Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität von Caspase-3 im Amygdala des Rattens nach einem Myokardinfarkt mittels Spektrofluorometrie zu messen. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Verhaltensneurowissenschaft klären, beispielsweise die Auswirkungen eines Myokardinfarkts auf die kognitive Leistung, die psychische Gesundheit, den Alterungsprozess und den Schlaf. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach, schnell und zuverlässig ist.

Im Allgemeinen würden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, da sie Geschicklichkeit bei chirurgischen Eingriffen und Gewebeprobenentnahmen erfordert. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert Kim Gilbert, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserem Labor. Nach Einleitung der Anästhesie gemäß den genehmigten institutionellen Protokollen ist die ordnungsgemäße Anästhetisierung durch das Fehlen des Zehenquetschreflexes zu bestätigen.

Intubieren Sie die Ratte mit einer endotrachealen Kanüle und positionieren Sie das Tier in Bauchlage auf einer Heizplatte, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Verbinden Sie die endotracheale Kanüle mit einer Narkosemaschine, die 2 % Isofluran abgibt. Bereiten Sie als Nächstes die Operationsstelle mit Chlorhexidin-Gluconat und Isopropylalkohol vor.

Und Augensalbe auf beide Augen auftragen, um Austrocknung zu verhindern. Ein steriles Tuch über das Tier legen, um einen sterilen Bereich um die Operationsstelle zu schaffen. Und die benötigten sterilen chirurgischen Instrumente auf einem weiteren sterilen Feld neben dem Tier platzieren.

Als Nächstes wird die Haut mit einer Skalpellklinge Nr. 10 oder einer Schere eingeschnitten. Mit der Schere oder einer Hämostaseklemme wird das Muskelgewebe abgelöst. Anschließend wird mit der Schere oder der Hämostaseklemme die Brustwand geöffnet, der Brusthaken positioniert und das Perikard mit der Hämostaseklemme geöffnet.

Um eine Koronarokklusion hervorzurufen, führen Sie zunächst einen 360 Millimeter langen Seidennadelgarn der Stärke 4-0 um den absteigenden Koronararterienast und durch das angrenzende Myokardgewebe. Führen Sie beide Enden des Seidennadelgarns in ein 14-Gauge-Plastikröhrchen mit einer Länge von 1,25 Zentimetern ein. Ziehen Sie beide Enden des Seidennadelgarns und schieben Sie das Röhrchen gegen die Arterie, um diese zu verschließen.

Sichern Sie die Okklusion, indem Sie den Kunststoffschlauch mit einer hämostatischen Klemme abklemmen, und halten Sie die Okklusion 40 Minuten lang aufrecht. Öffnen Sie nach 40 Minuten die Okklusion, indem Sie die hämostatische Klemme entfernen und anschließend den flexiblen Schlauch sowie die Seidennaht lösen. Schließen Sie den Thorax mit einer 0-Naht und führen Sie einen flexiblen Katheter durch den Brustkorb, um mit einer 10-Milliliter-Spritze Luft aus dem Thorax zu aspirieren und einen Pneumothorax zu verhindern.

Nähen Sie den Muskel mit einer 0er Seidennahtr und die Haut mit einer 3-0er Seidennahtr. Vor dem Schließen der letzten Hautnaht wird erneut mit der 10-Milliliter-Spritze und dem Katheter Luft aus dem Thorax abgesaugt. Schließen Sie die Hautnaht vollständig und beenden Sie anschließend die Isofluran-Zufuhr.

Stellen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig und überwachen Sie die Erholung von der Anästhesie. Verabreichen Sie Analgetika mit wiederholten Dosen alle acht Stunden. Nachdem das Tier gemäß genehmigter Verfahren human getötet und enthauptet wurde, legen Sie den Kopf der Ratte auf eine Schale, die auf zerstoßenem Eis steht.

Verwenden Sie eine Schere, um den Schädel zu öffnen. Benutzen Sie anschließend eine Knochenquetsche, um die Knochenplatten zu lösen, wobei das darunterliegende Gewebe nicht durch nach oben gerichtete Bewegungen verletzt werden darf. Danach platzieren Sie die flache Klinge eines Spatels zwischen dem Schädelboden und der hinteren ventralen Oberfläche des Gehirns und lösen das Gehirn vorsichtig vom Schädel, indem Sie die Klinge sanft nach vorne schieben und das Gehirn aus dem Schädel heben.

Platzieren Sie das Gehirn auf seiner dorsalen Fläche. Identifizieren Sie den Hypothalamus vor dem Kleinhirn und schneiden Sie das Gehirn koronal vor dem hinteren Ende des Hypothalamus sowie hinter dem vorderen Ende. Identifizieren Sie den beidseitigen Mandelkern als zwei kleine Kugeln unterhalb der Schläfenlappen direkt neben dem Hypothalamus.

Danach das Gehirn mit dem Stirnende flach auflegen, wobei die dorsale Seite vom Experimentator wegzeigt. Anschließend die Hemisphären trennen und den Kortex vom kontinuierlichen Amygdala-Komplex entfernen. Wenn die Amygdala freigelegt ist, die Amygdala mit einem Skalpell herausschneiden.

Schneiden Sie entlang der dunklen Naht, die durch den Mandelkern verläuft, um die basolaterale und die mediale zentrale Anteile zu trennen, und legen Sie die beiden Teile anschließend in getrennte, beschriftete Röhrchen auf Eis. Dieser Schritt muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, um einen Abbau der Enzyme zu verhindern. Nachdem der Präparationsschritt mit der anderen Hemisphäre wiederholt wurde, tauchen Sie alle vier Röhrchen für eine Minute in flüssigen Stickstoff ein und lagern Sie sie danach im minus 80 Grad Celsius-Gefrierschrank.

Beginnen Sie damit, 150 Mikroliter Lysepuffer je fünf bis 10 Milligramm Probe auf Eis hinzuzufügen. Sonizieren Sie jede Probe auf Eis für fünf Sekunden bei maximaler Intensität. Anschließend 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Während der Inkubation das Probenmaterial alle fünf Minuten fünf Sekunden lang vortexen. Führen Sie dann drei Gefrier-Tau-Zyklen durch, indem Sie die Proben abwechselnd in flüssigen Stickstoff und auf eine thermostatisch geregelte Heizplatte bei 37 Grad Celsius geben. Nach dem letzten Gefrier-Tau-Zyklus die Gewebeproben bei 1300 Gs und vier Grad Celsius zehn Minuten lang zentrifugieren.

Als Nächstes den Überstand vorsichtig abpipettieren und in ein frisches, auf Eis stehendes Gefäß überführen. Nach der Proteinbestimmung gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll 25 Mikrogramm Protein in ein Reaktionsgefäß geben, das 0,8 Mikroliter 10-Millimolar-Ac-DEVD-AMC und Reaktionspuffer enthält, sodass sich ein Endvolumen von 200 Mikrolitern ergibt. Für negative Reaktionsproben 25 Mikrogramm Protein mit einem Mikroliter 800-Mikromolar-Ac-DEVD-CHO und 0,8 Mikrolitern 10-Millimolar-Ac-DEVD-AMC kombinieren.

Alle Proben und Kontrollen drei Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit die Reaktion in jeder Probe und Kontrolle mit 600 Mikrolitern 0,4 molarer Glycin- und 0,4 molarer Natriumhydroxidlösung bei pH 10 stoppen. Zu jeder Reaktion in einer Glas-Küvette zwei Milliliter destilliertes Wasser hinzufügen.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie. Lesen Sie die Kontrollen und Proben 10 Sekunden lang mit einer Messung pro Sekunde ab. Quantifizieren Sie schließlich die spezifische Aktivität in jeder Probe gemäß der Formel, die nun auf dem Bildschirm angezeigt wird.

Dieses Histogramm zeigt die Caspase-3-Aktivität im Amygdala von Ratten nach Myokardinfarkt. Die Daten werden als Prozentsatz der mittleren Aktivität in Sham-kontrollierten Tieren, die auf 100 % gesetzt wurde, dargestellt. Jede Gruppe bestand aus acht Ratten. Der Stern kennzeichnet einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit einem p-Wert von weniger als 0,05.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von sieben Stunden durchgeführt werden, wobei die Zeitspanne zwischen der Myokardinfarkt-Chirurgie und der Gewebeprobeentnahme nicht eingeschlossen ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man einen Myokardinfarkt bei einer Ratte auslöst und die Caspase-3-Aktivität im Mandelkern der Ratte mittels Spektrofluorometrie misst.