Reinigung von Maus-Hirngefäße

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens besteht darin, den vaskulären Kompartiment des Maushirns zu reinigen, wobei dessen strukturelle Integrität erhalten bleibt, indem eine Abfolge von Zentrifugationen mit niedriger Geschwindigkeit und Filtrationen durchgeführt wird, ohne dass spezifische Antikörper oder transgene Stämme erforderlich sind. Es wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um Techniken zu entwickeln, die zelluläre, molekulare und pharmakologische Untersuchungen der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen. Die Abwesenheit von Trennungen, Gradienten, Kolonnen oder Zentrifugationsschritten mit hoher Geschwindigkeit macht die Reinigung von Hirngefäßen mittels dieses Verfahrens sehr einfach, schnell und kostengünstig.

Die Gefäße des Gehirns bleiben strukturell intakt, wobei die Endothelzellen durch Tight Junctions verschlossen sind und von basalen laminalen Parasiten, vaskulären glatten Muskelzellen und perivaskulären Astrozytenmembranen umgeben sind. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen zur Funktion des zerebralen vaskulären Kompartiments zu beantworten und ermöglicht die Untersuchung seiner molekularen Zusammensetzung. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch einen Postdoktoranden aus dem Team von Martin Coen S. Vor Beginn des Verfahrens sollte der Boden des oberen Schraubteils des Filterhalters abgeschnitten werden.

Verwenden Sie dann ein Skalpell, um die Haut des Mäuses vom Hals bis zur Nase einzuschneiden, und ziehen Sie die Haut zurück. Waschen Sie den Schädel mit PBS, um eventuelle kontaminierende Haare zu entfernen, und führen Sie dann eine Schere anterior zu den Riechkolben in den Schädel ein. Öffnen Sie die Schere, um den Schädel zu zerbrechen, und entfernen Sie das Gehirn mit dem Spatel.

Als Nächstes wird das Plexus-choroideus aus den Seitenventrikeln präpariert und das Gehirn in einen 150-Milliliter-Becher mit 20 Milliliter B1-Lösung auf Eis überführt. Anschließend wird das Gehirn mit zwei Skalpellen kräftig in zwei Millimeter große Gewebefragmente zerkleinert und das Gewebe mithilfe eines automatischen Down-Homogenisators 20-mal bei 400 U/min auf Eis homogenisiert. Zur Reinigung der Gefäße wird das Homogenat in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführt und die Gewebesuspension abzentrifugiert.

In einer Schwingrotor-Zentrifuge bildet sich an der Oberseite des Vessel-Pellets eine große weiße Phase, die hauptsächlich aus Myelin besteht. Entsorgen Sie den Überstand bei 20 Milliliter eiskalter B-zwei-Lösung und schütteln Sie das Gefäß kräftig für eine Minute. Nach einer zweiten Zentrifugation bildet das Myelin eine dichte weiße Schicht an der Oberfläche des Überstands.

Drehen Sie das Röhrchen langsam, um sicherzustellen, dass die B zwei-Lösung beim Ausgießen entlang der Wand läuft, und entsorgen Sie das Myelin mit dem Überstand. Verwenden Sie anschließend eine mit absorbierendem Papier umwickelte Plastikpipette, um restliche Flüssigkeit von den Wänden des Röhrchens zu entfernen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu berühren, und stellen Sie das Röhrchen auf dem Kopf stehend auf Eis.

Als Nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalter B3-Lösung, gefolgt von der Zugabe von weiteren fünf Millilitern B3-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass die Gefäße keine Aggregate bilden. Stellen Sie nun ein 20-Mikrometer-Nylon-Mesh-Filter auf einen Erlenmeyerkolben und equilibrieren Sie das Filter mit 10 Millilitern eiskalter B3-Lösung. Gießen Sie die Gefäßpräparation auf das Filter und spülen Sie die Gefäße vorsichtig mit weiteren 40 Millilitern eiskalter B3-Lösung nach.

Verwenden Sie dann saubere Pinzette, um den Filter umgehend in einen Becher mit 30 Milliliter frischer B-drei-Lösung zu überführen, und lösen Sie die Zellen vorsichtig unter Schütteln vom Filter ab. Gießen Sie den Inhalt des Bechers in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Nach einer Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalter B-drei-Lösung, bevor die Immunfärbung durchgeführt wird.

Überführen Sie die Gefäße in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen und stellen Sie die Röhrchen auf Eis, bis sich das Gewebesediment am Boden der Röhrchen abgesetzt hat. Anschließend saugen Sie mithilfe von Gel-Ladepipettenspitzen den größten Teil der Flüssigkeit ab. Danach führen Sie eine silikonisierte 40-Mikrometer-Glaskapillare in eine P-200-Pipettenspitze ein und übertragen damit die Gefäße auf einen Objektträger. Wenn sich die Gefäße abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Stück Saugpapier.

Danach einen einzelnen Tropfen Einbettmedium auf die Gefäße geben und einen Deckglaser an einem Winkel von 45 Grad anbringen, wobei das Einbettmedium entlang der Kante des Glases laufen kann, bis der Deckglaser vollständig sitzt. Auf diesem Bild ist eine kontinuierliche RIN-Färbung um die neuralen endothelialen Zellen herum zu erkennen, was die Erhaltung der Basallamina an den gereinigten Gefäßen bestätigt. Bestandteile der endothelialen Tight Junctions, wie ZO-1, sind ebenfalls auf den gereinigten Gefäßen nachweisbar.

Außerdem deuten die Markierungen für NG zwei und glatte Muskel-Aktin auf die Erhaltung intakter Parasiten bzw. glatter Gefäßmuskelzellen hin. Perivaskuläre Astroglia-Membranproteine, Connexin 43 und Aquaporin 4, sind ebenfalls an der Oberfläche der gereinigten Gefäße nachweisbar, was die zusätzliche Erhaltung perivaskulärer Astrozytenmembranen während des Reinigungsprozesses zeigt. Es werden jedoch nur verstreute und kurze, GFAP-positive Fasern an den isolierten Gefäßen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Astrozyten-Zellkörper nicht mitgereinigt wurden. Nur wenige neuronale Fasern verbleiben an den Gefäßen angeheftet.

Ebenso werden keine IBA-eins- und Oli-zwei-positiven Zellen nachgewiesen, was bestätigt, dass Mikroglia und Oligodendrozyten nicht gemeinsam gereinigt werden. Wir empfehlen nachdrücklich, das aktuelle Plexus vor der Homogenisierung des Gehirns zu entfernen, da wir dies als mögliche Kontaminationsquelle erlebt haben, in einem sauberen Bereich zu arbeiten und Kontaminationen durch Haare und Staub zu vermeiden, da Antikörper eine hohe unspezifische Affinität für diese Materialien aufweisen.

Es ist außerdem wichtig, stets auch eine Kernfärbung durchzuführen. Es ist möglich, Blutzellen aus den gereinigten Gefäßen zu entfernen, indem vor der Gefäßentnahme eine intrakardiale Perfusion mit PBS durchgeführt wird. Wir haben erfolgreich Luft und Proteine aus Gefäßen gewonnen, die nach diesem Verfahren sowohl aus frisch präparierten als auch aus gefrorenen Gefäßproben gereinigt wurden.

Wir haben außerdem fluoreszierende Sonden und die konfokale Mikroskopie verwendet, um die ex vivo endotheliale Transportfunktion der Gefäße zu untersuchen. Wir wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.