Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Myokardinfarkt (MI) folgt nicht nur eine Beeinträchtigung der Herzfunktion, sondern auch eine Apoptose in der Amygdala, einer Gehirnregion, die an den Verhaltensfolgen von MI beteiligt ist. Dieses Protokoll beschreibt, wie MI induziert, Amygdalagewebe entnommen und Caspase-3-Aktivität, ein Marker für Apoptose, darin gemessen wird.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Caspase-3-Aktivität in der Amygdala der Ratte nach einem Myokardinfarkt mittels Spektrofluorometrie zu messen. Diese Methode kann zentrale Fragen der Verhaltensneuronalforschung beantworten, wie z.B. die Folgen eines Myokardinfarkts für die kognitive Leistungsfähigkeit, die psychische Gesundheit, den Alterungsprozess und den Schlaf. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach, schnell und zuverlässig ist.

Im Allgemeinen würden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie die Geschicklichkeit für Operationen und Gewebeproben erfordert. Das Verfahren wird von Kim Gilbert, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in unserem Labor, vorgeführt. Bestätigen Sie nach der Einleitung der Anästhesie gemäß den genehmigten institutionellen Protokollen die ordnungsgemäße Anästhesie durch das Fehlen des Pfotenkneifreflexes.

Intubieren Sie die Ratte mit einem Endotrachealschlauch und bringen Sie das Tier in die ventrale Dekubitusposition auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Schließen Sie den Endotrachealschlauch an ein Anästhesiegerät an, das 2 % Isofluoran abgibt. Bereiten Sie anschließend die Operationsstelle mit Chlorhexidingluconat und Isopropylalkohol vor.

Und tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie ein steriles Tuch über das Tier, um ein steriles Feld um die Operationsstelle zu schaffen. Und platzieren Sie die benötigten sterilen chirurgischen Instrumente auf einem anderen sterilen Feld neben dem Tier.

Als nächstes schneiden Sie die Haut mit einer Skalpellklinge oder einer Schere mit der Nummer 10 ein. Verwenden Sie eine Schere oder eine hämostatische Klemme, um das Muskelgewebe abzuziehen. Verwenden Sie dann eine Schere oder eine hämostatische Klemme, um die Brustwand zu öffnen und den Brustretraktor zu positionieren, und öffnen Sie das Perikard mit der hämostatischen Klemme.

Um einen koronaren Verschluss zu induzieren, schlingen Sie zunächst eine 360 Millimeter lange Vier-Null-Seidennaht um die absteigende Koronararterie und durch das angrenzende Myokardgewebe. Führen Sie beide Enden der Seidennaht in ein 1,25 Zentimeter langes 14-Gauge-Plastikröhrchen ein. Ziehen Sie an beiden Enden der Seidennaht und drücken Sie den Schlauch gegen die Arterie, um ihn zu verschließen.

Sichern Sie die Okklusion, indem Sie den Kunststoffschlauch mit einer hämostatischen Klemme festklemmen und halten Sie die Okklusion 40 Minuten lang. Nach 40 Minuten lösen Sie die Okklusion, indem Sie die hämostatische Klemme und dann den flexiblen Schlauch und die Seidennaht entfernen. Verschließen Sie den Thorax mit zwei Nullnähten und legen Sie einen flexiblen Katheter durch die Brusthöhle und ziehen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze Luft aus dem Thorax ab, um einen Pneumothorax zu verhindern.

Nähen Sie den Muskel mit vier Zero-Seidennähten und die Haut mit drei Zero-Silk-Nähten. Bevor Sie die letzte Hautnaht schließen, ziehen Sie mit der 10-Milliliter-Spritze und dem Katheter erneut Luft aus dem Brustkorb. Schließen Sie die Haut und stoppen Sie dann das Isofluoran.

Setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig und überwachen Sie sie während der Genesung von der Narkose. Verabreichen Sie Analgesie mit wiederholter Dosierung alle acht Stunden. Nachdem Sie das Tier nach anerkannten Verfahren auf humane Weise enthauptet haben, legen Sie den Kopf der Ratte auf eine Schüssel mit zerstoßenem Eis.

Öffne den Schädel mit einer Schere. Verwenden Sie dann Rongeure, um die Knochenscheiben zu lösen, ohne das darunterliegende Gewebe durch Ziehen nach oben zu verstümmeln. Platzieren Sie als Nächstes die flache Klinge eines Spatels zwischen der Unterseite des Schädels und der hinteren ventralen Oberfläche des Gehirns und lösen Sie das Gehirn vom Schädel, indem Sie die Klinge vorsichtig nach vorne schieben und das Gehirn aus dem Schädel heben.

Platzieren Sie das Gehirn auf seiner dorsalen Oberfläche. Identifizieren Sie den Hypothalamus vor dem Kleinhirn und schneiden Sie das Gehirn koronal vor dem hinteren Ende des Hypothalamus und auch hinter dem vorderen Ende. Identifizieren Sie die bilaterale Amygdala als zwei kleine Kugeln unterhalb der Schläfenlappen direkt neben dem Hypothalamus.

Drehen Sie dann das Gehirn flach auf sein vorderes Ende, wobei die Rückenfläche vom Experimentator weg ist. Trennen Sie als Nächstes die Hemisphären und entfernen Sie die Rinde aus der kontinuierlichen Amygdala. Wenn die Amygdala freigelegt wird, schneide die Amygdala mit einem Skalpell ab.

Schneiden Sie entlang der dunklen Naht, die über die Amygdala verläuft, um den basolateralen und den zentralen medialen Teil zu trennen, und legen Sie dann die beiden Teile in separate beschriftete Röhrchen auf Eis. Dieser Schritt muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, um eine Verschlechterung der Enzyme zu verhindern. Nachdem Sie den Präpariervorgang mit der anderen Hemisphäre wiederholt haben, tauchen Sie alle vier Fläschchen eine Minute lang in flüssigen Stickstoff und lagern Sie sie dann im Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius.

Beginnen Sie mit der Zugabe von 150 Mikrolitern Lysepuffer zu jeweils fünf bis 10 Milligramm Probe auf Eis. Beschallen Sie jede Probe fünf Sekunden lang mit maximaler Intensität auf Eis. Dann 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Während der Inkubation wird die Probe alle fünf Minuten fünf Sekunden lang vortext. Führen Sie dann drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, indem Sie die Proben abwechselnd in flüssigen Stickstoff und auf eine thermostatisch gesteuerte Heizplatte legen, die auf 37 Dekrete Celsius eingestellt ist. Nach dem abschließenden Auftauzyklus zentrifugieren Sie die Gewebeproben 10 Minuten lang bei 1300 g bei vier Grad Celsius.

Anschließend den Überstand vorsichtig absaugen und in ein frisches Röhrchen auf Eis geben. Nach der Quantifizierung des Proteins gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll werden 25 Mikrogramm Protein in ein Reaktionsröhrchen gegeben, das 0,8 Mikroliter 10 millimolares Ac-DEVD-AMC und einen Reaktionspuffer für ein Endvolumen von 200 Mikrolitern enthält. Kombinieren Sie für negative Reaktionsproben 25 Mikrogramm Protein mit einem Mikroliter 800 mikromolarem Ac-DEVD-CHO und 0,8 Mikrolitern 10 μmolar Ac-DEVD-AMC.

Inkubieren Sie alle Proben und Kontrollen drei Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius. Nach Ablauf der Inkubationszeit die Reaktion mit 600 Mikrolitern 0,4 molar Glycin und 0,4 molar Natriumhydroxid bei pH 10 in jeder Probe stoppen und kontrollieren. Geben Sie zu jeder Reaktion zwei Milliliter destilliertes Wasser in eine Glasküvette.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie. Lesen Sie Steuerelemente und Samples 10 Sekunden lang, wobei jeder Sekunde ein Messwert durchgeführt wird. Quantifizieren Sie schließlich die spezifische Aktivität in jeder Probe gemäß der Formel, die jetzt auf dem Bildschirm angezeigt wird.

Dieses Histogramm zeigt die Caspase-3-Aktivität in der Amygdala von Ratten, die einen Myokardinfarkt erlitten haben. Die Daten werden als Prozentsatz der mittleren Aktivität in Scheinkontrollen ausgedrückt, der auf 100 % festgelegt ist. Jede Gruppe bestand aus acht Ratten. Das Sternchen zeigt eine signifikante Differenz zwischen den Gruppen mit einem p-Wert von weniger als 0,05 an.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Stunden durchgeführt werden, ohne das Intervall zwischen der Operation des Myokardinfarkts und der Gewebeentnahme. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Myokardinfarkt bei einer Ratte induziert und die Caspase-3-Aktivität in der Rattenamygdala mit Hilfe der Spektrofluorometrie misst.