Reinigung von Maus-Hirngefäße

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens ist es, das Gefäßkompartiment des Mausgehirns unter Beibehaltung seiner strukturellen Integrität zu reinigen, wobei eine Reihe von Zentrifugationen und Filtrationen mit niedriger Geschwindigkeit verwendet werden, ohne dass spezifische Antikörper oder transgene Stämme erforderlich sind. Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um Techniken zu entwickeln, die zelluläre, molekulare und pharmakologische Untersuchungen der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen. Das Fehlen von Trennungen, Gradienten, Dickdarm oder Hochgeschwindigkeitszentrifugationsschritten macht die Reinigung der Hirngefäße durch dieses Verfahren sehr einfach, schnell und kostengünstig.

Die Hirngefäße bleiben strukturell intakt, wobei die Endot-Zellen durch die Tag-Verbindung verschlossen und von den basalen Lanarparasiten, den vaskulären S-meisten Muskelzellen und den perivaskulären Astromembranen umgeben sind. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Funktion des CE-Gefäßkompartiments zu beantworten und die Untersuchung seiner molekularen Zusammensetzung zu ermöglichen, um das Verfahren zu demonstrieren, wird ein ehemaliger Postdoc aus dem Team von Martin Coen S sein. Schneiden Sie vor Beginn des Vorgangs den Boden des oberen Schraubteils des Filterhalters ab.

Dann mit einem Skalpell die Haut vom Maushals bis zur Nase einschneiden und die Haut zurückziehen. Wasche den Schädel mit PBS, um alle kontaminierenden Haare zu entfernen, und führe dann eine Schere in den Schädel vor den Riechkolben ein. Öffnen Sie die Schere, um den Schädel in Teile zu brechen, und entfernen Sie das Gehirn mit dem Spatel.

Als nächstes präparieren Sie den Plexus choroideus aus den Seitenventrikeln und übertragen das Gehirn in ein 150-Milliliter-Becherglas mit 20 Millilitern B-eins-Lösung auf Eis. Schneiden Sie dann mit zwei Skalpellen das Gehirn kräftig in zwei Millimeter große Gewebefragmente und verwenden Sie einen automatisierten Down-Homogenisator, um das Gewebe für 20 Schläge bei 400 U/min auf Eis zu homogenisieren. Um die Gefäße zu reinigen, geben Sie das Homogenat in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen und schleudern Sie die Gewebeaufschlämmung herunter.

In einer Schwingrotorzentrifuge bildet sich auf der Oberseite des Gefäßpellets eine große weiße Grenzfläche, die hauptsächlich aus Myelin besteht. Entsorgen Sie den Überstand bei 20 Millilitern eiskalter B-Zwei-Lösung und schütteln Sie das Röhrchen eine Minute lang kräftig. Nach einer zweiten Zentrifugation bildet das Myelin eine dichte weiße Schicht an der Oberfläche des Überstands.

Drehen Sie das Röhrchen langsam, damit die B-Zwei-Lösung beim Ausgießen an der Wand entlanglaufen kann, und entsorgen Sie das Myelin mit dem Überstand. Verwenden Sie dann eine in saugfähiges Papier eingewickelte Plastikpipette, um Flüssigkeitsreste von den Wänden des Röhrchens zu entfernen. Achten Sie darauf, das Pellet des Behälters nicht zu berühren und das Rohr auf dem Eis auf den Kopf zu stellen.

Als nächstes wird das Pellet in einem Milliliter eiskalter B-3-Lösung aufgehängt, gefolgt von der Zugabe von weiteren fünf Millilitern B-3-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass die Gefäße keine Aggregate bilden. Legen Sie nun einen 20-Mikron-Nylon-Netzfilter auf einen Becker-Kolben und äquilibrieren Sie den Filter mit 10 Millilitern eiskalter B-Drei-Lösung. Gießen Sie die Gefäßvorbereitung auf den Filter und spülen Sie die Gefäße vorsichtig mit weiteren 40 Millilitern eiskalter B-3-Lösung aus.

Setzen Sie dann den Filter sofort mit einer sauberen Pinzette in ein Becherglas mit 30 Millilitern frischer B-3-Lösung um und befestigen Sie die Gefäße aus dem Filter durch leichtes Schütteln. Gießen Sie den Becherinhalt in ein 50-Milliliter-Plastikröhrchen. Nach einer Zentrifugation wird das Pellet vor der Immunfärbung in einem Milliliter eiskalter B-3-Lösung erneut suspendiert.

Füllen Sie die Gefäße in 0,2 Milliliter PCR-Röhrchen und legen Sie die Gefäße auf Eis, bis sich das Gewebe am Boden der Röhrchen absetzt. Verwenden Sie dann Gelladespitzen, um den größten Teil der Flüssigkeit abzusaugen. Führen Sie anschließend eine silikonisierte 40-Mikrometer-Glaskapillare in eine Pipettenspitze P 200 ein und übertragen Sie die Gefäße mit der Kapillare auf einen Objektträger, wenn sich die Gefäße abgesetzt haben. Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einem Stück saugfähigem Papier.

Laden Sie dann einen einzelnen Tropfen Eindeckmedium auf die Gefäße und bringen Sie einen Deckglas in einem Winkel von 45 Grad an, so dass sich das Eindeckmedium entlang der Glaskante verteilen kann, bis der Deckglas an Ort und Stelle ist. In diesem Bild ist eine kontinuierliche RIN-Markierung um neurale Endothelzellen zu beobachten, die den Verbleib der basalen Lamina auf den gereinigten Gefäßen bestätigt. Bestandteile der endothelialen Tight Junctions, wie z.B. ZO one, werden ebenfalls an den gereinigten Gefäßen nachgewiesen.

Darüber hinaus deuten die NG-2- und die Aktinmarkierung der glatten Muskulatur auf die Retention intakter Parasiten bzw. vaskulärer glatter Muskelzellen hin. Perivaskuläre astrogliale Membranproteine Verbindung 43 und Aquaporin vier werden ebenfalls an der Oberfläche der gereinigten Gefäße nachgewiesen, was die zusätzliche Retention der perivaskulären Astrozytenmembranen während des Reinigungsprozesses demonstriert, nur dispergierte und kurze GFAP-positive Fasern werden jedoch auf den isolierten Gefäßen beobachtet, was zeigt, dass die Astrozytenzellkörper nicht co-gereinigt sind. Nur wenige neuronale Fasern bleiben an den Gefäßen haften.

In ähnlicher Weise werden auch IBA eins und oli zwei positive Zellen nicht nachgewiesen, was bestätigt, dass Mikroglia und Oligodendrozyten nicht co-gereinigt sind. Wir empfehlen dringend, den aktuellen Plexus vor der Homogenisierung des Gehirns zu entfernen, da wir ihn als mögliche Kontaminationsquelle erlebt haben, in einem sauberen Bereich zu arbeiten und eine Kontamination mit Haaren und Staub zu vermeiden. Da Antikörper eine hohe unspezifische Affinität zu diesen Materialien haben.

Es ist auch wichtig, immer auch eine Kernfärbung durchzuführen. Es ist möglich, Blutzellen aus den gereinigten Gefäßen zu entfernen, indem vor der Gefäßextraktion eine intrakardiale Perfusion mit PBS durchgeführt wird. Wir haben erfolgreich Luft und Proteine aus Gefäßen extrahiert, die mit diesem Verfahren gereinigt wurden, sowohl aus frisch zubereiteten als auch aus gefrorenen Gefäßpaletten.

Wir haben auch Fluoreszenzsonden und konfokale Mikroskopie verwendet, um die ex vivo endotheliale Transportfunktion der Gefäße zu untersuchen. Wir wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.