Name: Reinigung von Maus-Hirngefäße (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Reinigung von Maus-Hirngefäßen unter Erhalt ihrer strukturellen Integrität mittels langsamer Zentrifugation und Filtration. Dieses Protokoll ermöglicht zelluläre und molekulare Untersuchungen der Blut-Hirn-Schranke.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Labex MemoLife und durch die ARSEP unterstützt (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en Plaques)

1. Lösungen und Materialien <ol><li> Bereiten Isolationsgefäß Lösungen: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 ml HBSS; B2, fügen 3,6 g Dextran zu 20 ml B1; B3, wird 1 g BSA in 100 ml B1. </li><li> Ändern Sie den Filterhalter durch das Schneiden des Boden off der oberen Verschraubung Teil. </li><li> Bereiten Immunfärbung Lösungen: Fixierungslösung, 4% Paraformaldehyd in PBS pH 7,4; Permeabilisierung / Blockierlösung, verdünnter Ziegenserum zu 5% und Triton X100 auf 0,25% in PBS pH-Wert 7,4. Anmerkung: Die Fixierung ist abhängig von der Art der primären Antikörper verwendet. </li></ol> 2. Dissection Anmerkung: Sterile Bedingungen nicht erforderlich ist, es sei denn, Schiffe für Zellkulturzwecke verwendet. <ol><li> Bereiten ein 150 ml Becherglas mit 20 ml B1. Halten Sie auf dem Eis geben und mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden. </li><li> Die Maus tief betäuben unter einer Haube mit einer kleinen Papiertuch in 1 ml reinem Isofluran, die int hinzugefügt wird eingeweichto den Käfig. Anästhesie wird durch eine fehlende Reaktion auf eine Zehe pinch verifiziert. Tötet die Maus durch Genickbruch. Hinweis: Diese Schritte werden in Übereinstimmung mit nationalen und institutionellen Regelungen durchgeführt. </li><li> Optional: intrakardiale Perfusion mit 20 ml PBS 1x, die Blut-Gehalt 24 zu eliminieren. </li><li> § die Haut mit einem Skalpell aus dem Hals auf die Nase und ziehen Sie sie. Entfernen Sie alle verunreinigenden Haare mit PBS 1x. </li><li> Um den Schädel zu öffnen, erste Schereneinsatz nach vorn, um den Riechkolben, und öffnen Sie die Schere, um den Schädel in zwei Teile brechen. </li><li> Das Gehirn mit einem Hirn Spachtel vorsichtig entfernen. Präparieren Sie die Plexus choroideus der Seitenventrikel, wie sie das Blutgefäß Vorbereitung 38 kontaminieren würde. HINWEIS: Optional: Die letzten Vorbereitungen werden parenchymalen und Hirnhäute Gefäße enthalten. Wenn nicht gewünscht wird, kann im Anschluss an die Meningen off von 38 beschriebene Verfahren abgezogen werden. </li><li> Transfer das Gehirn in das Becherglas mit B1-Lösung auf Eis. Bis zu 8 Köpfe zusammen behandelt werden. </li></ol> 3. Gehirngewebe Homogenisierung <ol><li> Mit Hilfe von zwei Skalpelle, manuell und kräftig zu schlagen, das Gehirn in der B1-Lösung anschließend Erhalt kleine Stücke von etwa 2 mm. </li><li> Homogenisieren, die Vorbereitung mit einem automatisierten Dounce Homogenisator, die Durchführung 20 Hübe bei 400 Umdrehungen pro Minute. Sicherzustellen, dass die Glasröhre wird in Eis und dass der obere Teil des douncer in Lösung ist, wenn und ab bewegt, um so die Bildung von Lufttaschen zu verhindern, gehalten. Wenn mehrere Proben hergestellt, waschen Sie die douncer mit ionisiertem Wasser zwischen jeder Homogenisierung. </li></ol> 4. Vessel Reinigung <ol><li> Übertragen des Homogenisats in einen 50-ml-Kunststoffrohr und gehen in die Zentrifugation bei 2.000 g für 10 min bei 4 ° C. Eine große weiße Schnittstelle (meist Myelin), werden am oberen Ende des Behälters Pellet (Rot bilden, wenn keine Perfusion erfolgte). </li><li> Überstand verwerfen. Das Gefäß und das Pellet weiß Schnittstelle miteinander verbunden bleiben. In 20 ml eiskaltem B2-Lösung und manuell und kräftig schütteln Sie das Röhrchen 1 min. </li><li> Verfahren zur zweiten Zentrifugation bei 4.400 g für 15 min bei 4 ° C. Das Myelin wird nun eine dichte weiße Schicht auf der Oberfläche des Überstandes. </li><li> Vorsichtig abziehen der Myelinschicht von den Rohrwänden durch Halten des Rohres und langsam drehen, damit der Überstand, um an den Wänden bestehen. Verwerfen Myelin mit dem Überstand. Das Pellet, das die Gefäße bleibt an der Unterseite des Rohres angebracht ist. </li><li> Tupfen Sie die Innenwand des Rohres mit einem saugfähigen Papier um eine 5 ml Plastikpipette eingewickelt und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten und berühren nicht die Gefäß Pellet. Halten Sie das Röhrchen kopfüber auf ein saugfähiges Papier um Restflüssigkeiten zu entleeren. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem B3-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mit Low-Bindung Tipps, keeping die Röhrchen auf Eis, fügen Sie dann weitere 5 ml B3-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Schiffe sind so weit wie möglich verteilt und keine Aggregate bilden. </li></ol> 5. Filtration <ol><li> Bereiten Sie ein Becherglas auf Eis mit 30 ml eiskaltem B3-Lösung. Deckel mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine 20 &amp; mgr; m-Sieb-Filter auf einer modifizierten Filterhalter auf der Spitze eines becker Kolben und ins Gleichgewicht, indem 10 ml eiskaltem B3-Lösung. </li><li> Gießen Sie das Gefäß Vorbereitung auf dem Filter und spülen Sie die Gefäße mit 40 ml eiskaltem B3-Lösung. </li><li> Recover den Filter mit sauberer Pinzette und sofort eintauchen in das Becherglas mit dem B3-Lösung. Trennen Sie die Geräte vom Filter von ihr leichtes Schütteln. </li><li> Gießen des Bechers Gehalt in einem 50 ml Kunststoffröhrchen und Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Hinweis: Alternativ können die Hirngefäße &quot;Suspension aus Schritt 4.6 auf eine 100 &amp; mgr; m-Sieb-Filter gefiltert werden.In diesem Fall werden größere Gefäße vorzugsweise auf dem Filter zurückgehalten, während die Durchfluss enthält Mikrogefßen (hauptsächlich Kapillaren), die dann auf einem 20 &amp; mgr; m-Mesh-Filter, wie oben filtriert werden. </li><li> Das Pellet von Mikrogefäßen in 1 ml eiskaltem B3-Lösung und überträgt es durch Pipettieren es in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C. </li></ol> 6. Fixierung, Permeabilisierung und Blocking <ol><li> Transfer Gefäße durch Pipettieren in 0,2 ml PCR-Röhrchen mit PBS unter Verwendung einer 1,0 ml geringe Bindungsspitze. Darauf achten, nicht zu berühren die Gefäße, da sie nach außen Teil der Spitze halten. Führen Sie alle folgenden Schritte unter einem Binokular. </li><li> Für jede der folgenden Mediums ändert, lassen Sie die Röhrchen auf Eis, bis die Schiffe haben den Boden erreicht, und Pipetten die meisten der Flüssigkeiten mit langen und etwas Gel-Loading-Pipettenspitzen. </li><li> Entfernen Sie die meisten der PBS und fügen Sie 200 ul der Fixierlösung.Suspend die Gefäße durch leichtes Schütteln und Inkubation für 20 min bei RT. </li><li> Pipettieren Sie die Fixierungslösung und ersetzen Sie es mit 200 ul 1x PBS (erste Wäsche), Inkubation für 5 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. Jedes Mal, wenn Sie sicher, dass Schiffe, korrekt auf den Boden der Röhrchen und Pipette aus 1x PBS versenkt, wodurch die Behälter nicht berührt. </li><li> Nach dem letzten Wasch ersetzen 1x PBS durch die Permeabilisierung / Blockierlösung und Inkubation 1 h bei RT, Resuspendieren der Schiffe, die von sanft von Zeit zu Zeit schütteln. </li></ol> 7. Immunfärbung <ol><li> Ersetzen Sie die Permeabilisierung / Blocking-Lösung mit der Mischung aus primären Antikörpern (siehe Referenzen der in der Materialvorlage Tabelle verwendet und Verdünnungen Antikörper) in der Permeabilisierung / Blockierlösung verdünnt, und Inkubation bei 4 ° CO / N. </li><li> Nach 3 Waschschritten in PBS bei RT inkubieren die Gefäße mit der Mischung aus Sekundärantikörper in PBS für 2 Stunden verdünntbei RT. </li><li> Hinweis: Wir empfehlen dringend, Kernfärbung mit Hoechst (1: 2.000) oder DAPI (1: 2000), um die Schiffe vor möglichen verunreinigenden Haare oder Staub unter dem Mikroskop zu unterscheiden. </li><li> Nach 3 Waschungen in PBS, Resuspendieren der Gefäße in 50 ul PBS. </li></ol> 8. Montage und Beobachtung <ol><li> Bereiten Sie eine Spitze mit einem silikonisierten Glaskapillare: schneiden Sie ein P200 Pipettenspitze mit einem Skalpell und stellen Sie die Kapillare im Inneren. Das ungefähre Volumen der Kapillare 40 ul. </li><li> Übertragen Sie die Schiffe auf einem Glasobjektträger mit dem silikonisierten Glaskapillare und entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Stück saugfähigem Papier. </li><li> Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf die Schiffe, und halten Sie ein Deckglas bei 45 ° so dass der Tropfen, um entlang der Kante der Schlupf zu verbreiten. Lassen Sie aus dem Deckglas und lassen mittel- bis langsam ausbreiten. Lassen Sie es trocken O / N bei RT unter Lichtschutz. Schiffe unter einer fluoreszier beobachtenent konfokalen Mikroskop. </li></ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier+in+Health+and+Chronic+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.</a> Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., Reynell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+an+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
<li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Metabolism%3A+Focus+on+Astrocyte-Neuron+Metabolic+Cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).</li>
<li>Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+regulation+of+the+cerebral+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial regulation of the cerebral microvasculature.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).</li>
<li>Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+a+purified%2C+metabolically+active+preparation+from+bovine+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex.</a> Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+metabolically+active+capillaries+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier.</a> Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).</li>
<li>Boado, R. J., Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-type+glucose+transporter+mRNA+is+specifically+expressed+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).</li>
<li>Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+the+blood-brain+barrier%3A+Distribution+of+enzymes+between+the+luminal+and+antiluminal+membranes+of+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells.</a> Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Blood-Brain+Barrier+Transcriptome%3A+A+New+Resource+for+Understanding+the+Development+and+Function+of+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Sequencing+Transcriptome+and+Splicing+Database+of+Glia%2C+Neurons%2C+and+Vascular+Cells+of+the+Cerebral+Cortex.%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarcoglycan+complex+is+expressed+in+the+cerebrovascular+system+and+is+specifically+regulated+by+astroglial+Cx30+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).</li>
<li>Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+quiescence+of+the+brain+is+set+by+astroglial+Connexin+43%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).</li>
<li>Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+vessels+from+the+mouse+brain+for+gene+expression+analysis+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+CNS+microvascular+endothelium+by+immune-guided+laser-capture+microdissection+coupled+to+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).</li>
<li>Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ex+Vivo+Laser-induced+Spinal+Cord+Injury+Model+to+Assess+Mechanisms+of+Axonal+Degeneration+in+Real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).</li>
<li>Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pericytes in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).</li>
<li>Ezan, P., André, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+astroglial+connexins+weakens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).</li>
<li>Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+at+the+gliovascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling at the gliovascular interface.</a> The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).</li>
<li>Dubois, L. G., Campanati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+and+the+vascular+fragility+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).</li>
<li>Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+metabolically+active+capillaries+from+rat+brain1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2.</a> Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).</li>
<li>Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+microvessels%3A+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).</li>
<li>Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+preparation%2C+morphology%2C+histamine+and+catecholamine+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Vessels%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents.</a> Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).</li>
<li>Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+transport+of+vitamin+D+and+A+derivatives+through+the+rat+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier.</a> Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).</li>
<li>Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+and+canine+endothelial+cells+from+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels.</a> Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).</li>
<li>Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+endothelial+cells+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of endothelial cells from rat brain.</a> Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).</li>
<li>Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+capillary+endothelium+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Primary culture of capillary endothelium from rat brain.</a> In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).</li>
<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
<li>Geier, E. G., Chen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Solute+Carrier+Transporters+in+the+Human+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).</li>
<li>Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+Resistance-Related+Transport+Proteins+in+Isolated+Human+Brain+Microvessels+and+in+Cells+Cultured+from+These+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates.</a> Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).</li>
<li>Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Sci Rep. 3, 1500(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Blut-Hirn-Schranke regelt den Durchgang von physiologischen Substanzen in und aus dem ZNS und schützt sie vor im Blut vorhandenen möglicherweise schädlichen Substanzen. Es wird in verschiedenen ZNS-Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen 2 und Hirntumoren 28. Der extrem niedrige Durchlässigkeit des BBB behindert auch den Durchgang von Therapeutika gezielt Nervenzellen und die Entwicklung von Methoden der Absicht, reversibel öffnen Sie die BBB ohne nachteilige Folgen für ...

Die einwandfreie Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) erfordert einen stark regulierten extrazellulären Umgebung, und seine metabolischen Anforderungen sind riesig im Vergleich zu anderen Organen 1. Das ZNS ist auch extrem empfindlich gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien, in der Regel unschädlich für periphere Organe, sondern sie neurotoxische. Um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten, bildet der größte Teil der CNS &#39;Gefäßsystem eine Endothelbarriere; die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Fluss der Moleküle und Ionen sowie die Passage von Immunzellen, die zwischen dem Blut und dem Gehirn steuert, wodurch die richtige Homöostase 2 beibehalten, sondern auch die Eingabe von therapeutischen Arzneimitteln einschränkende Weise behindern Behandlungen neurologische Störungen 3. Auf zellulärer Ebene ist die BBB hauptsächlich durch umfangreiche tight junctions zwischen Endothelzellen, polarisierte Expression von Efflux-Transporter und einem sehr niedrigen Transzytose Rate 4 aufrechterhalten. Eigenschaften und Funktionen der BBB sind meist von ne induzierteighboring Zellen 4. Insbesondere spielen Perizyten eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des BBB 5,6. Als kontraktilen Zellen Perizyten, regulieren auch die Durchblutung 7 als die glatten Muskelzellen umgebenden großen Gefäßen zu tun. Schließlich Astrozyten, die großen gliale Zellen des Gehirns, zu senden große Prozesse Endfüßen herum gestattet meisten Gehirngefäß 8 und modulieren BBB Integrität und Immun quiescence 9, den Transfer von Stoffwechselprodukten der Neuronen 10 und induzieren die enge Kopplung von neuronaler Aktivität und Blutung 11,12. Die Fähigkeit, die molekularen und zellulären Eigenschaften des zerebrovaskulären Systems zu studieren, ist entscheidend, um eine bessere Charakterisierung ihres Beitrags zur Gehirnphysiologie und Arzneimitteltherapie. Um diese Frage anzugehen, Strategien, um das Gehirn die zerebrovaskuläre System zu isolieren sind entwickelt worden, die für die Herstellung von intakten Gehirn Schiffes Fragmente zu ermöglichen. Hirngefäßes purification wurde anfänglich unter Verwendung von Rinder Gehirne 13 beschrieben und verbessert und an andere Spezies, insbesondere Nagetieren 14. In dieser letzten Untersuchung wurde die Verwendung von Filtern unterschiedlicher Größe eingebracht, um den Hirngefäßen in den Fraktionen in Gefäße unterschiedlicher Durchmesser angereichert trennen. Interessant ist, dass in solchen Zubereitungen, hielt Endothelzellen ihren metabolischen Eigenschaften 15, Transporter Funktionen 16 und 17 Polarisations. Hier beschreiben wir im Detail dieses Protokoll und weiter zu zeigen, dass isolierte Gefäße behalten die meisten ihrer in situ-Strukturen. Endothelzellen bleiben tight junctions verbunden und durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben. Perizyten und Zellen der glatten Muskulatur bleiben der Endothelschicht sowie perivaskuläre Astrozyten Membranen angebracht. Jedoch Astrozyten Mikroglia-Zellen, Neuronen und Oligodendrozyten eliminiert. Schließlich beschreiben wir ein Verfahren durchzuführen Immunfärbung auf isolierte Hirngefäße. </p&gt; Bis jetzt die meisten der molekularen und zellulären Untersuchungen zur zerebrovaskulären Systems haben auf gereinigt Hirngefäßzellen durch distanzierte geführt Zellsortierung unter Verwendung von zellspezifischen Reportermausstämmen oder Immunfärbung basierte Verfahren 18,19. Obwohl diese Techniken können zur Isolierung von fast reinem zerebrovaskulären Zellpopulationen, isolierte Zellen vollständig verlieren ihre in situ Morphologie und Wechselwirkungen, die wiederum stark ihre molekularen und zellulären Eigenschaften betrifft. Das hier beschriebene Protokoll, so dass für die Isolierung von Gesamt zerebrovaskulären Fragmente ohne Notwendigkeit von spezifischen Antikörpern oder transgene Maus Flecken, bietet eine gute Alternative, da die Gesamtstruktur der isolierten Hirngefäße konserviert somit Verminderung Auswirkungen auf ihre molekularen Eigenschaften. Isolated Schiffe könnten dann für die Untersuchung der Genaktivität, Proteinsynthese und Regulierung an der BBB verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 20,21 </sup&gt;. Schließlich, im Vergleich zu Laser Mikrodissektion 22,23 Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach durchzuführen und in jedem Labor schnell anpassungsfähig.

<table><tbody><tr><td>Tissue-Grinder Größe C</td><td>Thomas scientific</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5415&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>Leistungsstarkes, modulares Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Compact System bietet hochwertige Leica LED1000</td><td>Leica</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>Low-Binding-Spitzen (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm Filterhalter PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Netzfilterscheibe aus Nylon Hydrophil 20 & micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Netzfilterscheibe aus Nylon Hydrophil 100 & Mikro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>Standardwandige Borosilikatrohre</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, Dicke 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Dünnwandige Tuben und gewölbte Kappe</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PARAFILM M (Rollengröße 4 Zoll & mal 125 ft)</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>Life-Technologie</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life-Technologie</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Dextran von Leuconostoc spp. Herr ~70.000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium Fluormount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Isolektin GS-IB4 Aus Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Konjugat; Verdünnung 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (Kaninchen) ; Verdünnung 1/400</td><td>freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (Maus, Klon 1A12)</td><td>Life technology</td><td>33-9100</td><td>Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin (Maus, Klon 1A4)</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (Maus, Klon GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (Kaninchen)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (Maus, Klon&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti Olig2 (Kaninchen)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (Maus)</td><td>zur Verfügung gestellt von Dr. Beat M. Riederer, Universität Lausanne, Schweiz.</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:10</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1 (Kaninchen)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologie</td><td>A11029</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Life-Technologie</td><td>A11034</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologie</td><td>A21424</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 Konjugat</td><td>Life-Technologie</td><td>A21429</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:2.000</td></tr></tbody></table>

reinigung von maus-hirngefäße

Purification of Mouse Brain Vessels

Im Gehirn, die meisten der Gefäßsystem besteht aus einem selektiven Schranke, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Austausch von Molekülen und Immunzellen zwischen dem Gehirn und dem Blut reguliert. Darüber hinaus erfordert die große neuronale metabolischen Bedarf einen Moment zu Moment Regulation des Blutflusses. Bemerkenswert ist, Anomalien dieser Regelungen sind ätiologische Markenzeichen der meisten Hirnerkrankungen; einschließlich Glioblastom, Schlaganfall, Ödeme, Epilepsie, degenerative Erkrankungen (Beispiel: Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit), Hirntumoren sowie entzündlichen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Meningitis und Sepsis-induzierten Hirnfunktionsstörungen. So, das Verständnis der Signalwege Modulation der zerebrovaskulären Physiologie ist eine große Herausforderung. Viel Einblick in die zellulären und molekularen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen, die den zerebrovaskulären System besteht aus einer Primärkultur oder Zellsortierung von frisch gewonnenen Hirngewebe gewonnen werden. Jedoch,Eigenschaften wie die Zellpolarität, Morphologie und inter Beziehungen nicht in solchen Zubereitungen gehalten. Das Protokoll, das wir beschreiben soll Hirngefäß-Fragmente zu reinigen, während die strukturelle Integrität. Wir zeigen, dass isolierte Gefäße bestehen aus Endothelzellen durch Tight Junctions, die durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben sind versiegelt. Perizyten bleiben glatten Muskelzellen sowie die perivaskuläre Astrozyten Endfüßen Membranen Endothelschicht befestigt. Schließlich beschreiben wir, wie Immunfärbung Experimente an gereinigt Hirngefäße durchzuführen.

Hier haben wir ein Protokoll, so dass für die mechanische Isolierung des Hirngefäße 14 zu beschreiben. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte dieser Technik. Die Architektur der Hirngefäße ist komplex und umfasst mehrere Zelltypen, dh, Endothelzellen von tight junctions verschlossen und von Perizyten, glatte Muskelzellen und Astrozyten Fußfortsätzen 9 umgeben. So nach der Isolierung der Gehirngefäße, war es unser Ziel, die Struktur des gereinigten Gefäße durch Immunfär...

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Reinigung des Gefäßkompartiments des Mäusegehirns ermöglicht. Zu den isolierten Hirngefäßen gehören Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden und von einer durchgehenden Basallamina umgeben sind, Perizyten, vaskuläre glatte Muskelzellen sowie perivaskuläre Astrogliamembranen.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens besteht darin, den vaskulären Kompartiment des Maushirns zu reinigen, wobei dessen strukturelle Integrität erhalten bleibt, indem eine Abfolge von Zentrifugationen mit niedriger Geschwindigkeit und Filtrationen durchgeführt wird, ohne dass spezifische Antikörper oder transgene Stämme erforderlich sind. Es wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um Techniken zu entwickeln, die zelluläre, molekulare und pharmakologische Untersuchungen der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen. Die Abwesenheit von Trennungen, Gradienten, Kolonnen oder Zentrifugationsschritten mit hoher Geschwindigkeit macht die Reinigung von Hirngefäßen mittels dieses Verfahrens sehr einfach, schnell und kostengünstig.Die Gefäße des Gehirns bleiben strukturell intakt, wobei die Endothelzellen durch Tight Junctions verschlossen sind und von basalen laminalen Parasiten, vaskulären glatten Muskelzellen und perivaskulären Astrozytenmembranen umgeben sind. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen zur Funktion des zerebralen vaskulären Kompartiments zu beantworten und ermöglicht die Untersuchung seiner molekularen Zusammensetzung. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch einen Postdoktoranden aus dem Team von Martin Coen S. Vor Beginn des Verfahrens sollte der Boden des oberen Schraubteils des Filterhalters abgeschnitten werden.Verwenden Sie dann ein Skalpell, um die Haut des Mäuses vom Hals bis zur Nase einzuschneiden, und ziehen Sie die Haut zurück. Waschen Sie den Schädel mit PBS, um eventuelle kontaminierende Haare zu entfernen, und führen Sie dann eine Schere anterior zu den Riechkolben in den Schädel ein. Öffnen Sie die Schere, um den Schädel zu zerbrechen, und entfernen Sie das Gehirn mit dem Spatel.Als Nächstes wird das Plexus-choroideus aus den Seitenventrikeln präpariert und das Gehirn in einen 150-Milliliter-Becher mit 20 Milliliter B1-Lösung auf Eis überführt. Anschließend wird das Gehirn mit zwei Skalpellen kräftig in zwei Millimeter große Gewebefragmente zerkleinert und das Gewebe mithilfe eines automatischen Down-Homogenisators 20-mal bei 400 U/min auf Eis homogenisiert. Zur Reinigung der Gefäße wird das Homogenat in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführt und die Gewebesuspension abzentrifugiert.In einer Schwingrotor-Zentrifuge bildet sich an der Oberseite des Vessel-Pellets eine große weiße Phase, die hauptsächlich aus Myelin besteht. Entsorgen Sie den Überstand bei 20 Milliliter eiskalter B-zwei-Lösung und schütteln Sie das Gefäß kräftig für eine Minute. Nach einer zweiten Zentrifugation bildet das Myelin eine dichte weiße Schicht an der Oberfläche des Überstands.Drehen Sie das Röhrchen langsam, um sicherzustellen, dass die B zwei-Lösung beim Ausgießen entlang der Wand läuft, und entsorgen Sie das Myelin mit dem Überstand. Verwenden Sie anschließend eine mit absorbierendem Papier umwickelte Plastikpipette, um restliche Flüssigkeit von den Wänden des Röhrchens zu entfernen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu berühren, und stellen Sie das Röhrchen auf dem Kopf stehend auf Eis.Als Nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalter B3-Lösung, gefolgt von der Zugabe von weiteren fünf Millilitern B3-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass die Gefäße keine Aggregate bilden. Stellen Sie nun ein 20-Mikrometer-Nylon-Mesh-Filter auf einen Erlenmeyerkolben und equilibrieren Sie das Filter mit 10 Millilitern eiskalter B3-Lösung. Gießen Sie die Gefäßpräparation auf das Filter und spülen Sie die Gefäße vorsichtig mit weiteren 40 Millilitern eiskalter B3-Lösung nach.Verwenden Sie dann saubere Pinzette, um den Filter umgehend in einen Becher mit 30 Milliliter frischer B-drei-Lösung zu überführen, und lösen Sie die Zellen vorsichtig unter Schütteln vom Filter ab. Gießen Sie den Inhalt des Bechers in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Nach einer Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalter B-drei-Lösung, bevor die Immunfärbung durchgeführt wird.Überführen Sie die Gefäße in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen und stellen Sie die Röhrchen auf Eis, bis sich das Gewebesediment am Boden der Röhrchen abgesetzt hat. Anschließend saugen Sie mithilfe von Gel-Ladepipettenspitzen den größten Teil der Flüssigkeit ab. Danach führen Sie eine silikonisierte 40-Mikrometer-Glaskapillare in eine P-200-Pipettenspitze ein und übertragen damit die Gefäße auf einen Objektträger. Wenn sich die Gefäße abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Stück Saugpapier.Danach einen einzelnen Tropfen Einbettmedium auf die Gefäße geben und einen Deckglaser an einem Winkel von 45 Grad anbringen, wobei das Einbettmedium entlang der Kante des Glases laufen kann, bis der Deckglaser vollständig sitzt. Auf diesem Bild ist eine kontinuierliche RIN-Färbung um die neuralen endothelialen Zellen herum zu erkennen, was die Erhaltung der Basallamina an den gereinigten Gefäßen bestätigt. Bestandteile der endothelialen Tight Junctions, wie ZO-1, sind ebenfalls auf den gereinigten Gefäßen nachweisbar.Außerdem deuten die Markierungen für NG zwei und glatte Muskel-Aktin auf die Erhaltung intakter Parasiten bzw. glatter Gefäßmuskelzellen hin. Perivaskuläre Astroglia-Membranproteine, Connexin 43 und Aquaporin 4, sind ebenfalls an der Oberfläche der gereinigten Gefäße nachweisbar, was die zusätzliche Erhaltung perivaskulärer Astrozytenmembranen während des Reinigungsprozesses zeigt. Es werden jedoch nur verstreute und kurze, GFAP-positive Fasern an den isolierten Gefäßen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Astrozyten-Zellkörper nicht mitgereinigt wurden. Nur wenige neuronale Fasern verbleiben an den Gefäßen angeheftet.Ebenso werden keine IBA-eins- und Oli-zwei-positiven Zellen nachgewiesen, was bestätigt, dass Mikroglia und Oligodendrozyten nicht gemeinsam gereinigt werden. Wir empfehlen nachdrücklich, das aktuelle Plexus vor der Homogenisierung des Gehirns zu entfernen, da wir dies als mögliche Kontaminationsquelle erlebt haben, in einem sauberen Bereich zu arbeiten und Kontaminationen durch Haare und Staub zu vermeiden, da Antikörper eine hohe unspezifische Affinität für diese Materialien aufweisen.Es ist außerdem wichtig, stets auch eine Kernfärbung durchzuführen. Es ist möglich, Blutzellen aus den gereinigten Gefäßen zu entfernen, indem vor der Gefäßentnahme eine intrakardiale Perfusion mit PBS durchgeführt wird. Wir haben erfolgreich Luft und Proteine aus Gefäßen gewonnen, die nach diesem Verfahren sowohl aus frisch präparierten als auch aus gefrorenen Gefäßproben gereinigt wurden.Wir haben außerdem fluoreszierende Sonden und die konfokale Mikroskopie verwendet, um die ex vivo endotheliale Transportfunktion der Gefäße zu untersuchen. Wir wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache, praktische Technik für zerebrovaskuläre Casting, das einfach durchzuführen ist und kann zur Abbildung des Gefäßbaumes der erwachsenen Gehirn der Maus eingesetzt werden.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Dieses Video zeigt die Isolierung intakter Gefäße aus dem Gehirn einer Maus, die zusammen mit Neuronen und Gliazellen die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bilden. Die isolierten Gefäße können als In-vitro-Modell verwendet werden, um ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns zu untersuchen.

Isolierung von Hirngefäßen von Mäusen: Ein Protokoll zur Isolierung intakter Gefäße aus einer Gehirnprobe von Mäusen

Dieses Video zeigt die Isolierung von Kapillaren aus frischen Schweinegehirnen. Der Prozess umfasst die Entfernung der Hirnhäute, die Isolierung der grauen Substanz aus dem Gehirngewebe, die Homogenisierung und Filterung der grauen Substanz, um die Kapillaren zu isolieren, und schließlich die enzymatische Verdauung, um die Kapillaren weiter zu reinigen.

Reinigung der Kapillaren aus dem Schweinegehirn

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von zerebralen Perizyten aus einem Mäusegehirn. Die isolierten Zellen werden in perizytenspezifischen Medien kultiviert, um die Perizytenproliferation zu fördern.

Isolierung und Kultivierung von zerebralen Perizyten der Maus

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung der Endothelröhren aus dem Hirnparenchym der Maus. Durch eine Kombination aus enzymatischem Verdau und mechanischer Dissoziation entsteht eine intakte Röhre mit Endothelzellen.

Präparation von zerebralen Endotheltuben aus parenchymalen Arteriolen der Maus

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Wir beschreiben hier ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung des Mauskreises von Willis.

Protokoll für die Maus Kreis von Willis Trenn

Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Wir zeigen die chemische Induktion großer Blutgefäßerweiterungen bei Mäusen als Modell für die Untersuchung zerebrovaskulärer Dysfunktion, das für die Modellierung von vaskulärer Demenz und Alzheimer verwendet werden kann. Wir demonstrieren auch die Visualisierung des Gefäßsystems durch Injektion von Silikonkautschukmischung und eine klare visuelle Anleitung zur Messung von Veränderungen der Blutgefäßgröße.

Ein visueller Ansatz zur Induktion von Dolichoektasie bei Mäusen zur Modellierung der durch große Gefäße vermittelten zerebrovaskulären Dysfunktion

Lernen Sie eine Methode zur Reinigung von Maus-Hirngefäßen unter Erhalt ihrer strukturellen Integrität mittels langsamer Zentrifugation und Filtration. Dieses Protokoll ermöglicht zelluläre und molekulare Untersuchungen der Blut-Hirn-Schranke.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

Weitere Videos entdecken