Name: Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Kultivierung von retinalen Explantaten aus Hühnerembryonen für Elektroporation und Reagens-Behandlungen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Entwicklungsbiologie.

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Die Arbeit wurde unterstützt von Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond und St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Dieses Protokoll wird in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der Association for Research in Vision und Augenheilkunde&quot; durchgeführt. 1. Egg Handhabung und Augen Sammlung <ol><li> Bewahren weißen Leghorn Eier bei 12-14 ° C nicht länger als 1 Woche. Falls verfügbar, verwenden Sie einen gekühlten Weinkühler, um die befruchtete Eier zu speichern. Hinweis: Höhere Speichertemperaturen führen zu abnormalen Entwicklung von Embryonen, niedrigere Temperaturen erhöht Sterblichkeit. Erweiterte Speicherzeit erhöht sowohl die Mortalität und abnorme Entwicklung. </li><li> Die Eier in einer 37,5 ° C und 60% befeuchteter Eibrutkasten inkubiere unter leichtem Schütteln bei einer Frequenz von 5 mal pro 24 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die eingelegten Bruteier aus dem Eibrutkasten an der gewünschten embryonalen Alter. Hinweis: Das Alter des Hühnerembryo ist als die Zeit der Inkubation bestimmt und als embryonale Tagen (E) oder als Stufen bezeichnet (st) Entsprechend der Reihe der von Hamburger und Hamilton 12 beschriebenen Entwicklungsstadien wirksam. </li><li> Legen Sie die ausgewählten Eier im Laminarströmungshaube. Wischen der Eischale mit 70% Ethanol, um eine Verunreinigung des Embryos zu vermeiden. Hinweis: Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen mit sterilen Lösungen <url> https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> und Instrumente. </li><li> Tippen Sie auf die Seite des Eis fest gegen eine harte Oberfläche zu knacken das Ei. Platzieren Sie den Inhalt in einer 100 mm Petrischale. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um den Embryo auf eine 35 mm Petrischale mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS, um das Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern, übertragen. </li><li> Legen Sie die 35 mm Petrischale mit den embryonalen Gewebes auf eine binokulare Stereo Binokular in der Sterilbank. Enthaupten den Embryo durch Kneifen der Hals mit feinen Pinzetten und entsorgen Sie den Körper. </li><li> Verwenden feinen Pinzette, um einen Einschnitt th machenGrob der Mund, Bauch für das Auge. Beginnend an der Stelle des Einschnitts, der das gesamte Auge umgebende Gewebe aufzureißen. Kneifen Sie den Sehnerv und aus der Augenhöhle zu entfernen die intakte Auge. Sammeln sowohl das linke und rechte Auge von der gleichen Embryos zur Verwendung als entweder die Kontrolle oder die behandelten Auge. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Augen zu einem neuen 35-mm-Petrischale mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS übertragen. </li></ol> 2. Herstellung von Whole Retinal Explantate <ol><li> Verwenden feinen Pinzette, um alle Gewebe um das Auge zu entfernen, einschließlich der skleralen anlage. Hinweis: Das Gewebe wird leicht lösen Verlassen der Netzhaut auf den Glaskörper und die Linse mit dem Pigmentepithel intakt (1A-B). </li><li> Verwenden feinen Pinzette, ein kleiner Schnitt in die Pigmentepithel an der dorsalen Teil des Auges, ohne die neuronale Netzhaut (1C) einklemmen. </li><li> Verwenden feinen Pinzette vorsichtig aufreißen das Pigmentepithel starting an der Stelle des Einschnitts, wobei das Objektiv und die gesamte Netzhaut in den Glaskörper (1D) befestigt ist. Das Auge halten in warmem (37 ° C) 1x PBS, um das Entfernen des Pigmentepithels erleichtern. Anmerkung: Die Pigmentepithel schwierig sein kann, zu entfernen, insbesondere entlang der Ziliarkörper um die Pupille in die vordere Augenbereich, und entlang der Ader Fissur. Daher können einige der Pigmentepithel auf der neuronalen Netzhaut (1E-F) verbleiben. </li></ol> 3. Behandlung von Whole Retinal Explantate <ol start="1"><li> Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate Anmerkung: Die Elektroporation ganzer retinalen Explantate können direkt nach der Stufe 2 durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung Kulturmedium, das 1: 1 DMEM: F12 Nutrient Mix, 10% FBS, 10 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5 ug / ml Insulin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Schneiden Sie ein 1,5-ml-Einweg-Kunststoff-Küvetten (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (oder einem kleinen Behälter halten können 300-400 &amp; mgr; l Lösung) etwa 8 mm von der Unterseite mit einem feinen Blatt-Säge. </li><li> Verdünnt das DNA-Plasmid der Wahl in 1xDPBS bis zu einer Endkonzentration von 0,1 ug / ul. </li><li> Schalten Sie die Elektroporator und eingestellten Parameter auf 15 V für ST20 - ST25 (E3-E4) Netzhaut und 20 V für ST26 - ST27 (E5) Netzhaut. Stellen Sie die Pulswiederholungen bis 5 Impulsen von 50 ms Pulslänge bei 1 sec Intervallen. Verwenden Sie einen Impulsgenerator, der von einem Fußpedal auf dem Boden gesteuert werden können, da beide Hände benötigt werden, um die Elektroden in Position zu halten sein werden. </li><li> Schließen Sie zwei Paddle-förmig (flach, rund Durchm. 4 mm) von Platinelektroden (2A) an die Ausgangsbuchse des Impulsgenerators. Hinweis: Die Platinelektroden in diesem Protokoll verwendet wurden von der Universität Werkstatt. Die Elektroden wurden aus 0,1 mm Platinplatte &quot;Rondelle&quot; (950 Pt / Cu 5 Platin-grade) hergestellt. Das Verbindungs ​​0,8 mm wire wurde mit Kunststoffschlauch isoliert. </li><li> Die ganze Netzhaut Explantation sorgfältig über aus Schritt 2.3 in die Küvette (oder gleichwertig kleinen Behälter) mit einem Polyethylen Pasteur-Pipette mit der Spitze abgeschnitten, um den richtigen Tipp-Öffnungsgröße für die Netzhaut Explantation zu erwerben. Vermeiden Sie die Verwendung von Pipettenspitzen, wie die Netzhaut neigt dazu, mit dem Kunststoffbringen und zu zerreißen. </li><li> Verwenden Sie ein 100 ul Pipette vorsichtig die gesamte 1x PBS rund um die Netzhaut Explantation die Betreuung der Netzhaut, um nicht zu zerreißen nicht zu berühren. </li><li> 100 l Plasmid-Lösung in die Küvette, die gesamte Netzhaut Explantation zu decken. Drücken Sie vorsichtig den Netzhaut Explantat mit einer Pinzette, wenn es an die Spitze treibt. Verwenden einer Pinzette oder Elektroden, um die Linse zu positionieren, um jede der einen Seite der Küvette und den Sehnerv zum Boden der Küvette zugewandt. </li><li> Platzieren der positiven Elektrode vor der Linse und der negativen Elektrode hinter der Netzhaut (2A), ohne Berührung des Gewebes. </li><li>Übernehmen Sie die aktuelle durch Niederdrücken des Fußpedals. Prüfen Sie, ob Luftblasen an den Elektroden anzeigt erfolgreiche Entlastung. </li><li> Verwenden Sie ein 100 ul-Pipette, um alle, die das Plasmid-Mix aus der Küvette ohne Beschädigung der Netzhaut zu entfernen. Die Plasmid-Mix kann drei bis fünf mal wiederverwendet werden. </li><li> Füllen Sie die Küvette mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS. Verwenden einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie die Netzhaut Explantation von der Wand der Küvette. Nach der Elektroporation der Retina wird manchmal mit Blasen bedeckt ist, die sie an die Wand der Küvette haften lässt. </li><li> Verwenden Sie die Polyethylen Pasteur-Pipette, um die gesamte Netzhaut Explantation in eine 24-Well-Platte mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium pro Vertiefung übertragen. Inkubieren einer Netzhaut Explantat pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren retinalen Explantat bei 37 ° C auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 UpM in einer Zelle Inkubator mit 5% CO 2 für 24 Std. Die Rotation ist, um maximale Exposition gegenüber dem Medium und preve sicherzustellen,nt Haftung der Netzhaut an der Unterseite der Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 4. </li></ol></li><li> Behandlung der gesamten Retina Explantate mit chemischen Reagenzien Hinweis: Die chemische Behandlung der gesamten Netzhaut Explantate können direkt nach der Stufe 2 durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung Kulturmedium, das 1: 1 DMEM: F12 Nutrient Mix, 10% FBS, 10 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5 ug / ml Insulin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Netzhaut Explantation aus Schritt 2.3 in eine 24-Well-Platte mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium pro Vertiefung übertragen. Inkubieren einer Netzhaut Explantat pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren des gesamten Retina Explantat für 60 min bei 37 ° C auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 UpM in einer Zelle Inkubator mit 5% CO 2 vor der Zugabe eines chemischen Reagens oder Vehikel. </li><li> Vorbereitung der chemischen Lösung, beispielsweise Cdk1 / 2-Inhibitor III, einem Inhibitor der M-Phasenverlauf 13 in einer endgültigenKonzentration von 30 &amp; mgr; M in DMSO. </li><li> Entfernen Sie den 24-Well-Platte, das die gesamte Netzhaut Explantation, aus der Zelle Inkubator. Zugabe von 10 ul des chemischen Reagens oder Vehikel (DMSO) direkt auf die Netzhaut-Medium, was zu einer Endkonzentration von 300 nM Cdk1 / 2-Inhibitor III in 0,01% DMSO. Manuell drehen Sie den 24-Well-Platte, um für eine gleichmäßige Verteilung des chemischen Reagens oder ein Fahrzeug in der Lösung zu ermöglichen. </li><li> Das Retina Explantate bei 37 ° C inkubieren, auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute, in einer Brutschrank mit 5% CO 2 für die gewünschte Zeit (bis zu 24 h). </li><li> Fahren Sie mit Schritt 4. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Einfrieren von Whole Retinal Eexplants <ol><li> Entfernen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die das behandelte gesamte Netzhaut Explantation aus der Zelle Inkubator. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskaltem 4% Paraformaldehyd in 1xPBS übertragen. Incubate auf Eis für 15 min. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskalt 1xPBS um die Netzhaut zu waschen übertragen. Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskaltem 30% Saccharose in 1xPBS übertragen. Inkubieren auf Eis für 1-3 h in Abhängigkeit von der embryonalen Tag der Retina. Für ST20 - ST25 (E3) der Netzhaut, Inkubation für 1 h, müssen ältere Retina längere Inkubationszeit in Saccharose. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine Paraffinschicht, die etwa 500 &amp; mgr; Kryostaten Einfrieren Montagemedium zu übertragen. Entfernen Sie so viel Saccharose wie möglich durch leichtes Bewegen des retinalen Explantation im Gefriermedium mit dem kleinen Löffel. </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut Explantation auf eine Einbettform haltige Gefriermedium. Positionieren Sie den Blick auf künftige Schnitte erleichtern. Legen Sie die Einbettform, das die gesamte Netzhaut Explantation auf dry Eis, bis das Medium fest gefroren. Bei -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commu%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res+Dev+brain+re%22%5BJournal%5D)">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+US%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+eye+re%22%5BJournal%5D)">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li>
<li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li>
<li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Präparation, Elektroporation oder chemische Behandlung, und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen wird vorgestellt. Dieses Protokoll ist einfach, schnell und ermöglicht sowohl eine hohe Erfolgsrate und reproduzierbare Ergebnisse. Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate produziert große Bereiche der Zellen, die das Gen-Konstrukt von Interesse exprimieren. Es ist leicht, die Elek...

Die Retina ist ein Teil des zentralen Nervensystems, und es ist mit seiner relativen Einfachheit und gut charakterisierte Zellarchitektur, ein beliebtes Modell zum Studium der Entwicklung des zentralen Nervensystems. Das Auge des Hühnerembryo ist im Vergleich zu dem Rest des Embryos relativ groß. Es ist daher in ovo für experimentelle Manipulationen, wie Injektionen oder Elektroporation leicht zugänglich ist, und dient als ein hervorragendes Werkzeug, um das Wissen über Netzhaut Zell- und Entwicklungsbiologie in vivo zu gewinnen. Trotz dieser großen Vorteile, kann das Überleben der Embryonen niedrig sein, wenn Experimente sind invasive, wie mit Elektroporationen, wiederholte Injektionen oder kombinierte experimentelle Manipulationen. Elektroporation von DNA-Plasmiden in den Hühnerembryo in ovo ist ein wichtiges und gut etablierte Technik 1. Es ermöglicht die Kennzeichnung von Neuronen, das Aufspüren des Zellschicksals und neuronalen Bahnen im zentralen nervous System und es ermöglicht die ektopische Genexpression auf Proteinfunktion in vivo zu analysieren. Die Technik hat sich für die Untersuchung der neuronalen Rohr 2 eingesetzt wurde, Rautenhirn 3 und 4 Retina. Elektroporation der embryonalen Retina in ovo hat einige experimentellen Schwierigkeiten, die der Situation in vivo in Zusammenhang stehen. Die Position des Auges, durch den Schädel Faltung des Embryos, relativ nahe an das Herz. Diese Nähe erhöht das Risiko von Herzstillstand nach der Elektroporation und das Risiko steigt mit dem Alter des Embryos. Darüber hinaus, um das Auge gelangen, ist es notwendig, die Eihüllen zu öffnen, wodurch das Risiko für Blutungen, Fehlbildungen und anschließende verminderte Lebensfähigkeit zu. Bei der Prüfung und Optimierung einer neuen DNA-Plasmid, oft ohne bekannte phänotypische Ergebnis können diese Einschränkungen der Wirksamkeit und Leistung des Verfahrens selbst für einen erfahrenen Experimentator zu verringern. Wie in diesem Protokoll der Kultur der w vorgestelltLoch retinalen Explantat, definiert als die gesamte neurale Retina mit Pigmentepithel entfernt wird, ist eine effiziente Methode, die in ovo Ansatz ergänzt. Intraokulare Injektionen von chemischen Reagenzien sind relativ einfach in ovo auszuführen. Jedoch kann die effektive und genaue Konzentration der injizierten Reagenzien innerhalb des neuralen Retina schwierig, vollständig zu steuern. Das injizierte Volumen durch Lecks variieren und die genaue Stelle der Injektion kann sowohl die Verteilung des Reagens in das Auge und die Diffusion durch den Glaskörper zu beeinflussen. Die Variabilität wird erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse, wenn dh eine Dosis-Antwort-Kurve für einen Enzym-Inhibitor festgestellt haben; Insbesondere, wenn der Effekt klein ist und die Zeitfenster der Effekt ist gering. Darüber hinaus nur ein einziges Auge kann von jedem Embryo bei der Durchführung von in-ovo-Experimente durch, um mögliche systemische Wirkungen über den Blutstrom verwendet werdenauf das andere Auge. Alter Anpassung ist wichtig, wenn das Studium der Entwicklung und die individuelle Variabilität zwischen behandelten und Kontroll Embryonen zu zusätzlichen experimentellen Variabilität führen. Aus diesen Gründen wurde ein ex ovo Verfahren basierend auf retinale Explantaten aus Hühnerembryos entwickelt, bei dem das neurale Retina kann zu einer gleichmäßigen und kontrollierten ausgesetzt experimentellen Bedingungen in vitro werden. Die vorliegende Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Protokolle 5-9 entwickelt. Retinal Explantate aus Stufe (St) 20 (embryonalen Tagen [E] 3) bis ST31 (E7) Hühnerembryonen wurden präpariert, kultiviert und Elektroporation mit einer definierten DNA-Plasmid-Konzentration oder zu einem Medium, das eine definierte Konzentration eines chemischen Reagens ausgesetzt wird. Das hier vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in jüngsten Veröffentlichungen implementiert, unter Verwendung mehrerer verschiedener chemischer Reagenzien, einschließlich Regulatoren der DNA-Schaden-Weges, wie KU55933, SB 218.078 und NSC 109555 ditosylate und der Zellzyklus wie Cdk1 / 2-Inhibitor III 10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (Tablette)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Einweg-Kunststoffküvette</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2-Inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM in 0,01 % DMSO</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Elektroden</td><td></td><td></td><td>Platina, Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Elektro-Quadratporator ECM 830</td><td>Harvard Apparatur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nährstoffmischung</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermedium NEG50</td><td>Cellab, Schweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP exprimierendes DNA-Plasmid (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Befeuchteter Inkubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Deutschland</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium ProLong Gold mit DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinfilm</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Einbettform&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHiston 3 (PH3)</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Verdünnung 1/4.000</td></tr><tr><td>Platinelektroden (Sonderanfertigung aus "Rondellen")</td><td>Sargenta</td><td>390-R (Rondelle)</td><td>Durchmesser: 4mm, 0,1 mm Dicke</td></tr><tr><td>Platimun Elektroden&nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Durchmesser: 4 mm</td></tr><tr><td>Polyethylen-Pasteurpipette</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Rotatorschüttler</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Löffel</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>Weiße Leghorn-Eier</td><td></td><td></td><td>Lokaler Lieferant</td></tr><tr><td>Weinkühler</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole retinal explantaten aus hühnerembryonen für die elektroporation und reagens-behandlungen

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Die Retina ist ein gutes Modell für die Entwicklung des zentralen Nervensystems. Die Größe des Auges und vor allem die Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen in ovo / in vivo macht das Huhn embryonalen Netzhaut eine vielseitige und sehr effiziente Versuchsmodell. Obwohl das Huhn Netzhaut ist leicht, in ovo durch intraokulare Injektion oder Elektroporation Ziel kann die effektive und genaue Konzentration der Reagenzien in der Netzhaut schwierig zu voll Kontrolle. Dies kann aufgrund von Abweichungen von der genauen Injektionsstelle, Leckage aus dem Auge oder unebenen Diffusion der Substanzen sein. Ferner wird die Frequenz von Fehlbildungen und Mortalität nach invasive Manipulationen wie Elektroporation ziemlich hoch. Dieses Protokoll beschreibt einen ex ovo Technik zum Züchten gesamte Retina Explantaten aus Hühnerembryonen und liefert ein Verfahren zur kontrollierten Exposition der Retina Reagenzien. Die protocol beschreibt, wie zu zerlegen, experimentell zu manipulieren, und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Die Explantate können die etwa 24 h, kultiviert werden und verschiedene Manipulationen wie Elektroporation unterworfen werden. Die wesentlichen Vorteile sind, dass der Versuch nicht abhängig vom Überleben der Embryos und daß die Konzentration des eingebrachten Reagens kann variieren, und um zu bestimmen und zu optimieren, die effektive Konzentration gesteuert werden. Weiterhin ist die Technik eine schnelle, billige und zusammen mit ihren hohen experimentellen Erfolgsquote, reproduzierbar sichergestellt, Ergebnisse. Es sollte betont werden, dass es als eine ausgezeichnete Ergänzung zum Experiment in ovo ausgeführt dient.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (1A-F) und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Netzhaut Explantaten aus Embryonen von st20 (E3) zu ST31 (E7) verwendet. Elektroporation von DNA-Plasmiden zu ganzen Netzhaut-Explantate ermöglicht die Kennzeichnung und Rückverfolgung von retinalen Vorläuferzellen oder Überexpression von verschiedenen Genprodukten. Zur Elektroporation Experimenten wu...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, experimentell ganze Netzhaut-Implantate aus Hühnerembryonen zu isolieren, zu manipulieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst beide Augen eines Hühnerembryos entnommen und in eine Petrischale gelegt werden. Im zweiten Schritt werden die Sklera und das Pigmentepithel mit feinen Pinzetten entfernt.Anschließend wird der gesamte retinale Explant mittels flacher, runder Elektroden einer Elektroporation mit Plasmid-DNA unterzogen. Der letzte Schritt besteht darin, den retinalen Explanten in Kulturmedium in einer 24-Loch-Platte im Inkubator zu inkubieren.Letztendlich werden die gesamten Netzhautimplantate fixiert, kryoseziiert und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert, um die retinalen Neuronen sichtbar zu machen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise OVO-Elektro-Operationen, liegt darin, dass sie schnell, einfach durchzuführen und reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklung des zentralen Nervensystems zu beantworten, beispielsweise wie die Neurogenese durch spezifische chemische Reagenzien wie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Küken in ovo Elektroporation ist eine Technik, die genetische Manipulation der Vogelembryo ermöglicht. Typische Anwendungen für diese Technik sind die funktionelle Analyse von Genen und vermeintlichen Enhancer-Elemente. Dieses Video zeigt Neuralrohr Elektroporation in HH 10 Hühnerembryonen. Injektionstechnik und ordnungsgemäße Eibehandlung werden diskutiert.

In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Techniken zur Manipulation der Genexpression in murinen retinalen Ganglienzellen (RGC)...

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion...

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen...

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Verfahren zum Gentransfer in Hühnerembryos in späteren Stufen der Inkubation (älter als Hamburger und Hamilton Stufe (HH) 22) beschrieben. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile...

Gentransfer in Hühnerembryonen durch Ältere<em&gt; Ex ovo</em&gt; Die Elektroporation

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Wir beschreiben die Methoden für die fluoreszierenden Kennzeichnung von tangential Migration Zellen durch Elektroporation und für Zeitraffer-Aufnahmen von der markierten Zelle Bewegung in einer Wohnung-Mount-Kultur um die Migration zu visualisieren Zelle Verhalten in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum .

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Wir beschreiben eine Methode zur Gewinnung von Primärkulturen von Zapfenphotorezeptoren aus der Netzhaut von Hühnerembryonen und deren Verwendung für ein High-Content-Screening.

Mit Zapfen angereicherte Kulturen von der Netzhaut von Hühnerembryonen zur Untersuchung zellulärer Interaktionen von Stäbchen zu Zapfen

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Wir stellen eine Methode vor, die die Isolierung und Kultur von Cochlea-Explantaten aus embryonalen Maus-Innenohren beschreibt.  Wir demonstrieren auch eine Methode für den Gentransfer in Cochlea-Explantate mittels Rechteck-Elektroporation. Die In-vitro-Explantatkultur in Verbindung mit der Gentransfertechnik ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen einer Veränderung der Genexpression während der Entwicklung zu untersuchen.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Lernen Sie die Präparation und Kultivierung von retinalen Explantaten aus Hühnerembryonen für Elektroporation und Reagens-Behandlungen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Entwicklungsbiologie.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

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