Name: A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Vermehrung menschlicher pluripotenter Stammzellen auf Gelatine mit plazentaderiviertem Konditioniermedium. Diese Technik eliminiert synthetische Substrate.

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Die Autoren möchten Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Associate Professor, Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Medical College Korea University) für die Bereitstellung von Plazentagewebe danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse (R1211902) von der National Research Foundation of Korea (NRF), Republik Korea unterstützt.

Ethics Statement: Die menschlichen Plazenta Studie wurde prospektiv durchgeführt, mit Zustimmung des Institutional Review Board für die menschliche Erforschung der Korea University (AN09085-001). Alle Experimente wurden in einem Rein Germ Zimmer Anlage am Korea University Medical Center durchgeführt. Der Versuchsaufbau und Verfahren mit hPSCs wurden von der Institutional Review Board der Korea University Medical Center (AN12277-003) zugelassen. 1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Coat alle Kulturschalen mit 0,1% Gelatine. Autoklav phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Pinzette. Sterilisieren chirurgischer Scheren, Mikrozentrifugenröhrchen, und Gaze bei 121 ° C unter £ 15 psi über 15 min. </li><li> Vorbereitete vorgewärmten 0,25% Trypsin-Ethylenamin tetra-essigsäure (Trypsin-EDTA), und vorgewärmte filtrierten Kulturmedium (DMEM), das 20% fötales Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 g / ml streptomycin vor Beginn der Verfahren. </li></ol> 2. Zellisolierung aus menschlicher Plazenta <ol><li> Erhalten Plazentagewebe nach Kaiserschnitt Lieferung, die von gesunden schwangeren Frauen, die sich normal oder therapeutische Abtreibung in 7-32 Wochen der Schwangerschaft nach schriftlicher Einwilligung. </li><li> Haben die geburtshilflichen Fach chirurgisch getrennten menschlichen Plazenta chorionic Platten (HPC) aus der Plazenta; inkubieren diese in 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 20 min und dann mit 5 ml PBS waschen. </li><li> Isolieren Chorionzotten von HPC mit einer Schere; Blatt vor den Zotten und waschen Sie sie dreimal mit 1 ml PBS. Nach dem Zerkleinern, legen Sie die Chorionzotten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipettenspitze; waschen Sie die Proben mit 500 ul PBS durch Auf- und Abpipettieren und zentrifugieren die Rohre für 120 × g für 3 min. Zweimal waschen Gewebe mit 500 ul vorgewärmtes Kulturmedium. </li><li> Kulturzellen in einem Medium auf Gelatine-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 </sub&gt; und unter 95% Luftfeuchtigkeit. Precoat- alle Platten mit 0,1% Gelatine für 1 Stunde bei 37 ° C. Kolonien von Fibroblasten-ähnlichen Zellen zu bilden, und adhärente Wachstum ungefähr 5-7 Tage nach Beginn der Kultur in dem gleichen Medium. </li><li> Tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage bis zum dritten Durchgang. Während der Kultur, das Entfernen von Zelltrümmern schwebend in dem Kulturmedium; wachsenden Plazenta Fibroblasten wird an der Platte zu befestigen. Kultur die Fibroblasten-ähnliche Zellen aus dem HPC up abgeleitet, um dem 10. Durchgang und dann ernten sie für hESC-Kulturen nach Trypsinisierung und Mitomycin-C (10 ug / ml) Behandlung. </li><li> Vor dem Einfrieren HPC als Lager Proben verwenden reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), um zu bestätigen, dass HPC nicht mit Krankheitserregern, die häufig infizieren die Plazenta, einschließlich Mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M verunreinigt . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,und M. capricolum), und die Bakterienspezies, Ureaplasma urealyticum, durch die Verwendung eines Mycoplasma Detection Kit. <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RT-PCR durchzuführen, verwenden alle Primer und Mischungen im Kit enthalten. Benutzen Sie die Überstände der Zellen, die für 36 Tage auf Mykoplasmen Nachweis kultiviert wurden. Werden 3 ul dieser Proben an die PCR-Ansätze und führen die 1. PCR-Verfahren für 35 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 2 min und 72ºC für 1 min. </li><li> 0,5 ul der 1. PCR-Produkt sorgfältig in den PCR-Ansatz und führen Sie die 2. PCR-Verfahren für 30 Zyklen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Analysieren der amplifizierten Produkte von 1% Agarose-Gelelektrophorese; Anwendung 10 ul jeweils der 1. und der 2. PCR-Produkte in den Gelen. </li></ol></li><li> Wenn HPC gefunden werden, um mit Krankheitserregern kontaminiert sind, beseitigen dieseVerwendung einer Kombination von Antibiotika (BM-Cyclin) gemß den Anweisungen des Herstellers. Fügen neue Medium, das 10 ug / ml BM-Cyclin 1 für 3 Tage, und dann Behandlung der Zellen mit 5 ug / ml BM-Cyclin 2 für weitere 4 Tage. Wiederholen Sie diesen Zyklus zweimal und dann für Mycoplasmenkontamination überprüfen erneut. </li></ol> 3. Ernten Menschliche Plazenta abgeleiteten Zellen konditioniertem Medium (hPCCM) <ol><li> Nach Ausschluss der Kontamination, behandeln die anhaftenden Zellen (85-90% Zusammenfluss; (1,5 x 10 7 Zellen / Kolben) mit Mitomycin-C (10 ug / ml) für 2 Stunden und 30 Minuten, und dreimal mit 10 ml gewaschen der Zellen PBS. die Zellen mit vorgewärmten Medium inkubiert ohne Mitomycin-C für 24 Stunden. </li><li> Einen Tag nach der Behandlung, Inkubation Zellen in 10 ml Medium (DMEM-F12 mit 20% Knock-Out Serumersatz [KOSR] ergänzt, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 1% NEAA und 1% Penicillin-Streptomycin). Nach 24 Stunden Inkubation Ernte CM in einem 15 ml konischen Rohr undfiltern die CM mit einem 0,22 um Spritzenfilter. </li><li> In weitere 10 ml der neuen Medium und Inkubation. Sammle alle Überstände der Kulturen täglich für 1 Woche und frieren das geerntete Medium bei -80 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol> 4. Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) und Induktion von pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) <ol><li> Erhalten Menschliche embryonale Stammzelllinien, H1 und H9-Zellen (in der NIH hESC-Registrierung unter dem Namen WA01 WA09 und aufgeführt, respectively) und induzierten pluripotenten Stammzellen iPS-1: iPS (Vorhaut) -1 und iPS-2 (IISH1i- BM) von der WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). Zellen sollten aufgetaut und kultiviert werden nach Herstelleranweisungen. </li><li> Für die Kontrollgruppe, die Kultur Zellen auf Basalmembranmatrix-beschichteten Schalen in weit verbreiteten feeder freien und serumfreien definierten Kulturmedium bei 37 ° C in 5% CO 2. Zunächst Saatgut 80-100 Klumpen von hPSCs in 35-mm-Gerichte. Wachsen Zellen in diesen Gerichten, bis 70-80% Konfluenz und routinemäßig Gang Zellen für Unter Kultivierung einmal alle 5-6 Tage, mit mechanischen oder enzymatischen Verfahren (Dispase). Wasche die Zellen zweimal mit Medium und der Platte sie in einem Verhältnis von 1: 4. Jeden Tag Ersetzen des Mediums mit frischem Medium. </li><li> Für die experimentellen Gruppen, Kulturzellen in hPCCM auf Geschirr mit 0,1% Gelatine vorbeschichtet, und führen Routine Passagierung einmal alle 5 Tage, entweder mechanisch oder enzymatisch. Plattenzellen bei Verhältnissen im Bereich von 1: 6-1: 10. hPSCs heften sich an die Gelatine innerhalb von 2 Tagen nach der Übertragung. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium täglich. </li></ol> 5. Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzellen HINWEIS: Charakterisieren Sie hPSCs mit verschiedenen Methoden, wie alkalische Phosphatase-Färbung, Immunzytochemie, Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) und Western Blot. <ol><li> Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Für immunofluorescencE-Färbung, Kultur hPSCs und fixieren Sie die Zellen in 8-well slide Kammern mit 4% (w / v) Paraformaldehyd für 10 min; Dann permeabilisierten Zellen mit 0,1% (v / v) Triton-X100 für 15 min, und blockieren die Zellen für 1 Stunde mit 3% (v / v) normales Pferdeserum in PBS, enthaltend 0,1% (v / v) Tween- 20. Zweimal waschen PBS für 5 Minuten zwischen jedem Schritt. </li><li> Zellen, die mit dem primären Antikörper (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, Verdünnung von 1: 1000) inkubieren O / N bei 4 ° C und mit dem sekundären Antikörper. </li><li> Vor der Montage inkubieren Zellen mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 Minuten in der Dunkelheit. Wash Zellen stringent dreimal für jeweils 5 min und Trockenzellen völlig im Dunkeln. Preserve Zellen im Fluoreszenz Eindeckmedium und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten. </li></ol></li><li> qRT-PCR <ol><li> Isolieren Gesamt-RNA aus Zellen unter Verwendung eines RNeasy Mini Kit nach Herstellerangaben und Quantifizierung der extrahierten RNA mit Hilfe eines Nano-Tropfen-Spektralphotometer. </li&gt; <li> Synthetisieren cDNA durch Zugabe von 2 &amp; mgr; g der Gesamt-RNA zu einer 20 ul-Reaktionsmischung, die Oligo (dT) Primern und Superscript II Reverse Transkriptase; folgen Sie den Anweisungen des Herstellers in diesem Verfahren. </li><li> Verstärken die synthetisierte cDNA mit einem Bio-Rad iCycler iQ-System, mit iQ SYBR Green qPCR Master Mix und die in Supplemental Tabelle S1 beschriebenen Primer-Sequenzen. Normalisieren die Zyklusschwellenwerte der Gene von Interesse, die denen von Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH). </li></ol></li><li> Alkalische Phosphatase (AP) -Färbung <ol><li> Detektieren die AP-Aktivität mit Hilfe des ES-Zell-Charakterisierung Kit nach Vorschrift des Herstellers. </li><li> Am Tag 5 aspirieren die Medien und fixieren die hPSCs mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 12 min. Sie overfix nicht; Fixierung von Zellen länger als 2 min wird bei der Inaktivierung der alkalischen Phosphatase führt. Saugen Sie das Fixierungsmittel und spülen Sie mit 1x Rinse Buffer. Unterlassen SieDie Vertiefungen dürfen zwischen den Schritten zu trocknen. </li><li> Fügen Sie genug Farblösung in jede Vertiefung (1 ml pro Vertiefung einer 35-mm-Schale) zu decken. Platten im Dunkeln inkubieren bei RT für 15 min. </li><li> Nach der Inkubation spülen mit 1x Rinse Buffer. Cover-Zellen mit 1x PBS, um das Trocknen zu verhindern und zu prüfen und die Bild gefärbten Zellen unter Verwendung eines Olympus-Mikroskop. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Western Blot-Analyse durchführen, wie zuvor in 9 beschrieben. Kurz gesagt, bestimmen die Proteinkonzentrationen in Zellysaten. Lösen gleiche Mengen Protein auf einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) -Gel und den Transfer der Proteine ​​auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran. </li><li> Blockieren Sie den Blot zu sondieren und es O / N mit unterschiedlichen primären Antikörper bei 4 ° C; anschließend Inkubation des Blots mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper für 1 Std. Dreimal für jeweils 10 Minuten Zeit zwischen Inkubationen Waschen Sie die Membran. Erfassen Signale mit einem ECL-Reagenz. </li&gt; </ol></li><li> Short Tandem Repeat (STR) Analyse <ol><li> hPSCs wurden aus der Kontroll- und Versuchsgruppen gleichzeitig Gang, eingesammelt. Genomische DNA wurde unter Verwendung eines DNA Micro Kit extrahiert, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verstärken die genomische DNA für 16 verschiedene Genloci mit der AMPF / STR PCR Amplification Kit nach den Angaben des Herstellers und Kapillarelektrophorese wurde unter Verwendung eines Genetic Analyzer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).</li>
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<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+stem+cells+mesenchymal+progenitors+by+inhibition+of+TGF-beta%2Factivin%2Fnodal+using+SB-431542%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren zeigen, keine Interessenkonflikte.

Dieses Modell wurde entwickelt, um hPSCs erfolgreich zu verbreiten, unter Beibehaltung ihrer Eigenschaften, in humanisierter Einzug freien Kulturbedingungen ohne Zusatz von exogenen rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie bFGF oder Insulin, so dass die Manipulation von hPSCs in einem humanisierten Mikroumgebung. Exogenem bFGF Ergänzung ist üblich und die Anwendung von Substraten wie Matrigel oder Laminin ist für Feeder-freien Kultur von hPSCs 14. Dieses Protokoll ist einfach und leic...

Das Ziel dieses Protokolls ist die Vermehrung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) und humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), unter vollständig humanisierten ex vivo feederfreien Bedingungen, ohne dass zusätzliche exogene Supplementierung und synthetische Substrate erforderlich sind. Bisher war die Entwicklung von ex vivo hPSC-Kulturmodellen, die die Einführung von Kulturprodukten in die Klinik ermöglichen, ein großes Anliegen in der Stammzellforschung. Konkret müssen zwei kritische Probleme angegangen werden. Zunächst wird ein humanisiertes ex vivo-Kultursystem für die Vermehrung von hPSCs benötigt, das das Risiko einer Kontamination durch tierische Zellprodukte eliminiert. Zweitens ist ein Feeder-freies Kulturmodell erforderlich, um eine einfache und wirtschaftliche Massenproduktion von hPSCs zu ermöglichen. Für therapeutische Anwendungen von hPS-Zellen ist es notwendig, die Faktoren zu identifizieren, die ihre Selbsterneuerung und Differenzierung regulieren.
Seit Xu et al. ursprünglich über die Machbarkeit der Verwendung von konditionierten Medien (CM) berichteten, die aus embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) gewonnen wurden, um hESCs auf Matrigel1 zu züchten, haben viele Studien optimale ex vivo Vermehrungsmethoden für hPSCs2-4 untersucht. Ein ideales humanisiertes ex vivo Feeder-freies hPSC-Vermehrungssystem wurde jedoch nicht entwickelt, da die derzeitigen Methoden zusätzliche exogene Substrate wie bFGF und Insulin, bekannte hPSC-erhaltende Faktoren, in den Nährmedien5-7 erfordern. Darüber hinaus werden in allen feederfreien Kulturen synthetische Substrate wie Matrigel oder Laminin verwendet.
Die Begründung für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls basiert auf unseren früheren Studien, die zeigen, dass menschliche Plazenta-Chorionzellen die Vermehrung von hPSCs ohne bFGF-Supplementierung hervorragend unterstützen8-11. Dieses Protokoll hat eine Reihe von Vorteilen, darunter seine Einfachheit in Bezug auf die Handhabung und seine Kosteneffizienz, und es ist eine nahezu perfekte humanisierte Kultur, die die Vermehrung von hPSC ohne exogene synthetische Substrate ermöglicht. Die Anwendung von humanen Plazenta-abgeleiteten CM (hPCCM) bei hPSCs umfasst 3 Schritte. Zunächst werden Chorionzellen aus der menschlichen Plazenta isoliert und kultiviert. Zweitens wird hPCCM aus kultivierten Zellen hergestellt. Drittens werden hPSCs mit hPCCM kultiviert und ihre Eigenschaften werden bestätigt. 
Dieses Protokoll wird die klinische Anwendung von hPSCs und die Untersuchung der Mechanismen der hPSC-Proliferation und -Bindung erleichtern. In dieser Arbeit wird das Protokoll für die erfolgreiche Vermehrung von hPSCs in hPCCM auf einer gelatinebeschichteten Schale vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin-C</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>M4287</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Mykoplasmen-Nachweiskit</td><td>TaKaRa Bio Inc.</td><td>#6601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>#354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>#05850</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02100</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>G2500</td><td>0,10</td></tr>% <tr><td>BM-Cyclin</td><td>Roche</td><td>799 050</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop-Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#170-8882AP</td><td></td></tr><tr><td>ES-Zellcharakterisierungskit</td><td>Chemicon International, Inc.,</td><td>SCR001</td><td></td></tr><tr><td>Power cDNA-Synthesekit&nbsp;</td><td>iNtRON Biotechnologie</td><td>25011</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&reg; DNA-Mikrokit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>AmpF/STR&reg; Identifiler&reg; PCR-Amplifikationskit</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td></td><td></td>4322288</tr><tr><td>Angewandte Biosysteme&reg; 3130xl Genetischer Analysator&nbsp;</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel kultur modell für menschliche pluripotente stammzelle propagation auf gelatine in placenta anlage medien

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

Die Vermehrung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in konditioniertem Medium, das aus menschlichen Zellen unter feederfreien Kulturbedingungen gewonnen wurde, war von Interesse. Dennoch wurde keine ideale, humanisierte ex vivo Feeder-freie Vermehrungsmethode für hPSCs entwickelt; Derzeit werden allen Nährmedien zusätzliche exogene Substrate zugesetzt, einschließlich des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), eines Master-hPSC-erhaltenden Faktors, und synthetische Substrate wie Matrigel oder Laminin werden in allen feederfreien Kulturen verwendet. Vor kurzem hat unsere Gruppe ein einfaches und effizientes Protokoll für die Vermehrung von hPS-Zellen entwickelt, bei dem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta auf einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder synthetische Substrate, die für hPS-Zellen spezifisch sind. Dieses Protokoll wurde bisher noch nicht berichtet und könnte es Forschern ermöglichen, hPSCs effizient unter humanisierten Kulturbedingungen zu vermehren. Darüber hinaus verhindert dieses Modell das Risiko einer hPSC-Kontamination durch tierische Produkte wie Viren oder unbekannte Proteine. Darüber hinaus ermöglicht dieses System die einfache Massenproduktion von hPSCs unter Verwendung der Gelatinebeschichtung, die einfach zu handhaben ist und die Gesamtkosten für die Ex-vivo-hPSC-Wartung drastisch senkt.

Ein Vorteil dieser HPSC Ausbreitungsverfahrens ist, dass es Bauteile aus menschlichen Zellen sekretiert verwendet. Eine am meisten ciritical Schritt im Protokoll ist die Isolierung und Kultur von menschlichen Plazenta-abgeleitete Zellen. Dies erfordert und präzise Präparation von einer genauen Teil der HPC Platte Zotten. 1 zeigt die Vorgehensweise der menschlichen Plazenta abgeleitete Zellisolierung. Dieses Verfahren ist einfach und für die Isolierung von Zellen, und kann leicht innerhalb von 1 h durchg...

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Massenproduktion menschlicher pluripotenter Stammzellen mithilfe einer einfachen und kostengünstigen Gelatine-Beschichtung zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst das Chorion VII aus menschlichem Plazentagewebe isoliert und anschließend in einem zweiten Schritt die Zotten in kleine Gewebestücke zerkleinert werden. Die Gewebestücke werden auf mit Gelatine beschichteten Platten kultiviert, wo sie innerhalb von fünf bis sieben Tagen Kolonien von adhärenten, fibroblastenähnlichen Zellen bilden, die dann zur Herstellung von konditioniertem Medium für die Kultur menschlicher pluripotenter Stammzellen verwendet werden.Als Nächstes werden 80 bis 100 Zellklumpen menschlicher pluripotenter Stammzellen mit einem aus menschlichen Plazentazellen gewonnenen konditionierten Medium bedeckt und alle vier bis fünf Tage einmal unterteilt. Die Ergebnisse zeigen eine ähnliche Differenzierung und Zellanheftung von Zellen, die unter Goldstandard-Bedingungen kultiviert wurden, im Vergleich zu der hier beschriebenen Methode von Zellen, die auf mit Gelatine beschichteten Platten in menschlichem Plazenta-konditioniertem Medium gezüchtet wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Zugangsmethode besteht darin, dass sie Komponenten nutzt, die von menschlichen Zellen sezerniert werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung und synthetische weiche Merkmale zu erfordern.Um zu beginnen, beschichten Sie T-25-Kulturschalen mit fünf Millilitern einer 0,1 %igen Gelatine-Lösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, anschließend sterilisieren Sie 500 Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, ein Paar Pinzette, chirurgische Schere, Mikrozentrifugenröhrchen und Gazetupfer, indem Sie sie bei 121 Grad Celsius unter 15 Pfund pro Quadratzoll mehr als 15 Minuten lang im Autoklaven behandeln. Danach erwärmen Sie sterilfiltriertes DMEM, das 20 % fetalen Kälberserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Gramm pro Milliliter enthält, vor. Streptomycin wird aus chirurgisch gewonnenen menschlichen Plazentachorionplatten erhalten, die von gesunden schwangeren Frauen in der siebten bis zur 32. Schwangerschaftswoche gesammelt wurden. Nach schriftlicher, informierter Einwilligung werden die Platten mit fünf Millilitern PBS unter Verwendung eines Skalpells gespült. Das Chorion VII wird aus den menschlichen Plazentachorionplatten isoliert und das Gewebe in kleine Stücke zerkleinert.Waschen Sie die Gewebestücke anschließend dreimal mit jeweils einem Milliliter PBS, geben Sie das zerkleinerte VII in ein Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie die Proben mit einer Pipette mit 500 Mikrolitern PBS, indem Sie vorsichtig auf- und abpipettieren. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen mit 120 × g für drei Minuten, um das zerkleinerte vi eye abzutrennen. Waschen Sie das Gewebe anschließend noch zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern vorgewärmtem Kulturmedium und wiederholen Sie jeweils die Zentrifugation.Schritt zwischen jedem Waschvorgang der Kultur, dem Zerkleinern des Gewebes und dem Medium auf zuvor mit Gelatine beschichteten Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach etwa fünf bis sieben Tagen Kultur in dem gleichen Medium kann nach sieben Tagen die Bildung von fibroblastenähnlichen Kolonien mit adhärentem Wachstum beobachtet werden. Im Kulturwechsel.Während der Kultur das Medium wechseln, wobei jeglicher schwimmender Zelltrümmer entfernt wird, da die wachsenden Plazentafibroblasten sich an der Platte anheften; wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis zur dritten Passage. Die aus den Chorionplatten der menschlichen Plazenta stammenden fibroblastenähnlichen Zellen können bis zur 10. Passage kultiviert werden. Anschließend werden sie mit Trypsin abgelöst und als Vorratsproben für Kulturen menschlicher pluripotenter Stammzellen verwendet, nachdem Kontaminationen wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben ausgeschlossen wurden: eine Million Zellen (1 × 10⁷) in einer T-75-Kulturschale, kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, bis sie 85 bis 90 % konfluent sind.Behandeln Sie die angesiedelten Zellen zweiinhalb Stunden lang mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C und waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit je 10 Milliliter vorgewärmtem PBS. Inkubieren Sie die Zellen danach einen Tag nach der Behandlung 24 Stunden lang in vorgewärmtem Medium ohne Mitomycin C. Ersetzen Sie das Medium auf den Zellen durch 10 Milliliter Dmf.12 Medium, ergänzt mit 20 % eines Serumersatzes, 0,1 Millimolar Beta-Mercaptoethanol, 1 % NEAA und 1 % Penicillin-Streptomycin. Nach 24-stündiger Inkubation das konditionierte Medium in einem 15-Milliliter-Konikalröhrchen sammeln und mittels eines 0,22-Mikron-Spritzenfilters filtrieren. Anschließend weitere 10 Milliliter frisches Medium zu den Zellen geben und diese weiterhin bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Sammeln Sie täglich über eine Woche hinweg alle Überstände der Kulturen und frieren Sie das geerntete Medium bei minus 80 Grad Celsius ein. Gefrieren Sie das Medium jedes Mal in einem neuen Behälter. Um wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden, beschaffen Sie sich eine humane embryonale Stammzelllinie, wie beispielsweise die H1-Linie, und beginnen Sie mit der Kultivierung gemäß den Herstelleranweisungen für die Kultur der experimentellen Gruppen.Dieselben Zellen auf mit 0,1 % Gelatine beschichteten Platten in der aus Plazenta stammenden Zellkultur. Medium wechseln durch routinemäßige Passagierung alle fünf Tage unter Verwendung standardmäßiger, mechanischer Passagierungsmethoden. Passagieren Sie die Kontrollzellen ein bis vier und die experimentelle Gruppe zwischen ein bis sechs und ein bis zehn.Ersetzen Sie das Medium täglich durch frisches Medium, beginnend ab Tag zwei. Menschliche pluripotente Stammzelllinien können auf mit 0,1 % Gelatine beschichteten Platten in menschlichem, plazentabasiertem Zellkulturmedium auf einem Niveau gehalten werden, das dem von Zellen entspricht, die in typischen Stammzellkulturen gepflegt werden.Mittel auf Platten mit beschichteter Basalmembranmatrix, um zu bestätigen, dass das aus menschlicher Plazenta stammende Zellkulturmedium auch mit anderen Matrizes kompatibel war. Die Stammzellen wurden auf Laminin-, Vitronectin- und unbeschichteten Schalen unterkultiviert. Die Zellen hefteten sich an und wuchsen auf den mit Laminin und Vitronectin beschichteten Schalen an.Jedoch nach mehreren Passagen waren viele Kolonien differenziert. Im Gegensatz zu denen auf der mit Gelatine beschichteten Gruppe. Nach dem Transfer auf nicht beschichtete Schalen wurde keine Anheftung für Stammzellen beobachtet.Die hier gezeigten H-one- und IPSE-Zelllinien wurden unter experimentellen Bedingungen über 10 Passagen kultiviert. Nach zwei Wochen bildeten sie Embryoidkörper, die Mesoderm, Ektoderm und Endoderm enthielten, wie durch immunfluoreszenzchemische Färbung nach der Entwicklung gemessen wurde. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der menschlichen Stammzellenbiologie den Weg, klinische Anwendungen zu erforschen.Da diese Methode keine Kontamination mit tierischen Produkten verursacht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Eine einfache Methode, primäre menschliche Plazenta (Villi) und dezidualen Organkulturen zu etablieren beschrieben. Villöse und dezidualen Organkulturen sind wertvolle Werkzeuge Pathogenese an der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle für das Studium. Eine Infektion mit dem Bakterium fakultativ intrazellulären Listeria monocytogenes nachgewiesen wird .

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Ein Protokoll wird präsentiert, um bereiten polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit, die mit und ohne Oligopeptide, aufgepfropft wurden, um zu untersuchen, die Wirkung der Steifigkeit von Biomaterialien auf die Differenzierung und Proliferation von Stammzellen. Die Steifigkeit der Hydrogele wurde dadurch die Vernetzung bestimmt.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Organoide sind zu wertvollen Werkzeugen für die Modellierung von Krankheiten geworden. Die extrazelluläre Matrix (EZM) steuert das Zellschicksal während der Organoidgenerierung, und die Verwendung eines Systems, das dem nativen Gewebe ähnelt, kann die Modellgenauigkeit verbessern. Diese Studie vergleicht die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen humanen Darmorganoiden in tierischer EZM und xenofreien Hydrogelen.

Vergleichende Studie von Basalmembranmatrizen für die Erhaltung humaner Stammzellen und die Generierung von intestinalen Organoiden

Das Protokoll zeigt ein neuartiges experimentelles In-vitro-Modell , das die Biologie von zwei Arten von adhärenten Zelllinien mit einem dreidimensionalen (3D)-gedruckten Gerüst rekapitulieren kann. Der Aufbau dieses Modells und die Arbeitsabläufe, von der Zellpräparation über die Zellkultur bis hin zur Analyse und Auswertung, werden beschrieben.

Co-Kulturmodell mit zwei Arten von adhärenten Zelllinien

Wir haben eine Methode zur Verkapselung von pluripotenten Stammzellen (PS-Zellen) in Alginat-Hydrogel-Kapseln mit einer koaxialen Düse etabliert.  Dies verhindert eine übermäßige Aggregation der Zellen und begrenzt die Scherspannung, der Zellen in Suspensionskulturen ausgesetzt sind.  Die Technik ist sowohl auf die Massenproduktion von PS-Zellen als auch auf die Forschung in der Stammzellnische anwendbar.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Vermehrung menschlicher pluripotenter Stammzellen auf Gelatine mit plazentaderiviertem Konditioniermedium. Diese Technik eliminiert synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

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