Methode können mehrere Kontrollen einbezogen werden, wie in diesem Fall ein konstituierend sezernierter Reporter wie in diesem Fall Gluc Noag.

Ein Anstieg der extrazellulären Spiegel sowohl des GLUC SAR-Lagers als auch des Gluc noag als Reaktion auf experimentelle Bedingungen würde als mehrdeutiges Ergebnis angesehen werden. Ein Anstieg der Gluc-SAR-Camp-Sekretion ohne Gluc-Noag-Reaktion unterstützt jedoch ein ER-Calcium-abhängiges Ereignis. Pharmakologische Modulatoren des ER-Kalziumspeichers können verwendet werden, um den Beitrag von ER-Kalzium zur Freisetzung von SAR-Lagern in neuen Paradigmen zu bestätigen.

Zum Beispiel, wie hier gezeigt, hemmt Dantrolen, ein INE-Rezeptor-Antagonist, der ER-Kalzium stabilisiert, die Freisetzung von SAR-Camp als Reaktion auf thic-Argon. Für In-vitro-Studien mit Gluc-basiertem SAR-Camp wird das behandlungsinduzierte Ansprechen am besten im Zeitverlauf beurteilt. Durch die Verfolgung von Änderungen der relativen Reaktion innerhalb einer Platte im Vergleich zu Kontrollen ist es nicht ratsam, Rohzahlen über mehrere Platten hinweg zu vergleichen, bei denen der Zerfall des Substrats zu Änderungen der Rohwerte führen kann. Bei In-vivo-Studien sollten die Daten für jedes Tier unabhängig voneinander ausgewertet werden, wobei jedes Tier als eigene Vorbehandlungskontrolle dient.

Dies ist notwendig, um die Variabilität der transgenen Verabreichung und Expression zwischen Tieren zu berücksichtigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Sircam-Technologie nutzen können, um die Kalziumregulation in Nagetiermodellen für Lebererkrankungen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der richtigen persönlichen Schutzausrüstung getroffen werden sollten.