Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, wiederholte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder Wasserpermeabilität der Wände von Ular-Mikrogefäßen im Ratten-Mesenterium unter kontrollierten experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem Ular-Mikrogefäße kaniert werden, um den onkotischen und hydrostatischen Druck im Lumen einzustellen und die chemische Zusammensetzung des Perfusats und des Suspensats exakt zu kontrollieren. Anschließend wird das Gefäß verschlossen, und rote Blutkörperchen, die in dem Perfusat suspendiert sind und als Flussmarker fungieren, können im Lumen als Indikatoren für den transvaskulären Flüssigkeitsaustausch beobachtet werden.

Dann werden die Position und Geschwindigkeit der markierten roten Zellen entweder in Richtung der Okklusionsstelle oder von der Okklusionsstelle weg aufgezeichnet. Schließlich wird die Okklusion gelöst und für zusätzliche Messungen wiederholt, oder das Gefäß wird erneut kanüliert und die Messungen unter veränderten Bedingungen wiederholt.

Schließlich können gepaarte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit unter Kontroll- und Testbedingungen durchgeführt werden, um die direkteste Untersuchung der Faktoren zu ermöglichen, die die Permeabilität von Mikrogefäßen regulieren. Ein Vorteil der modifizierten Landis-Technik zur Untersuchung der Regulation der kapillaren Permeabilität ist der Perfusionschritt. Die Mikroperfusion ermöglicht es, die Permeabilität der Mikrogefäßerwand unter Bedingungen zu messen, bei denen die Zusammensetzung des Perfusats, die Austauschfläche und der Druck in den Mikrogefäßen alle direkt kontrolliert werden.

Diese Methode kann Fragen zu den zellulären und molekularen Mechanismen der Permeabilitätsregulation in Mikrogefäßen beantworten, die für intakte Organe repräsentativ sind, und ermöglicht einen Vergleich mit Ergebnissen aus kultivierten endothelialen Zellschichten, die häufig zur Untersuchung der Details molekularer Mechanismen verwendet werden. Unsere Protokolldemonstration übernimmt Joyce Clark, unsere Laborleiterin. Joyce war während ihrer Zeit als Laborleiterin für viele der Verbesserungen dieses Protokolls verantwortlich.

Verwenden Sie zunächst einen elektronischen Puller, um mehrere saubere Borosilikatglas-Kapillarrohre mit Hilfe einer luftbetriebenen Schleifscheibe und eines 0,5-Mikrometer-Schleifpapiers, das in Wasser getaucht ist, sowie eines Mikropipettenhalters, der in einem Winkel von 30 Grad zur horizontalen Schräge eingestellt ist, zu konischen Hälften zu ziehen – die Mikropipetten. Nach dem Waschen und Trocknen der Mikropipetten gemäß dem schriftlichen Protokoll wählen Sie Mikropipetten mit einer Öffnung von etwa 50 Mikrometern Länge und einem Verhältnis von Schrägenschliff-Länge zu -breite zwischen 3,1 und 3,5 aus. Außerdem sollten sie eine deutlich konisch zulaufende Spitze aufweisen, die das Durchdringen der zähen Kollagenfasern im Mesenterium erleichtert.

Um Halterungen herzustellen, halten Sie eine nicht abgeschrägte, gezogene Glas-Kapillare kurzzeitig nahe einer Mikroflamme, um ein stumpfes Ende zu bilden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mehrere Halterungen anzufertigen, und bewahren Sie diese in einer staubfreien Box auf. Stellen Sie anschließend mikroskopische Verschlüsse her, indem Sie eine nicht abgeschrägte, gezogene Kapillarrohr unter einem Winkel unter eine Mikroflamme halten und mithilfe eines Schlauchadapters oder einer gebrochenen Mikropipette das Rohr etwa vier Millimeter von der Spitze entfernt in einem Winkel nahe 120 Grad sanft verbiegen.

Bezüglich des Schafts ist es wichtig, dass die Spitze weder in der Flamme versiegelt noch gebrochen wird. Nachdem eine Ratte anästhesiert und das Mesenteriumgewebe sowie der Darm gemäß dem schriftlichen Protokoll präpariert wurden, platzieren Sie das Tierpräparat auf dem Mikroskoptisch, sodass das Mesenterium durch die Okulare sichtbar ist. Positionieren Sie eine Schwerkraftzufuhr mit Ringer-Lösung für Säugetiere, um eine kontinuierliche Überleitungsperfusion durchzuführen.

Verwenden Sie dann Mullkompressen, um den Darm an Ort und Stelle zu halten, die Feuchtigkeit zu erhalten und überschüssige Ringer-Lösung von der Oberfläche abzuleiten. Stellen Sie den Fluss ein und aspirieren Sie den Abfluss, um eine konstante Schicht von Suse acht aufrechtzuerhalten. Identifizieren Sie die Ziel-Flar-Mikrogefäße, die unverzweigte Abschnitte stromabwärts von konvergierendem Fluss und eine oder zwei Verzweigungen distal zu echten Kapillaren sind. Wählen Sie ein unverzweigtes Gefäß mit kräftigem Blutfluss und ohne an der Gefäßwand haftende weiße Blutkörperchen. Positionieren Sie die zu testenden Mikrogefäße in der Mitte des Mikroskopfelds und bringen Sie den Halter in der Nähe der gewählten Kanülationsstelle in Position.

Um die Mikropipette zu füllen, saugen Sie acht zur Perfusionsflüssigkeit und waschen Sie die Erythrozyten in eine gemäß dem Textprotokoll vorbereitete Spritze. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen im Schlauch befinden. Führen Sie den Schlauch in das große Ende der Mikropipette ein, bis er den konisch zulaufenden Bereich berührt. Üben Sie einen sanften, schnellen Druck auf den Spritzenkolben aus, um die Spitze der Mikropipette zu füllen.

Am Ende erscheint ein dünner Strahl oder Tropfen, wenn er voll ist. Während des Herausziehens des Schlauchs den Kolben sanft drücken, um den Mikropipettenschaft zu füllen. Anschließend kleine Luftblasen im Schaft entfernen, indem man vorsichtig dagegen tippt.

Bringen Sie dann die Mikropipette in einen Pipettenhalter mit einem Seitenanschluss ein, der eine kontinuierliche Flüssigkeitsverbindung zu einem Wassermanometer ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass der Halter, der an einem hydraulischen Antrieb und einem Mikromanipulator befestigt ist, in einem leichten horizontalen Winkel justiert ist, sodass die Spitze der Mikropipette weder den Darm noch die Schale berührt. Stellen Sie mithilfe einer Spritze oder eines mit Wasser gefüllten Gummiballons den hydrostatischen Druck, der auf die Flüssigkeit in der Mikropipette wirkt, ein, indem Sie die Höhe der Flüssigkeitssäule im Manometer auf etwa 40 Zentimeter Wasser über dem Mesenterium einstellen.

Bevor Sie die gefüllte Mikropipette unter dem Mikroskop positionieren, drücken Sie vorsichtig den Halter nahe den Mikrogefäßen auf das Gewebe, wobei ausreichender Druck ausgeübt werden sollte, um das Gewebe zu fixieren. Ziehen Sie den Halter anschließend leicht zurück, um das Gewebe entlang der Mikrogefäße zu dehnen, sodass die Spannungen in den mesenterischen Kollagenfasern mit dem Gefäß ausgerichtet sind. Richten Sie die Mikropipette mit dem Gefäß aus und senken Sie sie so ab, dass sie durch die Okulare sichtbar wird. Platzieren Sie die Spitze direkt vor der gewählten Kanülierungsstelle und senken Sie sie auf das Gewebe ab, sodass der Fluss innerhalb des Gefäßes teilweise behindert, aber nicht vollständig blockiert wird.

Verwenden Sie den hydraulischen Antrieb, um das Gefäß zu kanülieren, indem Sie die Pipettenspitze langsam in das Gefäßlumen einführen, wobei darauf geachtet werden muss, die Spitze nicht durch die gegenüberliegende Seite des Gefäßes zu drücken. Wenn die Mikropipette in das Lumen eindringt, spült das Perfusat acht schnell das Blut aus dem Gefäßlumen aus und tritt in den Kreislauf ein. Verringern Sie den Perfusionsdruck durch Einstellen des Manometers, bis sich die roten Blutkörperchen sanft im Gefäßlumen bewegen.

Dies bestimmt den Ausgleichsdruck, der den hydrostatischen Druck in den Mikrogefäßen oder PC am distalen Ende des Mikrogefäße-Segments misst. Halten Sie die Gefäßperfusion über diesem Ausgleichsdruck aufrecht, um eine mikroskopische Okklusion durchzuführen. Platzieren Sie den Blocker oberhalb des perfundierten Gefäßes nahe der unteren Kante des Mikroskopfeldes unter Verwendung von Video und Audio.

Notieren Sie mündlich die Position der Blockierstelle, wie sie im roten I-Stück zu sehen ist. Die Blockierstelle befindet sich 57, wobei die Spitze des Blockiers gerade oberhalb des Mikrogefäßes platziert wird. Senken Sie den Blockier vorsichtig mit der Fein-Z-Steuerung des Mikromanipulators ab, bis die Durchströmung des Gefäßes unterbunden ist.

Verwenden Sie Audio, um den Manometerdruck zu notieren. Der Druck beträgt 50. Anschließend wird für drei bis zehn Sekunden eine Okklusion angewendet und dann wieder freigegeben.

Um die freie Perfusion wiederherzustellen, verschieben Sie die Blockierstelle in Fünf- bis Zehnmikronschritten entlang des Gefäßes in Richtung Pipettenspitze und führen Sie an jeder Position nicht mehr als drei bis fünf Okklusionen durch, um Schäden an der Gefäßwand an der Blockierstelle zu vermeiden. Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Diese Zeitreihe misst die Änderungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder LP. Bei einer Ratte wurden ulare Mikrogefäße erfolgreich kaniert mit vier perfundierenden Achteln.

Die Größe des LP bei konstantem Druck wurde verwendet, um Veränderungen in Mikrogefäßen zu messen. Die Wandpermeabilität wurde verglichen, wenn mit 1 % BSA als Kontrolle gegenüber 10 molaren Mengen des entzündungsfördernden Wirkstoffs Bradykinin oder BK perfundiert wurde. Wie hier gezeigt, verursachte BK einen vorübergehenden Anstieg des LP-Werts, der innerhalb von 10 bis 15 Minuten auf Kontrollniveau zurückkehrte.

Nach Wiederherstellung der Basiswerte mit 1 % BSA 10 Nanomolar wurde BK erneut perfundiert, zusammen mit einem Mikromolar pH-Szenario eins Phosphat oder S eins P. Die Ergebnisse zeigen, dass S eins P die Reaktion auf BK signifikant abschwächte. Für bestimmte experimentelle Ansätze ist es wichtig, sowohl den Lösungsreflexionskoeffizienten für ein Makromolekül als auch das lp abzuschätzen.

Dies wird am besten erreicht, indem JV bei mehreren Druckstufen an einzelnen Mikrogefäßen gemessen wird. In diesem Experiment wurden sowohl LP als auch der effektive onkotische Druck von 5 % Albumin im PERFUSE Acht geschätzt, wenn kein Albumin im das Mikrogefäß umgebenden Gewebe vorhanden war. JV bezogen auf S wurde bei drei verschiedenen Druckwerten gemessen und hier dargestellt.

Der LP ist die Steigung der Beziehung zwischen JV über S und dem Druck, und der Schnittpunkt mit der Druckachse ist die effektive onkotische Druckdifferenz über die Gefäßwand. In Kombination mit anderen Techniken wie immunfluoreszenzmarkierter Färbung und konfokaler Mikroskopie oder sogar der Transmissions-Elektronenmikroskopie ermöglicht die Mikroperfusion eine leistungsfähige Analyse der mikrovaskulären endothelialen Struktur und Funktion unter Verwendung von Gefäßen mit bekannter Permeabilität. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie wiederholte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder Wasserpermeabilität von mikrovaskulären Gefäßen im Rattenmesenterium unter kontrollierten experimentellen Bedingungen durchgeführt werden.

Sie können diesen Ansatz in derzeit verfügbaren Rattenmodellen verwenden, aber ich interessiere mich besonders für die Möglichkeit, ihn in neuen genetisch veränderten Ratten einzusetzen, die mit der CRISPR-Cas9-Technologie verfügbar werden, und ich hoffe, dass er auf diese Weise erweitert wird.