Name: Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Lernen Sie die modifizierte Landis-Technik zur Messung der hydraulischen Leitfähigkeit einzelner Mikrogefäße im Rattenmesenterium. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der Mikrogefäßpermeabilität unter kontrollierten Bedingungen.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse HL44485 und HL28607 unterstützt.

Ethics Statement: Alle Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Vorab Herstellung von Mikropipetten, Einschränkung der Bewegungsfreiheit, und Blockers <ol><li> Ziehen mehreren sauberen Borosilikatglas Kapillarröhrchen Hälfte mit Hilfe eines elektronischen Abzieher so eingestellt, daß, wenn er gezogen wird, ist der gestreckte Abschnitt des Rohrs etwa 1 cm in der Länge und die beiden Hälften sind etwas symmetrisch. Stellen Sie sicher, dass die Verjüngung steht im Einklang mit den Abmessungen in Abbildung 1. Verwenden Sie beide Hälften für Mikropipetten, Verzögerer und Blocker. <ol><li> Bevel die Mikropipetten mit einem luftbetriebenen Schleifscheibe 30 mit 0,5 &amp; mgr; m-Schleifpapier mit Wasser gebadet. Den Winkel der Mikropipette Halter, so daß es etwa 30 Grad von der Horizontalen. </li><li> Gründlich reinigen und abtrocknen die Mikropipetten mit Hilfe Absaugen, um saubere Aceton durch die Spitze und bis der Welle ziehen. Überprüfen Sie die Mikropipetten (1A) mit einem kleinen aufrechten Mikroskop mit 4 × und 40 × Ziele mit einer Krokodilklemme Mikropipette Halter und einem Okular-Strich ausgestattet. </li><li> Wählen Mikropipetten mit Spitzenöffnung etwa 50 &amp; mgr; m lang mit einer Fase, deren Länge / Breite-Verhältnis zwischen 3,1 und 3,5 und mit einem stark verjüngenden Punkt, dringen in die harte Kollagenfasern im Mesenterium hilft. </li><li> Speichern 15-20 Mikropipetten aus leicht unterschiedlicher Größe in einer staubfreien Feld. </li></ol></li><li> Machen Verzögerer mit gezogen Kapillaren in Schritt 1.1) hergestellt. Halten Sie eine gezogen Glaskapillarrohr kurz in der Nähe einer Mikroflamme, um ein stumpfes Ende (1B) zu bilden. Bewahren Sie mehrere in einer staubfreien Feld. </li><li> Machen microoccluders Verwendung gezogen Kapillaren in Schritt 1.1) hergestellt. Halten Sie eine gezogen Kapillare unter einem Mikroflamme und vorsichtig biegen (unter Verwendung eines Schlauchadapter, z. B. 23G) die feine Spitze (ca. 4 mm von der Spitze), um einen Winkel von fast 120 Grad, um die Welle zu machen ( <strong&gt; 1C). Machen Sie und speichern Sie mehrere. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere und Chirurgie <ol><li> Anästhesiert männliche (350-450 g) oder weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (200-300 g) mit Natriumpentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) subkutan injiziert; Schutz des Mesenteriums indem keine intraperitoneale Injektion. </li><li> Gesamten chirurgischen Verfahren und experimentelle Protokolle, Aufrechterhaltung einer Narkose durch zusätzliche Injektionen (30 mg / kg) nach Bedarf. Bestimmen Sie Narkosetiefe durch toe Prise oder Hornhautreflex. Nach Beendigung des experimentellen Verfahrens, euthanize die Ratte über Pentobarbitalüberdosis oder intrakardiale Injektion von gesättigtem Kaliumchlorid unter Anästhesie. </li></ol> 3. Bereiten Solutions und Erythrozyten zur Verwendung als Durchfluss Markers <ol><li> Vorbereitung Säugerringerlösung für Superfusat und Steuerungs Perfusatlösung (typischerweise Säuger Ringerlösung, die 10 mg / ml Fettsäurekostenlos Rinderserumalbumin, BSA). <ol><li> Filter Perfusat durch 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter, um winzige Partikel, die die Mikropipettenspitze blockieren könnten, zu entfernen; Filter in kleine sauberen Behälter. </li></ol></li><li> Vorbereitung Erythrozyten, indem etwa 0,2 ml Blut aus der Schwanzvene der narkotisierten Ratte in einer 20G-Nadel auf einer kleinen Spritze mit 0,05 ml Heparin (1000 U / ml) und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit etwa 14 ml Säugerringerlösung Lösung . <ol><li> Zentrifuge vorsichtig packen roten Zellen (ca. max 200 g für 7 min). Beziehen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die roten Zellen in Ringer-Lösung. </li><li> Nach Zentrifugieren und Entfernen verlassen Stand dreimal die gepackten roten Zellen, die in der Unterseite des Rohres für eine spätere Verwendung. Man beachte, dass diese Vorgehensweise reduziert Blutplättchen in der endgültigen perfusates auf weniger als 0,1% des normalen Niveaus 31. </li></ol></li></ol> 4. Ordnen Sie die Tissue auf dem TierTray <ol><li> Rasieren Sie den Bauch des narkotisierten Ratten von unten Nabel bis Schwertfortsatz. Sicherzustellen, daß die rasierten Bereich erstreckt sich um die rechte Seite (für Ratten auf der rechten Seite angeordnet), so daß das Haar nicht einen Docht zu bilden, um das Superfusat aus dem Gewebe heraus und ziehen. Entfernen Cut Haare mit einem befeuchteten Gaze oder Gewebe. <ol><li> Halten Sie die Haut mit einem stumpfen gezahnten Pinzette und eine Mittellinie Schnitt (2-3 cm lang) durch die Haut mit ein robustes Schere. Mit einem feinen (Iris) Schere machen einen ähnlichen Schnitt durch die Linea alba, die Aufhebung der Bauchwand mit Wellenzange um eine Beschädigung der Darm. </li><li> Mit dem Tier auf seiner Seite auf dem Tier Fach, ziehen Sie vorsichtig den Darm aus der Bauchhöhle mit Wattestäbchen (Holzstab) in Ringer-Lösung und stumpf gezähnten Zange eingeweicht. Ordnen Sie die gut in das Gewebe gut, so dass das Mesenterium wird über die Säule für die Betrachtung durch das Mikroskop die Pflege zu vermeiden, berühren Sie die Gekröse (pote drapiertntially beschädigen Mikrogefäßen) entweder mit einer Pinzette oder Baumwolle. Hinweis: Das Tier Fach (2A) aus Plexiglas gebaut werden und erfordert eine Gewebe gut (ca. 3 mm tief), ein optisch klares Säule (zB poliert Quarz ca. 2 cm Durchmesser und 5 mm hoch.) Und eine wärmende Unterlage so eingestellt, daß das Tier Temperatur aufrechtzuerhalten. Die Dicke der Säule muß der Arbeitsabstand der Objektiv nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Die Position des Tieres Tablett auf dem Mikroskoptisch, so dass das Mesenterium durch die Okulare sichtbar ist. </li><li> Positionieren Sie einen der Schwerkraft gespeiste Tropflinie kontinuierlich superfuse das Mesenterium mit Säugetier-Ringer-Lösung bei 35-37 ° C gehalten. Verwenden Gaze-Pads, die gut in Position zu halten, zu helfen, Feuchtigkeit zu speichern und zu saugen überschüssige Ringer-Lösung von der Oberfläche. Stellen Sie die Strömung und saugen Sie den Abfluß, um eine konsistente Superfusat Dicke zu erhalten. </li><li> Identifizieren Sie Ziel venulären Mikrogefäße, die sindunverzweigte Segmenten nachgeschaltet konvergenten Strömungs eine oder zwei Verzweigungen distal wahre Kapillaren. Finden Sie einen unverzweigten Gefäß (idealerweise 600 bis 1000 &amp; mgr; m in der Länge) mit flotten Durchblutung und frei von weißen Blutkörperchen kleben an der Gefäßwand. </li><li> Positionieren Sie den Testmikrogefäß in der Mitte des Mikroskopfeld und bewegen Sie den Verzögerer in die richtige Position in der Nähe der gewählten Kanülierungsstelle. </li></ol> 5. Füllen Mikropipette und Mount in Halter <ol><li> Kurz vor Kanülierung, auszusetzen: die Erythrozyten im Perfusat. Hinzufügen 7 ul gepackter roter Zellen auf 0,5 ml Perfusat in einem sauberen Borosilikat Reagenzglas. Hinweis: Hämatokritwerte von 1-3% können verwendet werden, aber im Einklang Hämatokrit wird, um konsistente Perfusat Konzentrationen von Stoffen aus den roten Blutkörperchen freigesetzt führen. </li><li> Eine 1-ml-Spritze mit einer 23G-Schlauchadapter und PE 50 Schläuchen (5-15 cm Länge). Zeichnen Sie das Perfusat / rot Zellgemisch in die Spritze. Kehren Spritze zu mischen und zu vertreiben alle Luftblasen aus Schlauch undAdapter. Für mehr Effizienz, fit Schlauch an mehreren Spritzen vor dem Beginn des Experiments und halten sie in einer staubfreien Karton oder Plastikbeutel. </li><li> Füllen der Mikropipette durch Vorschieben der Rohrleitung in das große Ende der Mikropipette bis es den sich verjüngenden Bereich anliegt. Tragen Sie eine sanfte kurzer Druck auf den Spritzenkolben, um die Mikropipettenspitze zu füllen. Hinweis: Eine kleine Stream oder Tropfen sollte an der Spitze sichtbar sein, um eine vollständige Füllung nachzuweisen. </li><li> Ziehen Sie den Schlauch unter leichtem Druck auf den Kolben, um den breiteren Teil des Mikropipette Welle zu füllen. Entfernen Sie kleine Blasen in der breiten Welle durch vorsichtiges Schwenken der Mikropipette Welle. Hinweis: Ein ähnliches Verfahren wurde 32 dargestellt. </li><li> Platzieren der Mikropipette in eine Pipettenhalter mit einer Seitenöffnung, die eine kontinuierliche Fluidverbindung mit einem Wassermanometer ermöglicht. Sicherzustellen, dass der Halter, der mit einem hydraulischen Antrieb verwendet werden, um sehr feine Weiterentwicklung der Mikropipette unter Kontrolle gebunden ist, in einem kleinen Winkel (15-25 °)zur Horizontalen, so dass der Rand der Mikropipette Verjüngung nicht traf den Darm oder Fach. </li><li> Montieren Sie den hydraulischen Antrieb auf einer beweglichen Mikromanipulator, der x, y und z-Antrieben muss eine enge Abstimmung mit dem Testgefäß (Abbildung 2) zu ermöglichen. </li><li> Einstellen des hydrostatischen Drucks auf das Fluid in der Mikropipette unter Verwendung einer Spritze oder wassergefüllte Gummiblase, die Höhe der Flüssigkeit in der Wassersäule des Manometers bis ungefähr 40 cmH 2 O oberhalb des Mesenteriums ändern. </li><li> Kanülieren die Mikrogefäß so bald wie möglich nach dem Füllen der Pipette; Erythrozyten setzen sich am Boden der Pipette, so dass nach etwa 40 Minuten sehr wenige Erythrozyten in den Behälter fließen. </li></ol> 6. Microcannulation und mikrovaskuläre Druckmessung <ol><li> Vor der Positionierung des gefüllte Mikropipette unter dem Mikroskop, vorsichtig auf die Rückhalteeinrichtung auf das Gewebe in der Nähe des Mikrogefäß eine ausreichende Kraft zum Greifen des Gewebes. Zeichnen Sie dieRestrainer zurück, das Gewebe in Übereinstimmung mit der Mikrogefäß leicht ausdehnt, so daß die Spannungen in den mesenterialen Kollagenfasern werden mit dem Behälter ausgerichtet ist. <ol><li> Richten Sie die Mikropipette mit dem Behälter und setzen Sie sie in den Blick durch die Okulare. Setzen Sie die Spitze kurz vor dem gewählten Kanülierungsstelle und senken Sie es auf das Gewebe, so dass es teilweise behindert Fluss innerhalb des Gefäßes, aber nicht zu verschließen ist. </li></ol></li><li> Kanülieren das Gefäß durch Antreiben der Pipettenspitze langsam in das Gefäßlumen mit dem hydraulischen Antrieb. Achten Sie darauf, durch die untere Seite des Behälters zu drücken. Hinweis: Da die Mikropipette in die Lumen, das Perfusat schnell wäscht das Blut in den Behälter aus dem Lumen und Perfusat frei fließt in Umlauf distal des Tieres auf die Probe microvessel verdrängen einige der normalen Durchblutung in den nachgeschalteten Behälter. </li><li> Senken Sie den Perfusionsdruck durch Einstellen der Manometer, bis das Blut (wie angegebenvon roten Zellen des Tieres) zurück in den perfundierten Segment gezogen wird; dies bestimmt die ausgeglichene Druck, wo die roten Zellen vorsichtig oszillieren im Gefäßlumen und misst den hydrostatischen Mikrogefäßdruck (P c) an dem distalen Ende des Mikrogefäßsegment. Pflegen Gefäßdurchblutung bei allen Drücken oberhalb dieses Gleichgewicht Druck. </li></ol> 7. Microocclusion und Erhebung von Daten <ol><li> Optionaler Schritt: Vor der Verwendung der Mikro-Okkluder, um den Behälter zu sperren, drücken Sie sie in das Gewebe in einem nicht verwendeten Bereich des Mesenterium weit von jedem Schiff, so dass die Spitze sammelt sich eine feine Polster aus Gewebe, das die Versuchsgefäß während wiederholter Mikro schützt Verschlüsse. </li><li> Setzen Sie den Blocker oberhalb des durchströmten Behälter in der Nähe des unteren Randes des Mikroskops ein. </li><li> Nehmen Sie die folgende mit Video und Audio. <ol><li> Mündlich erfassen die Position des Blocks Website und unteren Bildschirmrand auf der Okular-Strich gesehen. </li><li> Mit der Spitzedes Blockers gerade oberhalb des Mikrogefäß platziert Mit dem Fein z Steuerung des Mikromanipulators sanft absenken Blocker, bis die Strömung im Behälter verschlossen wird. Beachten Sie das Manometer Druck (P c) auf Audio. Bewerben Okklusion in der Regel für 3-10 sec und dann freigeben, die Wiederherstellung frei Perfusion. Bewegen Sie den Block Website bis das Schiff in Richtung auf die Pipettenspitze in 5-10 um Schritte basierend auf Zeit (&gt; 5 min nach dem ersten Block an einem Standort), die Anzahl der Verschlüsse (3-5), um Gefäßwandschäden am Block Website zu verhindern . </li></ol></li></ol> 8. Analyse von Daten und Messung der L p (Wasserdurchlässigkeit) <ol><li> Während der Wiedergabe, bestimmen die Anfangsabstand (ℓ 0) von einer Markierung von roten Blutkörperchen an die Okklusions-Stelle unter Verwendung eines Bildes einer Objektmikrometer und die bekannten Positionen in den Bildern. Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit (dl / dt) des Markers Zelle von ihrer Position in mehreren Rahmen während des 3-10 sec von aufgezeichneten Bildern. AbschreckenMinen das Schiff Radius (r) aus den Bildern während der Okklusion (Abbildung 3) übernommen. </li><li> Berechnen J v / S für jede Okklusion (dl / dt) x (1 / ℓ 0), x (r / 2). Berechnen L p auf einem konstanten Druck (J v / S) dividiert durch den Antriebsdruck (Mikrogefäßdruck - effektive kolloidosmotischen Druck, siehe Diskussion). </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Details von L p Berechnungen. Obwohl transvaskulären Flüssigkeitsbewegung auftritt, während das Schiff frei durchströmt, ist ein solcher Austausch viel zu klein, um im freien Durchblutung gemessen, weil es in der Regel weniger als 0,01% des Schiffes Perfusionsrate werden. Jedoch, wenn die Perfusion transient durch Verschließen der Mikrogefäß, transvaskulär Strom gestoppt (dh Filtration) von der Bewegung des Markers roten Zellen in das Lumen als die Fluidsäule zwischen einem Marker roten Zell...

Mikroperfusionskammer im Gefäß gehört der Aufbau gesteuerte Strömung eines künstlichen Perfusat bekannter Zusammensetzung über eine Mikropipette in einem Blutgefäß in der Regel weniger als 40 um im Durchmesser. Die durchströmten Gefäß bleibt innerhalb seiner normalen Gewebeumgebung und ist mit Blut bis das Tier zum Zeitpunkt der Kanülierung perfundiert. Wenn sie in Verbindung mit einer Reihe von Video-Imaging oder fluorometrische Techniken in situ Mikroperfusionskammer verwendet ermöglicht die Messung von Wasser und Stoffströme in den Wänden von Mikrogefäßen unter Bedingungen, wo die treibende Kraft für diese Ströme bekannt sind, und die Durchlässigkeitseigenschaften der Gefäßwand kann direkt ausgewertet. Ferner kann durch Steuern der Zusammensetzung der Flüssigkeit um das Mikrogefäß in dem Gewebe (Perfusat und Superfusat), Regelung der Mikrogefäßdurchlässigkeit und den Austausch kann durch Aktivierung der Endothelzellen Bildung der Mikrogefäßwand, um eine Vielzahl von E ausgesetzt werden untersucht werdenxperimental Bedingungen für präzise gemessen Zeit (Sek hr) (Agonisten, modifizierte Perfusionsbedingungen, Fluoreszenzindikatoren an intrazelluläre Zusammensetzung und Signalisierung zu messen). Zusätzlich können ultra oder cytochemischen Evaluierungen zelluläre Schlüsselmolekülstrukturen Regulieren der Barriere in den gleichen Mikrogefäßen in denen Durchlässigkeit direkt gemessen wird untersucht werden. Der Ansatz bildet dabei eine Brücke zwischen Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen zu Endothelbarriere Funktion in kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und die Untersuchung in intakten Mikrogefäßen zu modifizieren. Auch die folgenden Beiträge zu weiteren Auswertung 1-6. Eine Begrenzung der Mikroperfusionskammer ist, dass sie nur in mikrovaskulären Betten, die dünn, transparent sind und eine ausreichende strukturelle Integrität Kanülierung mit einer Glasmikropipette verwendet werden, ermöglichen. Während frühe Untersuchungen verwendet Frosch Mikrogefäße im Mesenterium und dünne Haut pectoris muscle 7,8, die bei weitem am häufigsten verwendete Zubereitung in Säugermodellen ist die Rattengekröse 9-15. Die meisten Untersuchungen auf akute Veränderungen der Gefäßdurchlässigkeit untersucht über einen Zeitraum von 1-4 Stunden konzentriert, aber neuere Untersuchungen haben Messungen an einzelnen Schiffen nach einer anfänglichen Perfusion 12,16 erweitert 24-72 h. Die neu entwickelte CRISPR-Technologie, die zur Untersuchung der vaskulären Permeabilität Regulierung 17 sollten die in dieser Mitteilung beschriebenen Methoden ermöglichen mehr gentechnisch veränderte Rattenmodellen verfügbar zu machen verspricht, in venulären Mikrogefäßen des Mesenteriums in dieser wichtigen neuen Rattenmodellen angewendet werden. Das Verfahren erfordert eine inverse Mikroskop mit einem speziell angefertigten Mikroskoptisch groß genug ausgestattet, um sowohl den Tier Vorbereitung und mindestens drei Mikromanipulatoren zur Position in der Nähe des Mikrowerk perfundierten Gefäß und einen Perfusion Mikropipette mit dem Behälter auszurichten verwendet haltenLumen. Zum Beispiel eine individuelle Plattform für einen xy Mikroskoptisch (ca. 90 × 60 cm) aus einer 1 cm dicken Stahlplatte mit einem Rostschutzbeschichtung hergestellt werden. Die Phase auf eine Engineering-Indextabelle oder zwei Schwalbenschwanzschlitten rechtwinklig zur Bewegung in der horizontalen Ebene montiert ist und auf Teflonsäulen oder Kugelrollen abgestützt angebracht ist. Eine typische rig (siehe Abbildung 2) hat viel gemeinsam mit dem Mikroskop und Mikropositionierung Ausrüstung für eine Vielzahl von Intravitalmikrozirkulation Experimente, wie sie verwendet werden, um Einzelgefäß Blutfluss und Hämatokrit, lokalen Sauerstoffversorgung von durchbluteten Mikrogefäße, die Regulierung der vaskulären glatten messen Muskeltonus und der örtliche mikrovaskuläre Akkumulation von fluoreszierenden Indikatoren in den gesamten Kreislauf injiziert. 18-26 Die grundlegenden Aspekt der Technik ist die Messung der Volumenstrom (J v) in einer definierten Oberfläche (S) der Mikrogefäßwand. ErreichenDieses über das modifizierte Landis Technik beschrieben eine einfache invertierte Mikroskop ist ausreichend. Eine kleine Videokamera wird auf dem Bild-Port und dem Videosignal angebracht ist, mit einem zusätzlichen Zeitbasis wird auf einem Videomonitor angezeigt und entweder in digitaler Form in einem Computer oder als digitales oder analoges Signal auf einem Videorekorder aufgezeichnet. Sobald die Mikrogefäß kanüliert ist der Teil des Mikrogefäß für die Kamera sichtbar ist, indem die Phase und Manipulatoren als Einheit ohne Unterbrechung der Kanülierung geändert werden. Die Messung der transvaskulären Ströme kann auch mit mehr detaillierte Untersuchungen mit Hilfe eines hoch entwickelten Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern, wie Bohrinseln für die Messung des gelösten Stoffes Durchlässigkeit, Fluoreszenz-Verhältnis Überwachung der zytoplasmatischen Calcium oder anderen zellulären Mechanismen und konfokale Bildgebung 6,12,13 verwendet kombiniert werden, 27. Ein wesentlicher Vorteil aller Mikroperfusionskammer Ansätze ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen zu machen, auf dem gleichen Gefäß, Unter kontrollierten Veränderung der Antriebskraft, wie beispielsweise hydrostatischen und onkotischen Drücke oder induzierte Veränderung der Gefäßreaktionen auf Entzündungszuständen. Die häufigste Design ist eine paarweise Vergleich der gemessenen hydraulischen Leitfähigkeit (L p) auf dem gleichen Schiff mit dem Gefäß zunächst über eine Mikropipette mit einer Steuer Perfusat und der Erythrozytensuspension gefüllt perfundiert, um eine Grundlinie Lässigkeit Zustand mit einem zweiten Pipette zu etablieren, dann mit dem Testmittel zugesetzt, um dem Perfusat. Mehrere Kanülierungen sind mit dem Zyklus nach der Reperfusion mit dem Steuerpipetten wiederholt möglich. Dieses Protokoll zeigt die Kanülen sowie Mikroperfusionskammer eines venulären Gefäß Rattengekröse Wasserflüsse über die Mikrogefäßwand erfassen und messen die L p der Gefäßwand, ein nützlicher Index der Permeabilität des gemeinsamen Syntheseweges für Wasser und gelösten Stoffen durch die intakte endothelialen Barriere. Das Verfahren wird als modifiziert Landis technique, weil die ursprüngliche Landis Prinzip der Verwendung die Relativbewegung der roten Zellen als Maß für die transvaskuläre Flüssigkeitsaustausch nach Perfusion blockiert wird beibehalten 28, aber die Auswahl der Versuchsbedingungen (beispielsweise die hydrostatische und Albumin onkotischen Druckdifferenzen über die Mikrogefäßwand) nach Mikroperfusion verfügbar ist weit größer als in uncannulated blutet Mikrogefäßen 8,29.

<table><tbody><tr><td>MIKROSKOP, TISCH UND TISCH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop (metallurgischer Typ) mit trinokularem Kopf für Videos: Beispiel</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>Versuchen Sie, Okulare relativ zum Tisch höher zu platzieren - Sie müssen durch Okulare schauen, während Sie über dazwischenliegende Mikromanipulatoren bis zur Tischspitze greifen</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop (metallurgischer Typ) mit trinokularem Kopf für Video: Beispiel</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>versucht, Okulare relativ zum Tisch höher zu platzieren - Sie müssen durch Okulare schauen, während Sie über dazwischenliegende Mikromanipulatoren</td></tr> mit <tr><td>schmalem Durchmesser und großem Arbeitsabstand</td> zur Tischspitze greifen: Beispiel <td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&mal;/0,25 LWD LWD-Tischplattform</td><td></td></tr><tr><td>- 1/2 Zoll oder 1 cm Stahlblechschweißwerkstatt</td><td></td><td></td><td>, dies sollte schwer sein, um Vibrationen</td></tr> <tr><td>zu reduzierenUnislide x-y Tabelle: Schwalbenschwanzschlitten</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-Videokamera: Beispiel</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (nicht mehr erhältlich)</td><td>keine Farbe erforderlich</td></tr><tr><td>Videoaufnahmesystem mit Audio - generisches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videowiedergabesystem (vollständig unbewegtes Bild, Einzelbildbewegung)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>klein </td><td></td><td></td><td></td>Mikrofon</tr><tr><td>MIKROMANIPULATOREN, HALTER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (nicht mehr erhältlich)</td><td></td><td>suchen Sie nach feinem Z und einem größeren Verfahrweg bei Grobantrieben für eine einfache Positionierung</td></tr><tr><td>Hydraulischer Sondenantrieb, in eine Richtung</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>muss entweder mit manuellem oder elektronischem Antrieb</td></tr><tr><td>gekauft werden manueller Trommelantrieb</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>oder hydraulischer Antrieb, 3-Wege,</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-Wege) oder MX630 (3-Wege),</td> <td>ideal für kurze Arme, wassergefüllt und muss zum Nachfüllen zurückgeschickt werden ~ alle 2 Jahre</td></tr><tr><td>Anschlüsse / Stangen / Halter</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB usw.</td><td></td></tr><tr><td>Stiftschraubstock</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>zum Halten</td></tr><tr><td>des Pipettenhalters</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>Wassermanometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIKROSKOP TABLETT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>klar Plexiglas für Mikroskop Tablett für Tier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 Zoll polierte Quarzscheibe ~ 1/4 Zoll hoch</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&nbsp;( oder poliertes Plexiglas, Glas); Stellen Sie sicher, dass die Höhe kleiner ist als der Arbeitsabstand des Objektivs</td></tr><tr><td>Plexiglaskleber (Weld-on 4: ACHTUNG KREBSERREGEND)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medizinischer Klebstoff für den Gewebeschacht</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Silikonkautschuk-Heizmatte, 5" L x 2" W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>Heizung für Mikroskoptablett - benötigt Kabel und Controller - 240V-Version verfügbar</td></tr><tr><td>Netzkabeladapter für Kapton-Heizgeräte und -Kits, 6 Fuß, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Controller mit variabler Spannung, 10 A; 120 V Eingang, 0-140 V Ausgang</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vertikaler Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 mit dünnwandigem</td> Kapillarschlauch aus Nichromfilament <td></td></tr><tr><td>mit 1,5 mm Außendurchmesser</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenschleifer Ausströmer- und Seziermikroskop - siehe Referenz im Text</td><td></td><td></td><td>oder kaufen Sie ein Paket von Sutter Instruments oder World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Maschinenalternative</td><td>für Ausströmer, verwenden Sie es mit einem schräg montierten</td></tr> <tr><td>Präpariermikroskop&nbsp; &nbsp; mit Keramik-Schleifscheibe</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>verwenden Sie "wie besehen" oder fügen Sie Läppfolien-Läppfolienblätter bei</td></tr><tr><td>, 0,3 oder 0,5 um</td><td>3M</td><td>Teile-Nr. 051144 80827</td><td>268X Imperiale Läppfolienblätter mit selbstklebender Rückseite - können bei Amazon gekauft werden</td></tr></tbody></table>

mikroperfusion technik zur untersuchung von mikrogefäßdurchlässigkeit verordnung in rattengekröse

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Versuche, um die Durchlässigkeitseigenschaften individuell perfundiert microvessels messen eine Brücke zwischen Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die die vaskuläre Permeabilität in kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und den Funktionsaustauscheigenschaften von Voll mikrovaskulärer Betten. Ein Verfahren, um kanülieren und perfundieren venulären Mikrogefäßen des Rattengekröse und messen die hydraulische Leitfähigkeit des Mikrogefäßwand beschrieben. Die wichtigsten Geräte benötigt umfasst eine Intravitalmikroskop mit einer großen Bühne, die modifizierten Mikromanipulatoren unterstützt zu drei verschiedene Mikrowerk positionieren: (1) eine abgeschrägte Glas-Mikropipette zu kanülieren und Perfusion der Mikrogefäß; (2) eine Glasmikro Okkluder transient zu blockieren Perfusion und ermöglichen die Messung der transvaskulären Wasserströmungsbewegung mit einer gemessenen hydrostatischen Druck, und (3) ein stumpfer Glasstab um den mesenterialen Gewebe an der Stelle der Kanülierung stabilisieren. Die modifizierte Landis Mikro Okklusion technique verwendet Erythrozyten im künstlichen Perfusat als Marker für transvaskuläre Flüssigkeitsbewegung ausgesetzt ist, und ermöglicht auch wiederholte Messungen dieser Ströme als Versuchsbedingungen geändert werden, und hydrostatischen und kolloidosmotischen Druckdifferenz über den Mikrogefäßen werden sorgfältig gesteuert. Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit zunächst unter Verwendung eines Steuer Perfusat, dann nach erneuter Kanülierung der gleichen Mikrogefäß mit den Test Perfusaten ermöglichen Paarvergleiche der Mikrogefäßreaktion unter diesen gut kontrollierten Bedingungen. Versuche, das Verfahren auf Mikrogefäße im Mesenterium von Mäusen mit genetischen Veränderungen erwartet, Gefäßdurchlässigkeit ändern erstrecken waren stark eingeschränkt wegen der Abwesenheit von langen Geraden und unverzweigten Mikrogefäße in der Maus Mesenterium, aber die jüngsten Verfügbarkeit der Ratten, die mit ähnlichen genetischen Veränderungen mit die CRISPR / Cas9 Technologie wird erwartet, dass neue Bereiche der Untersuchung, wo die hier beschriebenen Verfahren angewendet werden kann, zu öffnen. </p&gt;

Figur 4 zeigt die Ergebnisse aus der Messung der Zeitverlauf von Änderungen des L p in einem Ratten venulären microvessel nacheinander mit vier perfusates kanüliert. 33 Die Grße L p auf einem konstanten Druck wurde berechnet als Maß für die Änderungen in der Mikrogefäßwanddurchlässigkeit verwendet wird, zunächst im Steuerzustand mit einem Perfusat, das 1% Rinderserumalbumin, dann, wenn der Behälter auf dem Entzündungsmittel Bradykinin (Bk) unter Verwendung eines zweiten ...

Die modifizierte Landis-Technik ermöglicht die paarweise Messung der hydraulischen Leitfähigkeit einzelner Mikrogefäße im Mesenterium von normalen und genetisch veränderten Ratten unter Kontroll- und Testbedingungen unter Verwendung von Mikroperfusionstechniken. Es bietet eine bequeme Methode zur Bewertung von Mechanismen, die die Durchlässigkeit von Mikrogefäßen und den transvaskulären Austausch unter physiologischen Bedingungen regulieren.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, wiederholte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder Wasserpermeabilität der Wände von Ular-Mikrogefäßen im Ratten-Mesenterium unter kontrollierten experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem Ular-Mikrogefäße kaniert werden, um den onkotischen und hydrostatischen Druck im Lumen einzustellen und die chemische Zusammensetzung des Perfusats und des Suspensats exakt zu kontrollieren. Anschließend wird das Gefäß verschlossen, und rote Blutkörperchen, die in dem Perfusat suspendiert sind und als Flussmarker fungieren, können im Lumen als Indikatoren für den transvaskulären Flüssigkeitsaustausch beobachtet werden.Dann werden die Position und Geschwindigkeit der markierten roten Zellen entweder in Richtung der Okklusionsstelle oder von der Okklusionsstelle weg aufgezeichnet. Schließlich wird die Okklusion gelöst und für zusätzliche Messungen wiederholt, oder das Gefäß wird erneut kanüliert und die Messungen unter veränderten Bedingungen wiederholt.Schließlich können gepaarte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit unter Kontroll- und Testbedingungen durchgeführt werden, um die direkteste Untersuchung der Faktoren zu ermöglichen, die die Permeabilität von Mikrogefäßen regulieren. Ein Vorteil der modifizierten Landis-Technik zur Untersuchung der Regulation der kapillaren Permeabilität ist der Perfusionschritt. Die Mikroperfusion ermöglicht es, die Permeabilität der Mikrogefäßerwand unter Bedingungen zu messen, bei denen die Zusammensetzung des Perfusats, die Austauschfläche und der Druck in den Mikrogefäßen alle direkt kontrolliert werden.Diese Methode kann Fragen zu den zellulären und molekularen Mechanismen der Permeabilitätsregulation in Mikrogefäßen beantworten, die für intakte Organe repräsentativ sind, und ermöglicht einen Vergleich mit Ergebnissen aus kultivierten endothelialen Zellschichten, die häufig zur Untersuchung der Details molekularer Mechanismen verwendet werden. Unsere Protokolldemonstration übernimmt Joyce Clark, unsere Laborleiterin. Joyce war während ihrer Zeit als Laborleiterin für viele der Verbesserungen dieses Protokolls verantwortlich.Verwenden Sie zunächst einen elektronischen Puller, um mehrere saubere Borosilikatglas-Kapillarrohre mit Hilfe einer luftbetriebenen Schleifscheibe und eines 0,5-Mikrometer-Schleifpapiers, das in Wasser getaucht ist, sowie eines Mikropipettenhalters, der in einem Winkel von 30 Grad zur horizontalen Schräge eingestellt ist, zu konischen Hälften zu ziehen – die Mikropipetten. Nach dem Waschen und Trocknen der Mikropipetten gemäß dem schriftlichen Protokoll wählen Sie Mikropipetten mit einer Öffnung von etwa 50 Mikrometern Länge und einem Verhältnis von Schrägenschliff-Länge zu -breite zwischen 3,1 und 3,5 aus. Außerdem sollten sie eine deutlich konisch zulaufende Spitze aufweisen, die das Durchdringen der zähen Kollagenfasern im Mesenterium erleichtert.Um Halterungen herzustellen, halten Sie eine nicht abgeschrägte, gezogene Glas-Kapillare kurzzeitig nahe einer Mikroflamme, um ein stumpfes Ende zu bilden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mehrere Halterungen anzufertigen, und bewahren Sie diese in einer staubfreien Box auf. Stellen Sie anschließend mikroskopische Verschlüsse her, indem Sie eine nicht abgeschrägte, gezogene Kapillarrohr unter einem Winkel unter eine Mikroflamme halten und mithilfe eines Schlauchadapters oder einer gebrochenen Mikropipette das Rohr etwa vier Millimeter von der Spitze entfernt in einem Winkel nahe 120 Grad sanft verbiegen.Bezüglich des Schafts ist es wichtig, dass die Spitze weder in der Flamme versiegelt noch gebrochen wird. Nachdem eine Ratte anästhesiert und das Mesenteriumgewebe sowie der Darm gemäß dem schriftlichen Protokoll präpariert wurden, platzieren Sie das Tierpräparat auf dem Mikroskoptisch, sodass das Mesenterium durch die Okulare sichtbar ist. Positionieren Sie eine Schwerkraftzufuhr mit Ringer-Lösung für Säugetiere, um eine kontinuierliche Überleitungsperfusion durchzuführen.Verwenden Sie dann Mullkompressen, um den Darm an Ort und Stelle zu halten, die Feuchtigkeit zu erhalten und überschüssige Ringer-Lösung von der Oberfläche abzuleiten. Stellen Sie den Fluss ein und aspirieren Sie den Abfluss, um eine konstante Schicht von Suse acht aufrechtzuerhalten. Identifizieren Sie die Ziel-Flar-Mikrogefäße, die unverzweigte Abschnitte stromabwärts von konvergierendem Fluss und eine oder zwei Verzweigungen distal zu echten Kapillaren sind. Wählen Sie ein unverzweigtes Gefäß mit kräftigem Blutfluss und ohne an der Gefäßwand haftende weiße Blutkörperchen. Positionieren Sie die zu testenden Mikrogefäße in der Mitte des Mikroskopfelds und bringen Sie den Halter in der Nähe der gewählten Kanülationsstelle in Position.Um die Mikropipette zu füllen, saugen Sie acht zur Perfusionsflüssigkeit und waschen Sie die Erythrozyten in eine gemäß dem Textprotokoll vorbereitete Spritze. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen im Schlauch befinden. Führen Sie den Schlauch in das große Ende der Mikropipette ein, bis er den konisch zulaufenden Bereich berührt. Üben Sie einen sanften, schnellen Druck auf den Spritzenkolben aus, um die Spitze der Mikropipette zu füllen.Am Ende erscheint ein dünner Strahl oder Tropfen, wenn er voll ist. Während des Herausziehens des Schlauchs den Kolben sanft drücken, um den Mikropipettenschaft zu füllen. Anschließend kleine Luftblasen im Schaft entfernen, indem man vorsichtig dagegen tippt.Bringen Sie dann die Mikropipette in einen Pipettenhalter mit einem Seitenanschluss ein, der eine kontinuierliche Flüssigkeitsverbindung zu einem Wassermanometer ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass der Halter, der an einem hydraulischen Antrieb und einem Mikromanipulator befestigt ist, in einem leichten horizontalen Winkel justiert ist, sodass die Spitze der Mikropipette weder den Darm noch die Schale berührt. Stellen Sie mithilfe einer Spritze oder eines mit Wasser gefüllten Gummiballons den hydrostatischen Druck, der auf die Flüssigkeit in der Mikropipette wirkt, ein, indem Sie die Höhe der Flüssigkeitssäule im Manometer auf etwa 40 Zentimeter Wasser über dem Mesenterium einstellen.Bevor Sie die gefüllte Mikropipette unter dem Mikroskop positionieren, drücken Sie vorsichtig den Halter nahe den Mikrogefäßen auf das Gewebe, wobei ausreichender Druck ausgeübt werden sollte, um das Gewebe zu fixieren. Ziehen Sie den Halter anschließend leicht zurück, um das Gewebe entlang der Mikrogefäße zu dehnen, sodass die Spannungen in den mesenterischen Kollagenfasern mit dem Gefäß ausgerichtet sind. Richten Sie die Mikropipette mit dem Gefäß aus und senken Sie sie so ab, dass sie durch die Okulare sichtbar wird. Platzieren Sie die Spitze direkt vor der gewählten Kanülierungsstelle und senken Sie sie auf das Gewebe ab, sodass der Fluss innerhalb des Gefäßes teilweise behindert, aber nicht vollständig blockiert wird.Verwenden Sie den hydraulischen Antrieb, um das Gefäß zu kanülieren, indem Sie die Pipettenspitze langsam in das Gefäßlumen einführen, wobei darauf geachtet werden muss, die Spitze nicht durch die gegenüberliegende Seite des Gefäßes zu drücken. Wenn die Mikropipette in das Lumen eindringt, spült das Perfusat acht schnell das Blut aus dem Gefäßlumen aus und tritt in den Kreislauf ein. Verringern Sie den Perfusionsdruck durch Einstellen des Manometers, bis sich die roten Blutkörperchen sanft im Gefäßlumen bewegen.Dies bestimmt den Ausgleichsdruck, der den hydrostatischen Druck in den Mikrogefäßen oder PC am distalen Ende des Mikrogefäße-Segments misst. Halten Sie die Gefäßperfusion über diesem Ausgleichsdruck aufrecht, um eine mikroskopische Okklusion durchzuführen. Platzieren Sie den Blocker oberhalb des perfundierten Gefäßes nahe der unteren Kante des Mikroskopfeldes unter Verwendung von Video und Audio.Notieren Sie mündlich die Position der Blockierstelle, wie sie im roten I-Stück zu sehen ist. Die Blockierstelle befindet sich 57, wobei die Spitze des Blockiers gerade oberhalb des Mikrogefäßes platziert wird. Senken Sie den Blockier vorsichtig mit der Fein-Z-Steuerung des Mikromanipulators ab, bis die Durchströmung des Gefäßes unterbunden ist.Verwenden Sie Audio, um den Manometerdruck zu notieren. Der Druck beträgt 50. Anschließend wird für drei bis zehn Sekunden eine Okklusion angewendet und dann wieder freigegeben.Um die freie Perfusion wiederherzustellen, verschieben Sie die Blockierstelle in Fünf- bis Zehnmikronschritten entlang des Gefäßes in Richtung Pipettenspitze und führen Sie an jeder Position nicht mehr als drei bis fünf Okklusionen durch, um Schäden an der Gefäßwand an der Blockierstelle zu vermeiden. Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Diese Zeitreihe misst die Änderungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder LP. Bei einer Ratte wurden ulare Mikrogefäße erfolgreich kaniert mit vier perfundierenden Achteln.Die Größe des LP bei konstantem Druck wurde verwendet, um Veränderungen in Mikrogefäßen zu messen. Die Wandpermeabilität wurde verglichen, wenn mit 1 % BSA als Kontrolle gegenüber 10 molaren Mengen des entzündungsfördernden Wirkstoffs Bradykinin oder BK perfundiert wurde. Wie hier gezeigt, verursachte BK einen vorübergehenden Anstieg des LP-Werts, der innerhalb von 10 bis 15 Minuten auf Kontrollniveau zurückkehrte.Nach Wiederherstellung der Basiswerte mit 1 % BSA 10 Nanomolar wurde BK erneut perfundiert, zusammen mit einem Mikromolar pH-Szenario eins Phosphat oder S eins P. Die Ergebnisse zeigen, dass S eins P die Reaktion auf BK signifikant abschwächte. Für bestimmte experimentelle Ansätze ist es wichtig, sowohl den Lösungsreflexionskoeffizienten für ein Makromolekül als auch das lp abzuschätzen.Dies wird am besten erreicht, indem JV bei mehreren Druckstufen an einzelnen Mikrogefäßen gemessen wird. In diesem Experiment wurden sowohl LP als auch der effektive onkotische Druck von 5 % Albumin im PERFUSE Acht geschätzt, wenn kein Albumin im das Mikrogefäß umgebenden Gewebe vorhanden war. JV bezogen auf S wurde bei drei verschiedenen Druckwerten gemessen und hier dargestellt.Der LP ist die Steigung der Beziehung zwischen JV über S und dem Druck, und der Schnittpunkt mit der Druckachse ist die effektive onkotische Druckdifferenz über die Gefäßwand. In Kombination mit anderen Techniken wie immunfluoreszenzmarkierter Färbung und konfokaler Mikroskopie oder sogar der Transmissions-Elektronenmikroskopie ermöglicht die Mikroperfusion eine leistungsfähige Analyse der mikrovaskulären endothelialen Struktur und Funktion unter Verwendung von Gefäßen mit bekannter Permeabilität. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie wiederholte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder Wasserpermeabilität von mikrovaskulären Gefäßen im Rattenmesenterium unter kontrollierten experimentellen Bedingungen durchgeführt werden.Sie können diesen Ansatz in derzeit verfügbaren Rattenmodellen verwenden, aber ich interessiere mich besonders für die Möglichkeit, ihn in neuen genetisch veränderten Ratten einzusetzen, die mit der CRISPR-Cas9-Technologie verfügbar werden, und ich hoffe, dass er auf diese Weise erweitert wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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