Name: Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein Gaussia Luciferase SERCaMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie das endoplasmatische Reticulum-Calcium mit Gaussia-Luciferase-SERCaMP in Lebergewebe überwachen. Diese Methode ermöglicht minim-invasive Langzeitstudien zur Calciumhomöostase.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Intramural Research Program am National Institute on Drug Abuse. Wir danken Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno und Josh Hinkle für ihre Beiträge zur Entwicklung dieser Methode.

1. In vitro-Test: Entdecken SERCaMP Mitteilung von einer stabilen SH-SY5Y-Zelllinie <ol><li> Platte SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) in Gewebekultur-behandelten Platten mit 150.000 Zellen pro cm 2 Oberfläche. Für Platten mit 96 Vertiefungen, zum Beispiel Saatgut 50.000 Zellen pro Vertiefung (1A). Wachsen SH-SY5Y-Zellen in DMEM (hoher Glukose, GlutaMAX, Pyruvat) + 10% Rinderwachstumsserum + 1x Penicillin / Streptomycin. <ol><li> Passage-Zellen bis zu 15 mal (1B). Höhere Durchlaufhäufigkeit wurde nicht getestet. </li><li> Zurückzukehren Zellen befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5,5% CO 2 und über Nacht inkubieren. </li></ol></li><li> Vor Versuchs Behandlung (en) zu sammeln eine Ausgangsprobe für jede Vertiefung durch Übertragung von 5 ul Kulturüberstand zu einem opaken mauert Platte mit 96 Vertiefungen. Vor dem Sammeln, klopfen Sie die Platte auf allen Seiten und wirbeln Gradienten Effekte zu vermeiden. Verschließen Sie die undurchsichtige Platte mit einem Klebstoff sEaling Blatt und bei 4 ° C bis zur enzymatischen Assay. Anmerkung: Secreted Gluc-SERCaMP ist in Zellkulturmedium sehr stabil. Wir bereits berichtet etwa 5-10% der Gluc-Aktivität wurde nach einer 72-stündigen Inkubation bei 37 ° C (auf SH-SY5Y-Zellen inkubiert) 12 verloren. </li><li> Gönnen Zellen wie gewünscht, um ER Kalziumabbau zu untersuchen (zB Umwelt-, pharmakologische, genetische Manipulationen). Vermeiden Sie lange Aussetzung an Umgebungsbedingungen (außerhalb der Brutapparat) als pH-Änderungen schnell bei atmosphärischem CO 2 entstehen. Hinzufügen HEPES zum Kulturmedium auf 20 mM, pH-Stabilisierung 14, wenn längerer Manipulationen erforderlich sind. Lichteinwirkung zu vermeiden, wenn mit HEPES in Kulturmedium 15. <ol><li> Positive Kontrolle: Behandeln Sie die Zellen mit 100 nM Thapsigargin (Tg) oder 50 uM Cyclopiazonsäure (CPA) für 4-6 Stunden für Experimente in SH-SY5Y-Zellen. Maximale Reaktion in anderen Zelllinien können längere Inkubationen oder verschiedene Konzen erforderlichtrationen von Verbindungen. </li><li> Negative Kontrolle: Collect Kulturmedium aus der Eltern SH-SY5Y-Zellen. Nach unserer Erfahrung ist die Hintergrundlumineszenz für diesen Test weniger als 0,05% der basale Sekretion von stabil SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen. </li></ol></li><li> Sammeln und speichern 5 ul Proben des konditionierten Medien zu den gewünschten Zeitpunkten, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Beurteilen Sie enzymatischer Aktivität in dem Medium, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li><li> Untersuchen intrazellulärer Gluc durch Immunoblot oder Lumineszenz-Assays. <ol><li> Für Immunoblot: lysieren Zellen in modifiziertem RIPA-Puffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren. Separate auf SDS-Polyacrylamid-Gel und Transfer zu 0,20 um PVDF-Membran. Dazu werden die Membranen mit Gluc Antikörpers (1: 2000 Verdünnung) über Nacht bei 4 ° C. Führen sekundären Antikörper Inkubation und Membran wäscht nach benutzerdefinierten Protokolls für Nachweisreagenz der Wahl. </li><li> FürLumineszenz-Assays (Abbildung 2): Führen Sie folgende Schritte auf dem Eis: <ol><li> Entfernen Sie das gesamte Medium aus Vertiefungen der Gewebekulturplatte und spülen mit 200 ul kaltem PBS. </li><li> Hinzuzufügen 75 ul Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren in jede Vertiefung. </li><li> Drehen der Platte auf einem Orbitalschüttler (120 Upm) bei 4 ° C für 20 min. </li><li> Pipette vorsichtig das Lysat nach oben und unten mit einer Mehrkanalpipette, die Vermeidung von Luftblasen. Bringen Sie 5 ul Lysat zu einer undurchsichtigen Platte und bewerten Lumineszenz, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In vitro-Test: transiente Transfektion von immortalisierten Zellen mit SERCaMP Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die transiente Transfektion Verfahren können zellulären Stress zu induzieren und stumpf die anschließende Gluc-SERCaMP Antwort. Der folgende Ansatz wurde entwickelt, um die Transfektion eff minimieren<html> ECTS in SH-SY5Y-Zellen. Optimierung dieses Verfahrens (einschließlich Auswahl des Transfektionsreagenz) zum alternativen Zelllinien erforderlich. Wenn möglich, ist es empfehlenswert, stabile Zelllinien oder viralen Transduktion Methoden in den Abschnitten 1 und 3 jeweils beschriebenen verwenden. <ol><li> Platte SH-SY5Y-Zellen in einer 100 mm-Schale mit 4 × 10 6 Zellen. Dieses Gericht wird ausreichen, um re-Samen etwa 300 Brunnen (96 Well-Plattenformat) nach der Transfektion Verfahren. </li><li> Transfizierenden Zellen mit Xfect Reagens unter Verwendung von 20 ug Plasmid-DNA (kodiert Gluc-SERCaMP) und 6 ul Xfect Reagenz. Skala DNA und Xfect Reagenz entsprechend für größere oder kleinere Kulturgefäße. </li><li> Zurückzukehren Zellen für 48 Stunden Inkubator. </li><li> Trypsinize Zellen und reseed Platten mit 96 Vertiefungen mit 60.000 Zellen pro Vertiefung. Folgen Sie den nachfolgenden Schritten in Kapitel 1 beschrieben. </li></ol> 3. In vitro-Test: viralen Vektor-vermittelte Expression von Gluc-SERCaMP Zelt &quot;&gt; Hinweis: Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektor Verpackung 16 und Reinigung 12 und Lentivirus Produktions 13 wurde bereits berichtet. <ol><li> Titer Gluc-SERCaMP AAV unter Verwendung der folgenden Primer und Sonden: Vorwärts-Primer, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; Rückwärts-Primer, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; Sonde (5&#39;-6-FAM / 3&#39;-BHQ-1 bezeichnet), 5&#39;-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;für die quantitative PCR. <ol><li> Vorbereitung der Standardkurve durch Linearisierung eines Plasmids, welches Gluc und Reinigung der DNA unter Verwendung einer Spin-Säule (Macherey-Nagel zB NucleoSpin Gel und PCR-Reinigung). Quantifizierung der DNA durch Trennen an einem Agarosegel zusammen mit einer Masse-Leiter. Vorzubereiten 1.10 Verdünnungen von DNA von 100 pg / ml bis 10 fg / ml in PBS. Berechnung der Kopien / ml Gluc Plasmid-DNA in jeder der Konzentrationen, bezogen auf das Molekulargewicht des Plasmids. </li><li> Verdünnen Sie die AAV-Stamm in PBS (entsprechender Verdünnung wird abhängig sein,Parameter der Viruspräparat und empirisch bestimmt). </li><li> Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Echtzeit-PCR-System unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C × 5 min, 94 ° C × 20 Sekunden und 60 ° C × 1 min für 41 Zyklen. Berechnen Sie Kopien / ml unter Verwendung der Standardkurve. </li></ol></li><li> Titer Lentivirus mit einer p24 Lenti-X schnellen Titer Kit. Auftauen lentiviralen Aliquots auf Eis und verdünnen das p24-Kontrollprotein in SH-SY5Y Medium. <ol><li> Verdünnen Sie die Lentivirus, so dass es auf die Standardkurve (zB 1: 20.000 oder 1: 100.000) fällt. Die erforderliche Verdünnung Faktor wird auf dem lentiviralen Herstellungsparameter variieren und muss empirisch ermittelt werden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für alle folgenden Schritte. </li></ol></li><li> Platten Zellen auf 96-Well-Platten. Für SH-SY5Y-Zellen, können Beschichtungsverfahren in Abschnitt 1 dargelegt befolgt werden. Für Ratten primären kortikalen Neuronen, sollten Zellen isoliert und auf entsprechend beschichtete Platten ein ausgesät werdens die zuvor beschriebenen 16. Pflegen Ratte primären kortikalen Neuronen in Neurobasalmedium mit 1x B27 und 500 &amp; mgr; M L-Glutamin. Führen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte mittel Börsen. </li><li> Transduktion der Zellen mit Virus. Das Ziel ist es, virale Transduktion Expression auf niedrigem Niveau zu erreichen, wie Gaussia-Luciferase bietet robuste Signal. <ol><li> AAV-Transduktion SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnter AAV bis 6,0 x 10 &amp; sup7; VG / &amp; mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer (PBS + 0,5 mM MgCl 2). In 5 ul verdünnt AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI von etwa 6.000) pro Well von 96-Well-Platte (3A). Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren. </li><li> AAV-Transduktion Ratten primären kortikalen Neuronen: transduzieren 6-8 Tage nach der Plattierung. Verdünnter AAV bis 4,0 x 10 &amp; sup6; VG / &amp; mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer. In 5 ul verdünnt AAV (2,0 x 10 7 vg; MOI von etwa 350) pro VertiefungPlatte mit 96 Vertiefungen (3B). Die optimale MOI sollte empirisch für andere Zelltypen bestimmt werden. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren. </li><li> Lentivirale Transduktion von SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnen Sie Lentivirus zu 20 pg / ul p24 in Hanks ausgewogener Salzlösung (mit Titerung Kit Konzentration bestimmt). Add 5 ul der verdünnten Virus pro Vertiefung (100 pg von p24, das entspricht 1.250.000 lentivirale Partikel oder ~ 1.250 IFUs) einer Platte mit 96 Vertiefungen 100 ul Volumen. Skalieren entsprechend für größere Formate. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf virale Abfall inaktivieren. </li></ol></li><li> Sammeln Sie eine Vorbehandlung Probe des Mediums und beginnen experimentelle Behandlungen 48 h (SH-SY5Y) oder 5-7 Tage (rat primären kortikalen Neuronen) nach Transduktion. </li></ol> 4. In Vivo SERCaMP Assay Hinweis: Vor der Durchführung von Tierversuchen irgendwelche Achten Sie auf ordnungsgemäße Genehmigung durch Ihre Einrichtung zu erhalten. AlleÜberleben Operationen sind unter sterilen Bedingungen mit ausreichender Betäubung durchgeführt werden. Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden genehmigt und sind in Übereinstimmung mit NIH ACUC Richtlinien. <ol><li> Autoklaven chirurgische Instrumente vor der Operation zu starten (121 ° C, 30 min Sterilisations, 20 min Trockenzeit). Reinigen Sie alle Instrumente in einem Ultraschallgerät unmittelbar nach allen Verfahren und vor dem Autoklavieren. Pflegen sterilen Bedingungen während des Überlebens der Operation. Für Operationen mehrere Tiere erfordern, wischen chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol, ultrasonicate und Perlen sterilisieren zwischen Ratten. Siehe Materialliste für die notwendigen Instrumente. </li><li> Bereiten rat für die Chirurgie. Hier verwenden wir männliche Sprague-Dawley (180-200 g). <ol><li> Betäuben Ratten mit Isofluran Gas für 3 Minuten (4-5% Isofluran bei 1000 cm³ / min zugeführt), gefolgt von intraperitoneale Injektionen von Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (80 mg / kg). Bewerben Augensalbe zur Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen. BEgin Operation, sobald die Ratte ist tief narkotisierten, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz oder Fuß Prise demonstriert. </li><li> Rasieren Sie die Region des Bauches leicht unter den Rippen (niedrig BWS) auf die Mitte der Bauchregion. Scrub die OP-Bereich dreimal im Wechsel 70% Alkohol und Betadine Scrub. Zeigen Ratte in Rückenlage auf sterilen OP-Bereich mit sterilen OP-Abdeckungen. </li></ol></li><li> Verdünnter AAV-Gluc-SERCaMP bis 7,6 x 10 9 vg / ml (Endkonzentration). Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens. Anmerkung: Reichweite der Viruskonzentration (Abbildung 4) variieren. <ol><li> Pipette 105 ul verdünnt AAV in eine sterile Schale. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das Virus in eine Spritze zu sammeln. </li></ol></li><li> Durchführung von Operationen, die Leber zu entlarven und zu injizieren AAV-Gluc-SERCaMP. <ol><li> Vor dem Vornehmen eines Einschnitts in der Bauchhöhle, gelten 0,25% Bupivacain zu dem Schnittbereich. Mit einem Skalpell einen horizontalen Schnitt unterhalb Brustkorb (apnäherungs 2-3 cm). Stumpf sezieren, um das Bindegewebe aus Unterhaut zu trennen. </li><li> Schneiden Sie Bauchmuskel, Freilegung der rechten medialen Leberlappen. Hinweis: zusätzliche Lappen kann basierend auf End-Anwendung injiziert werden. </li><li> Zeigen Tier unter Operationsmikroskop und passen Sie nach rechts medialen Leberlappen in das Blickfeld zu bekommen. Spritzen Sie Virus in Parenchym der medialen Lappen; 3 separate Websites, etwa 33 &amp; mgr; l pro Standort. Hinweis: Lassen Sie Nadel im Gewebe für 5-10 sec nach der Injektion bis zur Lieferung des gesamten Einspritzvolumen zu gewährleisten. </li><li> Naht der Bauchmuskeln und die Haut getrennt und fügen Neosporin mit Wattestäbchen. Zeigen Ratte in einem Wiedergewinnungskammer, bis das Bewusstsein wiedererlangt und Ratten in der Lage, aufrecht zu erhalten. Lassen Ratten (n) nicht unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Haus einzeln, bis der Einschnitt verheilt und Nahtmaterialien entfernt worden sind (7-14 Tage). <br/&gt; Anmerkung: Wie pro NIH postoperativen Richtlinien halten chirurgische Rekord. Anmerken Käfigkarte mit Verfahren, Datum, Experiment Kennung, Körpergewicht und Tag der Operation. Schmerz / Not, Kot Produktion, Aktivität und Futter- und Wasseraufnahme sind überwacht und aufgezeichnet 3 Tage post-OP werden. Postoperative Analgesie wird durch Zugabe von Paracetamol auf die Trinkwasser (450 mg / 100 ml) zur Verfügung gestellt, obwohl wir in der Regel nicht zu beobachten Anzeichen von Schmerzen oder Leiden nach der Operation. </li></ol></li><li> Beginnen Schwanz Blutentnahme 4-7 Tage nach der Injektion. Bereiten Blutentnahmeröhrchen Etiketten und pre-Wiegen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l Heparin (1000 U / ml) zu jedem Röhrchen. </li><li> Platz Ratte in Isofluran-Narkose Kammer 3 min (4-5% Isofluran bei 1.000 cm³ / min geliefert). Entfernen Ratte aus der Kammer und in Nasenkegel (2-3% Isofluran bei 500 cm³ / min geliefert). Blutentnahme kann beginnen, sobald die Ratte ist tief anästhesiert, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz pi nachgewiesennch. <ol><li> Mit einer sterilen Schere Rutenspitze (1-2 mm) und sammeln Bluttropfenweise in vorgefüllten Heparin Röhrchen. Blutentnahme bis zum Volumen von mehr als 2 erreicht: 1 Blut in Heparin-Verhältnis (&gt; 100 &amp; mgr; l Blut / 50 ul Heparin). Blutabnahmemengen können basierend auf experimentellen Design angepasst werden. Verwenden Sie einen feuchten Watte zur blutstillende Pulver an den Schwanz gelten die Blutung zu stoppen. </li><li> Speicher Blutröhrchen bei 4 ° C, wenn das Sammeln nachfolgende Proben. Wischen Schere mit Ethanol-Pad und Perlen sterilisieren zwischen Sammlungen. </li><li> Wiegen Sammelröhrchen und stellen Sie mit Heparin, um 2: 1-Verhältnis (Blut: Heparin). Dieser Schritt wird die Menge von Heparin in jeder Probe (Tabelle 1) zu normalisieren. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand (Plasma) in ein frisches Röhrchen und bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Luciferase-Assay (Abschnitt 5). Anmerkung: Lagerung von Proben bei 4 ° C bis zu 72 Stunden vor der enzymatischen Assay weist minimal Wirkung auf Lumineszenz (5A). Bis zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen von Plasmaproben keine Wirkung auf die Lumineszenz (5B). </li></ol></li><li> Thapsigargin Verwaltung (Positivkontrolle): <ol><li> Vorbereitung Thapsigargin durch Verdünnung in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mg / ml. Injizieren Thapsigargin bei 1 mg / kg ip in den Unterleib. Hinweis: Thapsigargin erhöht Thrombin-induzierte Blutplättchengerinnungs 17 und kann die Blutentnahme aus Schwanz erschweren. </li></ol></li><li> Gaussia-Luciferase-Assay: <ol><li> Tauen die Plasmaproben auf Eis. Hinweis: Für die Längsschnittstudien, Tauwetter und führen Lumineszenz-Assay für alle Zeitpunkt Proben am selben Tag (mit Einzel Herstellung von Substrat). </li><li> Transfer 10 ul Plasma zu einem opaken Wandplatte und messen Enzymaktivität, wie in Abschnitt 5. Führen Sie 3-4 technischen Wiederholungen jeder Plasmaprobe beschrieben. </li></ol></li><li> Euthanasiein Anmerkung: Der Vorteil SERCaMP Technologie ist die Fähigkeit zur Überwachung ER Calcium longitudinal. Je nach Versuchsparameter und Endpoint-Analysen, sind Tiere, die von Maßnahmen zur Endpunktanalysen angebracht und im Einklang mit den institutionellen ACUC Richtlinien eingeschläfert werden. </li></ol> 5. Lumineszenzassay <ol><li> Vorbereitung Coelenterazin (CTZ) Stammlösungen durch Verdünnen der Verbindung in angesäuertem Methanol (30 ul 10 N HCl auf 3 ml Methanol), 20 mM. Bereiten Sie den einmaligen Gebrauch und Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Herstellung der Arbeits Substrat am Tag des Assays. <ol><li> Für in-vitro-Tests, zu verdünnen Coelenterazin bis 8 um in PBS, zB fügen 10 ul 20 mM CTZ Lager zu 25 ml PBS (6A, B). </li><li> Zur in vivo-Assays, verdünnter Coelenterazin bis 100 &amp; mgr; M in PBS, 500 mM Ascorbinsäure, 5 mM NaCl. </li></ol></li><li> Inkubieren bereit CTZ für mindestens 30 minbei Raumtemperatur vor dem Test. Anmerkung: Dieser Schritt wird häufig in Gaussia-Luciferase-Assays enthalten, da es Berichte über raschen Zerfall Substrat während ersten 30 min nach der Herstellung. Wir haben diesen Effekt nicht in unserem System (6C) beobachtet; jedoch sind wir oft die Inkubationsschritt, da haben wir keine negativen Auswirkungen auf den Test gefunden. </li><li> Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, das in der Lage Überwachung Biolumineszenz und mit einem Substrat Injektor ausgestattet ist. Prime die Linien mit dem Substrat. Hinweis: Das Ausgangssubstrat durch die Leitungen können anfällig für Abbau sein. Künstlich niedrige Werte für die frühe Proben zu vermeiden, zu injizieren 20-30 leere Brunnen (Laden eines leeren Teller auf dem Lesegerät) vor der Messung experimentellen Proben. </li><li> Injizieren Sie 100 ul Substrat in gut schütteln mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden, und messen die Lichtemission. Für die Biotek Synergy II-Plattenlesegerät, integriert Lichtemission über 0,5 s (in vitro Proben) und 5 sec (invivo Proben) für den Leseschritt. Optimierungs-Plattenleseparameter für optimale Testleistung. Hinweis: Gaussia-Luciferase Exponate Flash-Kinetik mit schneller Signalabfall (im Vergleich zu mit anderen Luciferasen beobachteten Kinetik leuchten). Die Flash-Kinetik Gluc durch Serum in Zellkulturmedium (7A) beeinflusst, Hervorhebung der Bedeutung der Kontrolle für den Mittelzusammensetzung in Proben. Aufgrund des schnellen Zerfalls der Lumineszenz nach Zugabe von Substrat (Flash-Kinetik), der Zeit zwischen spritzen und lesen müssen bei allen Proben gleichförmig sein. Das Plattenlesegerät sollte so eingestellt sein Substrat auf eine gut zu injizieren, warten Sie eine feste Zeit (zum Beispiel verwenden wir eine 5 sec schütteln Schritt), und lesen, dass auch. Hinzufügen Substrat auf eine gesamte Platte, bevor Lesung stellt eine erhebliche Herausforderung, wenn Substrat in alle Vertiefungen gleichzeitig zugegeben werden. Wenn ein Einspritzer nicht verfügbar ist, kann das Problem teilweise durch Inkubation der Platte für 10 Minuten zwischen Substrat ADDI umgangention und Messung (wodurch die steilen Teil der Zerfallskurve) (7B). </li><li> Wiederholen Sie die Injektion, die Wartezeit, und lesen Sie Schritte für jede Vertiefung auf der Platte. </li></ol>

<ol><li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li>
<li>Fu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+lipid+metabolism+disrupts+calcium+homeostasis+causing+liver+endoplasmic+reticulum+stress+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity.</a> Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).</li>
<li>Micaroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in intracellular trafficking.</a> Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).</li>
<li>Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic-reticulum+calcium+depletion+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+probes+for+measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium.</a> Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2%2B+dynamics+in+high+Ca2%2B+concentration+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intraorganellar+Ca2%2B+at+subcellular+resolution+using+CEPIA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153(2014).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).</li>
<li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCaMP%3A+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li>
<li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+%28MANF%29+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li>
<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll hebt die in vitro und in vivo Nützlichkeit Gluc-SERCaMP Erschöpfung der ER Calcium zu überwachen. Obwohl die Proteinmodifikation, um SERCaMP erzeugen scheint auf andere Reporter-Proteine ​​12 verallgemeinern, wählten wir Gaussia-Luciferase für seine robusten (200-1000-fach größer) Biolumineszenz im Vergleich zu anderen Luciferasen 18. Wir zeigen, nachweisbar Thapsigargin-induzierte Gluc-SERCaMP Mitteilung über einen 100-fachen Dosisbereich von Gluc-SERCaMP Virus a...

Das endoplasmatische Retikulum (ER) Funktionen in vielen Zellkapazitäten einschließlich Proteinfaltung, Proteinsekretion Lipidhomöostase und intrazelluläre Signal 1. Von zentraler Bedeutung für normale ER-Funktion wird beibehalten Lumencalciumkonzentrationen bei ~ 5.000 Mal jene im Zytoplasma 2-4 gefunden. Dieser energieintensive Prozess wird durch die sarco / endoplasmatischen Reticulum Calcium ATPase (SERCA), eine Pumpe, die Calcium-Ionen in das ER bewegt geregelt. Efflux von Kalzium aus dem ER wird hauptsächlich durch den Ryanodin (RyR) und Inositol-Triphosphat (IP3R) -Rezeptoren vermittelt werden. Da viele ER Prozesse sind abhängig von Kalzium, kann stören den Speicher, um ER Stress und schließlich zum Zelltod führen. ER Calcium Dysregulation in Krankheiten wie Kardiomyopathie, Diabetes, Alzheimer beobachtet und Parkinson-5. Infolge der Progressivität dieser Krankheiten wurde schwierig, die Ursache-Wirkungs-Wieder abgrenzenhung zwischen Pathogenese und Veränderungen in der ER Kalziumspeicher. Eine Anzahl von Technologien für signifikante Fortschritte im Verständnis der ER Calciumdynamik, einschließlich Farbstoffe und genetisch kodierte Calciumindikatoren (GeCIS) erlaubt. Geringe Affinität Calcium-Farbstoffe, die in der Fluoreszenz zu erhöhen, wenn Ca 2+ gebunden ist, kann in die Zellen geladen werden, um subzellulären Kompartimenten mit hohen Konzentrationen an Calcium 6 zu untersuchen. GeCIS wie D1ER und Catcher ermöglichen Überwachung Calciumschwankungen genauere Steuerung der subzellulären Lokalisation 7-9. Vor kurzem hat eine weitere Klasse von GeCIS sogenannter Kalziummess Organell eingeschlossenen Proteinindikatoren (CEPIA) beschrieben worden sind 10. Ein dritter Ansatz, der Genetik und der Chemie kleiner Moleküle ist gezielte Esterase-Farbstoffbeladung (TED), die eine genetisch kodierte Carboxylesterase (zum ER gezielte) mit einem Ester-basierten Calcium Farbstoff 11 verwendet. Während der AFORementioned Ansätze haben inhärenten Stärken und Schwächen, können sie wertvolle Einblicke in ER Kalziumdynamik durch akute Fluoreszenzmessungen bereitzustellen. Sie sind jedoch für die Langzeitstudien oft erforderlich, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen nicht optimal. Mit dem Ziel der Entwicklung einer Methode zur Calciumdynamik über längere Zeiträume hinweg zu beobachten, wurde identifiziert und entwickelt eine Proteinmodifikation, die sezerniert ER Calcium Überwachung Proteine ​​(SERCaMPs) 12 zu schaffen. SERCaMP umgeht einige Einschränkungen mit anderen Methoden verbunden sind, durch die Bereitstellung einer minimal-invasiven Ansatz, um wiederholt zu verhören die ER Kalziumspeicher. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Carboxy-terminalen Peptids ASARTDL (Alanin-Serin-Alanin-Arginin-Threonin-Asparaginsäure-Leucin) ausreicht, um ER-Retentions fördern; jedoch unter Bedingungen, die Abnahme der ER Calcium verursachen kann, ist die Peptidsequenz nicht mehr ER localizatio behaltenn und das Protein sekretiert 13. Die Basis der SERCaMP Technologie ist das Anhängsel ASARTDL zum Carboxy-Terminus eines sezernierten Proteins (zB Gaussia-Luciferase oder Gluc), so dass die Sekretion von ER Calciumverarmung ausgelöst, wodurch eine robuste Reporter ER Calcium Dysregulation 12. Die Expression von Gluc-SERCaMP über transgene Methoden können biologische Flüssigkeiten wie Zellkulturmedium und Plasma, um Änderungen der Gluc-Aktivität als Indikator für die ER Calciumhomöostase analysiert werden. Das Verfahren findet Anwendung für die Langzeitstudie über progressive Veränderungen in der ER Calciumspeicher sowohl in vitro als auch in vivo. Das folgende Protokoll wird als eine allgemeine Übersicht zur Verwendung von Gluc-basierte SERCaMP zu ER Calciumhomöostase studieren geschrieben, aber das Protokoll kann als Leitfaden für alternative Reporter SERCaMPs dienen.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml</td><td>Tuben Fisher&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10%ige NP-40-Lösung&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>für intrazelluläre GLuc-Assays</td></tr><tr><td>1 ml Luer-Lok-Spritzen</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200-Mikroliter-Filterspitzen</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 chirurgische Nähte</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 G-Nadeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Selbstklebende Mikrotiterplatten-Dichtungsfolien</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholvorbereitungspads</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesie Auto Flow System</td><td>E-Z Anästhesie</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Tierwiederherstellungskammer</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Betadin-Lösung</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Rinderwachstumsserum</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Applikatoren mit Baumwollspitze</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Schneidenadeln 3/8 Kreisnähte</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Ultraschallreiniger</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt, GlutaMAX, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Massenleiter</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia-Luciferase (rekombinantes Protein)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia-Luciferase-Antikörper (für WB, ICC oder IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2.000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Gluc-Assay-Platten (96 Well, undurchsichtig)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank's ausgewogene Salzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Butler</td><td> Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Styptic Pulver</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Zentrifuge</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel und PCR Cleanup</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipette</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X Schnelltiterkit</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR Filmdichtung</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Aktivkohlefilter-Kanister</td><td>E-Z Anästhesie</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen, #10</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD Ratten 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Ratten</td><td>Ratten bestellt zu 150-200 g.&nbsp; Operation 5 Tage nach der Ankunft</td></tr><tr><td>Ohrmarken für Kleintiere</td><td>National Band und Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile OP-Abdecktücher</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Plattenleser</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>schädlich für menschliche Gesundheit</td></tr><tr><td>Virapower lentivirale Verpackungsmischung</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Transfection Reagenz</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung endoplasmatischen reticulum calciumhomöostase mit ein<em&gt; gaussia</em&gt; luciferase sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Das endoplasmatische Retikulum (ER) enthält, die höchste Stufe von intrazellulärem Calcium, wobei Konzentrationen etwa 5000-fach größer als cytoplasmatische Ebenen. Strenge Kontrolle über ER Calcium ist zwingend notwendig für die Proteinfaltung, Änderung und Menschenhandel. Perturbationen ER Calcium kann in der Aktivierung des ungefalteten Protein-Reaktion, einer dreipoligen ER Stressantwort Mechanismus führen und tragen zur Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Die Fähigkeit, ER Kalzium Veränderungen während der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu überwachen ist wichtig, im Prinzip, dennoch schwierig in der Praxis. Derzeit verfügbare Verfahren zur Überwachung von ER Calcium, wie Calcium-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe und Proteine, Einsicht in ER Calciumdynamik in Zellen bereitgestellt, aber diese Werkzeuge sind nicht für in-vivo-Studien geeignet. Unserem Labor haben gezeigt, dass eine Modifikation des Carboxyterminus von Gaussia-Luciferase vermittelt die Sekretion des Reporters in Reaktion aufER Kalzium Erschöpfung. Die Verfahren zur Verwendung einer Luciferase beruht, sezerniert ER Calciumüberwachungsprotein (SERCaMP) zum in vitro und in vivo-Anwendungen werden hier beschrieben. Dieses Video zeigt Leber Injektionen, pharmakologische Manipulation von Gluc-SERCaMP, Blutentnahme und Verarbeitung, und Assay-Parameter für Längs Überwachung der ER Kalzium.

Die Gluc-SERCaMP Methode ermöglicht die Beurteilung ER Calcium-Homöostase durch Abtasten extrazellulären Flüssigkeiten. Mehrere Steuerungen können in der Versuchsplanung einbezogen werden, um die Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Erstens kann die Verwendung eines konstitutiv sezerniertes Reporter (zB Gluc ohne die C-terminale ASARTDL oder &quot;Gluc-No tag&quot;) eingesetzt werden, um die Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf den sekretorischen Weg (global zellulären Sekretion) und Transg...

Die Kalziumhomöostase des endoplasmatischen Retikulums ist bei verschiedenen Pathologien gestört. Ein sezernierter ER-Calcium-Monitoring-Protein-Reporter (SERCaMP) kann verwendet werden, um Störungen im ER-Kalziumspeicher zu erkennen. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Gaussia-Luciferase-SERCaMP zur Untersuchung der ER-Calciumhomöostase in vitro und in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zeitliche Entwicklung einer Dysregulation des Calciumhaushalts im endoplasmatischen Retikulum mithilfe eines sezernierten Reportereiweißes zu überwachen. Dies wird durch eine virale Vektor-vermittelte Transgenese des Zielgewebes, insbesondere der Leber, erreicht. In diesem Beispiel wird nach der Expression des Gai-Luciferase-Circa-Reporters eine biologische Körperflüssigkeit wie beispielsweise Blut gesammelt, um die Menge des aus dem Gewebe freigesetzten Circa zu bestimmen. Anschließend wird das Luciferase-Substrat zu den Plasma-Proben hinzugefügt und die Lumineszenz gemessen, um den Kalziumverlust im ER zu ermitteln.Die Ergebnisse zeigen eine Dysregulation des Calciumhaushalts im ER, wie durch erhöhte Spiegel von PlasmacAMP angezeigt wird. Der Calciumhaushalt im ER kann über längere Zeiträume hinweg durch wiederholte Entnahme kleiner Mengen biologischer Flüssigkeiten überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie niedrig-affinen Calciumfarbstoffen oder genetisch kodierten Calciumindikatoren besteht darin, dass der Calciumhaushalt im ER über die Zeit hinweg in vivo mittels eines minimalinvasiven Verfahrens überwacht werden kann. Es gibt zwei therapeutische Ansatzpunkte für diese Technik.Die erste Methode besteht darin, Wirkstoffe zu screenen, die die Kalziumhomöostase im endoplasmatischen Retikulum (ER) im normalen physiologischen Zustand aufrechterhalten oder wiederherstellen können. Der zweite Ansatz zielt darauf ab, therapeutische Proteine so zu modifizieren, dass sie zu therapeutischen AMPs werden, deren Sekretion als Reaktion auf eine Kalziumverarmung im ER erfolgt. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Dysregulation der ER-Kalziumhaushaltsregulation in der Leber liefern.Es kann auch auf andere Organsysteme wie Gehirn, Herz, Muskulatur oder Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Nach der Anästhesie einer Sprague-Dawley-Ratte gemäß dem beschriebenen Protokoll Augensalbe auftragen und einen Schwanzquetschtest durchführen, um die Anästhesie zu überprüfen. Den Bereich des Abdomens leicht unterhalb der Rippen bis zum mittleren Bauchbereich rasieren und die Operationsstelle dreimal abwechselnd mit Betadine und 70 %igem Ethanol desinfizieren. Anschließend die Ratte in Rückenlage auf einem sterilen Operationsfeld platzieren, mit sterilen Operationsabdeckungen abdecken und eine a v gluc samp auf die vom Anwender optimierte Konzentration verdünnen.In diesem Fall verwendeten wir 7,6 × 10⁹ virale Genome pro Milliliter und mischten die Lösung durch mehrmaliges Umkippen des Reaktionsrohrs. Danach pipettieren Sie 105 µL des verdünnten AAV in eine sterile Schale und sammeln das Virus mit einer Nadel der Größe 30 Gauge in einer Spritze auf. Markieren Sie die gezielte Schnittstelle, um die Leber für die Injektion mit einem Skalpell freizulegen.Führen Sie einen horizontalen Schnitt von etwa zwei bis drei Zentimetern Länge unterhalb des Rippenbogens durch. Lösen Sie das Bindegewebe vom Hypodermis durch stumpfe Dissektion. Durchtrennen Sie die Bauchmuskulatur, um das rechte mediale Leberlappen freizulegen.Als Nächstes bringen Sie das Tier unter ein Operationsmikroskop und justieren es so, dass das rechte mediale Leberlappen im Sichtfeld liegt. Injizieren Sie dann mit der Spritze ein Drittel des Gesamtvolumens des Virus an drei Stellen in das Parenchym des rechten medialen Leberlappens, wobei die Nadel nach der Injektion fünf bis zehn Sekunden im Gewebe verbleibt, um eine vollständige Applikation des Injektionsvolumens sicherzustellen. Nähen Sie danach den Bauchmuskel und den Schnitt und tragen Sie mit einem Wattestäbchen Neosporin auf. Stellen Sie die Ratte in eine Erholungskammer, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt und in der Lage ist, eine aufrechte Position beizubehalten, bevor Sie das Tier in einen einzelnen Käfig zurückbringen.Vier bis sieben Tage nach der Injektion. Bereiten Sie die Blutentnahmeröhrchen vor, indem Sie sie beschriften und vorwiegen. Geben Sie dann jeweils 50 µL einer Heparinlösung mit 1000 Einheiten pro Milliliter in jedes Röhrchen.Nach der Anästhesie der Ratte gemäß dem Textprotokoll einen Schwanzreiz testen, um die Sedierung zu überprüfen, und mit sterilen Scheren die Schwanzspitze etwa ein bis zwei Millimeter vom Ende entfernt abschneiden. Mehr als 100 Mikroliter Blut tropfenweise in ein vorab mit Heparin befülltes Gefäß sammeln, um die Blutung zu stoppen.Verwenden Sie einen feuchten Wattetupfer, um STIC-Pulver auf den Schwanz aufzutragen. Reinigen Sie die Schere mit einem Ethanol-Tupfer und desinfizieren Sie sie durch Aufglühen zwischen den einzelnen Probenentnahmen. Lagern Sie die Blutröhrchen bei vier Grad Celsius.Wenn nachfolgende Proben gesammelt werden, wiegen Sie die Sammelröhrchen und passen Sie das Heparin an, um ein Verhältnis von zwei Teilen Blut zu einem Teil Heparin zu erhalten. Dieser Schritt standardisiert die Menge an Heparin in jeder Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Überführen Sie das plasmatische Überstand in ein frisches Röhrchen und lagern Sie es bis zu 72 Stunden bei vier Grad Celsius oder langfristig bei minus 80 Grad Celsius für den Luciferase-Assay, um Thaa Garin als positiven Kontrollstoff zu verwenden. Verdünnen Sie in Ethanol auf eine Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter. Anschließend injizieren Sie intraperitoneal im unteren Bauchbereich mit ein Milligramm pro Kilogramm.Entnehmen Sie die erste Blutprobe 24 Stunden nach der Injektion, wie oben beschrieben. Um die Lumineszenz zu messen, bereiten Sie das Selen Ezine-Arbeitssubstrat gemäß dem Textprotokoll vor und inkubieren es 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.Unterdessen alle Proben auf Eis auftauen und 10 Mikroliter Plasma mit einem Plattenreader, der in der Lage ist, Biolumineszenz zu messen und mit einem Substrat-Injektor ausgestattet ist, in eine opake Mikrotiterplatte überführen. Die Leitungen mit Substrat spülen. 100 Mikroliter Substrat in eine Vertiefung injizieren.Schütteln Sie für fünf Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit und messen Sie die Lichtemission für in-vitro-Proben. Integrieren Sie die Lichtemission über 0,5 Sekunden für den Re-Schritt und für in-vivo-Proben über fünf Sekunden, wobei der Lese-Schritt zur Beurteilung der Calciumhomöostase dient. Mithilfe der Gluc-SAR-cAMP-Methode können mehrere Kontrollen einbezogen werden, wie beispielsweise ein konstitutiv sekretierter Reporter, in diesem Fall Gluc Noag.Ein Anstieg der extrazellulären Konzentrationen sowohl von GLUC SAR camp als auch von Gluc noag als Reaktion auf experimentelle Bedingungen würde als eindeutiges Ergebnis betrachtet. Hingegen deutet ein Anstieg der Gluc SAR camp-Sekretion ohne gleichzeitige Reaktion von Gluc noag auf ein Ereignis hin, das von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum abhängig ist. Pharmakologische Modulatoren des Calciumspeichers im endoplasmatischen Retikulum können verwendet werden, um den Beitrag von ER-Calcium zur Freisetzung von SAR camp in neuen Versuchsansätzen zu bestätigen.Beispielsweise hemmt Dantrolen, ein INE-Rezeptorantagonist, der das Kalzium im ER stabilisiert, die Freisetzung von SAR-cAMP als Reaktion auf Thic-Argon. Bei In-vitro-Studien unter Verwendung von gluc-basiertem SAR-cAMP sollte die durch die Behandlung hervorgerufene Reaktion am besten über einen Zeitverlauf hinweg bewertet werden. Durch die Verfolgung von Änderungen der relativen Antwort innerhalb einer Platte im Vergleich zu Kontrollen ist es nicht ratsam, Rohwerte über mehrere Platten hinweg zu vergleichen, da der Zerfall des Substrats zu Veränderungen der Rohwerte führen kann. Bei In-vivo-Studien sollten die Daten für jedes Tier einzeln ausgewertet werden, wobei jedes Tier als eigene Vorbehandlungskontrolle dient.Dies ist erforderlich, um die Variabilität in der Transgenübertragung und -expression zwischen den Tieren zu berücksichtigen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mithilfe der Sircam-Technologie die Kalziumregulation im endoplasmatischen Retikulum in Nagetiermodellen der Lebererkrankung untersuchen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Quelle: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. (2019)Das Video demonstriert die Fluoreszenzbildgebung zur Beobachtung der kompartimentspezifischen spontanen Kalziumdynamik in Astrozyten durch sequentielle Überwachung von Kalzium-sensitiven Proteinen, die auf der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind.

Spontane Kalzium-Bildgebung für kompartimentspezifische Dynamik in Astrozyten

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) unterstützt die Analyse der intrazellulären Kalzium-Speicher der Dynamik von Fluoreszenz-Bildgebung. Das Verfahren stützt sich auf Targeting eines rekombinanten Carboxylesterase zum Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo es verbessert die lokale Entlarvung von synthetischen niedriger Affinität...

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Analyse von Kalziumsignale in Pflanzen durch die Fütterung von hemipteran Insekten wie Blattläuse generiert. Arabidopsis Thaliana verwandelt mit der GFP-Kalzium-Biosensor GCaMP3 erlauben die Echtzeit- in-Vivo Bildgebung von Kalzium Dynamik mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten menschlichen Darmorganoiden und bietet einen Ansatz für die Analyse.

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

Erfahren Sie, wie Sie das endoplasmatische Reticulum-Calcium mit Gaussia-Luciferase-SERCaMP in Lebergewebe überwachen. Diese Methode ermöglicht minim-invasive Langzeitstudien zur Calciumhomöostase.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein

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