Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, experimentell ganze Netzhaut-Implantate aus Hühnerembryonen zu isolieren, zu manipulieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst beide Augen eines Hühnerembryos entnommen und in eine Petrischale gelegt werden. Im zweiten Schritt werden die Sklera und das Pigmentepithel mit feinen Pinzetten entfernt.

Anschließend wird der gesamte retinale Explant mittels flacher, runder Elektroden einer Elektroporation mit Plasmid-DNA unterzogen. Der letzte Schritt besteht darin, den retinalen Explanten in Kulturmedium in einer 24-Loch-Platte im Inkubator zu inkubieren.

Letztendlich werden die gesamten Netzhautimplantate fixiert, kryoseziiert und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert, um die retinalen Neuronen sichtbar zu machen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise OVO-Elektro-Operationen, liegt darin, dass sie schnell, einfach durchzuführen und reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklung des zentralen Nervensystems zu beantworten, beispielsweise wie die Neurogenese durch spezifische chemische Reagenzien wie Enzyminhibitoren oder Genprodukte, die auf den Zellzyklus nach der Inkubation abzielen, beeinflusst wird.

Legen Sie die Eier im gewünschten embryonalen Entwicklungsstadium in die sterilen Arbeitsbank und wischen Sie die Eierschalen mit 70 %igem Ethanol ab, um eine Kontamination des Embryos zu vermeiden. Schlagen Sie die Seite des Eis kräftig gegen eine harte Oberfläche, um das Ei zu öffnen, und geben Sie den Inhalt anschließend in eine 100 Millimeter große Petrischale. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um den Embryo in eine 35 Millimeter große Petrischale zu überführen, die mit vorerwärmtem PBS bei 37 Grad Celsius gefüllt ist, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet.

Als Nächstes das Embryo enthaupten und die 35 Millimeter große Petrischale mit dem embryonalen Gewebe unter ein binokulares Stereomikroskop in der laminaren Flusswerkbank stellen. Mit feinen Pinzetten unter dem Stereomikroskop einen Einschnitt durch den Mundbereich ventral zum Auge machen. Beginnend an der Einschnittstelle das das Auge umgebende Gewebe ringsum aufreißen.

Als Nächstes den Sehnerv abklemmen und das intakte Auge aus der Augenhöhle entfernen. Sammeln Sie sowohl das linke als auch das rechte Auge aus demselben Embryo, um es entweder als Kontroll- oder behandeltes Auge zu verwenden. Überführen Sie die Augen mithilfe eines kleinen Löffels in eine neue 35-Millimeter-Petri-Schale, die vorgewärmtes PBS enthält, unter Verwendung feiner Pinzette.

Entfernen Sie das gesamte Gewebe um das Auge herum, einschließlich der Sklera am Laga. Danach machen Sie einen kleinen Einschnitt in das Pigmentepithel am dorsalen Teil des Auges, wobei Sie darauf achten müssen, die Netzhaut nicht zu beschädigen. Öffnen Sie dann vorsichtig das Pigmentepithel, beginnend an der Stelle des Einschnitts.

Lassen Sie die Linse und die gesamte Netzhaut am Glaskörper angeheftet. Entfernen Sie das Pigmentepithel unter besonderer Vorsicht entlang des Ziliarkörpers um die Pupille im vorderen Augenbereich und entlang des Choroidea-Schlitzes, da es an diesen Stellen schwierig ist, es zu entfernen. Schalten Sie das Gerät ein und stellen Sie die Spannung auf 15 Volt für eine Netzhaut im Hamburger- und Hamilton-Entwicklungsstadium 20 bis 25 oder auf 20 Volt für eine Netzhaut im Stadium 26 bis 27 ein.

Als Nächstes stellen Sie die Pulswiederholungen auf fünf Pulse mit einer Pulsdauer von 50 Millisekunden und einsekündigen Intervallen ein. Verwenden Sie einen Pulsgeber, der über ein Fußpedal am Boden gesteuert werden kann, da beide Hände benötigt werden, um die Elektroden in Position zu halten. Schließen Sie zwei speziell angefertigte, flache Platinelektroden in Form von Paddeln an die Ausgangsbuchse des Pulsgebers an.

Die hier gezeigten Elektroden wurden aus 0,1 Millimeter dicken Platinplättchen hergestellt, und der 0,8 Millimeter dicke Verbindungsdraht war isoliert. Übertragen Sie mithilfe von Plastikschlauch vorsichtig das gesamte retinale Explan auf eine Vertiefung mit einer Polyethylen-Pasteurpipette, deren Ende abgeschnitten wurde. Vermeiden Sie den Gebrauch von Pipettenspitzen, da die Netzhaut dazu neigt, am Kunststoff anzuhängen und auseinanderzureißen.

Verwenden Sie anschließend eine 100-Mikroliter-Pipette, um vorsichtig die gesamte PBS-Flüssigkeit um das retinale Explantat herum zu entfernen. Achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren, um ein Einreißen zu vermeiden. Geben Sie 100 Mikroliter der verdünnten Plasmidlösung zum QVE hinzu und stellen Sie sicher, dass das gesamte retinale Explantat mit der Lösung bedeckt ist.

Drücken Sie die Retina vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, falls sie nach oben aufsteigt. Positionieren Sie mit Elektrodenpinzetten die Linse so, dass sie einer beliebigen Seite der Schale zugewandt ist, und richten Sie den Sehnerv nach unten in die Schale. Danach platzieren Sie die positive Elektrode vor der Linse und die negative Elektrode hinter der Retina, ohne das Gewebe zu berühren.

Wenden Sie den Strom an, indem Sie das Fußpedal niedertreten, und prüfen Sie, ob Bläschen an den Elektroden auftreten, was auf eine erfolgreiche Entladung hinweist. Entfernen Sie mit einer 100-Mikroliter-Pipette die gesamte Plasmidmischung aus der Qve, ohne die Netzhaut zu beschädigen. Die Plasmidmischung kann drei bis fünfmal wiederverwendet werden, nachdem das Plasmid entfernt wurde.

Füllen Sie die Schale mit vorgewärmtem PBS auf. Lösen Sie die retinale Explante vorsichtig mit einer Pinzette von der Wand der Schale. Überführen Sie dann mithilfe der Polyethylen-Pipette die gesamte retinale Explante in eine 24-Loch-Platte, die ein Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium enthält.

Medium inkubieren Sie nur ein retikulares Explan pro Brunnen. Inkubieren Sie das retikulare Explan bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 auf einem Rotationskolben mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 U/min. Die Rotation gewährleistet eine maximale Belüftung durch das Medium und verhindert die Adhäsion der Netzhaut an den Boden der 24-Loch-Platte.

Nach 24 Stunden Kultivierung waren GFP-positive Zellen in einem großen Teil der intakten Netzhaut sichtbar, da die Elektroporation dazu führte, dass ein großer Bereich der Netzhaut das Plasmid aufnahm und das Reportergen exprimierte. Nach dem Einbetten konnten einzelne GFP-positive Zellen entlang der basalen ACO-Achse der Netzhaut leicht nachgewiesen werden. Das gesamte Netzhaut-Explant kann etwa 24 Stunden länger kultiviert werden.

Die Inkubationszeiten können zu einer Entwicklungsverzögerung, morphologischen Missbildungen, Apoptose und letztlich zur Auflösung der Netzhaut führen. Ein Schnitt aus einer ganzretinalen Explantenkultur, die 24 Stunden lang inkubiert wurde, wurde immunhistochemisch mit Phospho-Histon Drei gefärbt, das hier im roten Kanal erscheint. Phospho-Histon Drei markiert Zellen in der späten G2/M-Phase. Die pH3-positiven Zellen befanden sich an der apikalen Seite der Netzhaut, was mit einer normalen Netzhautentwicklung übereinstimmt.

Wie hier gezeigt, kann diese Entwicklung durch die Zugabe eines CDK1/2-Inhibitors blockiert werden; die Inkubation mit dem Inhibitor vier Stunden vor der Bildgebung verringerte signifikant die Anzahl pH3-positiver Zellen in der Netzhaut nach ihrer Entwicklung. Diese Technik wurde erfolgreich angewandt, um die Genexpression von neuen DNA-Plasmiden zu untersuchen und Netzhaut-Explantate mit chemischen Reagenzien zu behandeln, einschließlich Regulatoren des DNA-Schadenswegs und des Zellzyklus. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie In-vivo-Elektroporation durchgeführt werden, um die Ergebnisse weiter zu bestätigen.