VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die klonale Zusammensetzung von Lymphomproben zu charakterisieren, um Muster der klonalen Evolution bei Lymphomrezidiven zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Lymphoms zu beantworten, beispielsweise wie rezidivierende Tumore aus den ursprünglichen Tumoren hervorgehen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es die neueste Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie nutzt, um eine umfassendere Kartierung gemeinsamer Merkmale von Lymphomen zu ermöglichen.

In diesem Protokoll wird DNA aus dünnen Schnitten von gefrorenen, in OCT eingebetteten sowie aus formal- und fixiert-paraffin-eingebetteten normalen oder malignen Geweben gewonnen, um DNA aus gefrorenen, in OCT eingebetteten Geweben zu isolieren. Verdauen Sie zunächst 10 bis 30 dünne Schnitte in vier Milliliter Nukleinsäure-Lysepuffer mit Protease K und 0,625 % SDS über Nacht in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag fügen Sie ein Milliliter gesättigte fünfmolare Natriumchloridlösung zur Verdauungsmischung hinzu, schütteln kräftig für 15 Sekunden und zentrifugieren bei 1.100 × g für 15 Minuten.

Überführen Sie bei Raumtemperatur das Überstandsvolumen in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie zwei Volumina 100%igen Ethanol hinzu und mischen Sie durch sechsmaliges bis achtmaliges Vorsichtig-Invertieren des Röhrchens. Zentrifugieren Sie 60 Minuten bei 5.000 × g und 4 °C. Um die präzipitierte DNA zu gewinnen, waschen Sie den DNA-Pellet zweimal mit 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie jedes Mal 15 Minuten bei 5.000 × g.

Um das Pellet zu gewinnen, lösen Sie das DNA-Pellet über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Rüttler in 100 bis 400 Mikroliter TE-Puffer auf, um DNA aus dünnen Schnitten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebes zu extrahieren. Entfernen Sie zunächst das Paraffin, indem Sie die Paraffinschnitte zweimal je 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem Milliliter Xylol inkubieren. Sammeln Sie die Gewebeschnitte durch Zentrifugation bei 13.000 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Als Nächstes entfernen Sie die Reste von Elenes, indem Sie die Schnitte zweimal mit je einem Milliliter 100 % Ethanol bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten inkubieren. Sammeln Sie die Gewebeschnitte durch Zentrifugation bei 13.000 × g für fünf Minuten. Trocknen Sie die Schnitte bei Raumtemperatur lufttrocken für 10 bis 15 Minuten.

Fügen Sie eine frisch zubereitete Protease-Case-Lösung zu den Proben in einem Endvolumen von 50 bis 100 Mikrolitern hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius am folgenden Tag. Erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um die Proteinase zu inaktivieren. K. Die DNA-Ausbeute aus den im vorherigen Abschnitt demonstrierten Extraktionen beträgt je nach Größe des Gewebes fünf bis 200 Mikrogramm.

Der nächste Schritt besteht darin, die Qualität jeder DNA-Probe in einer PCR-Röhrchen-Mischung zu überprüfen. Geben Sie 25 Mikroliter TDNA-Polymerase mit 45 Mikrolitern Master-Mix aus einem kommerziellen Ladder-Kit hinzu. Fügen Sie fünf Mikroliter DNA in das PCR-Röhrchen ein und mischen Sie gründlich, indem Sie mindestens fünfmal auf- und abpipettieren.

Verstärken Sie die DNA unter den in dem Protokolltext beschriebenen Bedingungen. Anschließend mischen Sie 20 µL der PCR-Reaktion mit vier µL Sechs-x-Ladefarbstoff und geben Sie die Probe auf ein 2 %iges Agarosegel. Nach Beendigung der Elektrophorese färben Sie das Agarosegel mit Ethidiumbromid und detektieren die PCR-Produkte.

Mit einem Gel-Imaging-System werden die Proben, die fünf PCR-Produkte mit Größen von 100, 200, 300, 400 und 600 Basenpaaren liefern, ausschließlich zur Erzeugung von VDJ-Amplicons verwendet. In diesem Video wird die Amplifikation des rekombinierten I-G-H-V-D-J-Segments aus der Framework-Region eins beziehungsweise IGV HFR eins demonstriert. Die Amplifikation des rekombinierten I-G-H-B-D-J-Segments aus der Framework-Region zwei folgt einem ähnlichen Verfahren und ist im Protokolltext in einer PCR-Röhrchenmischung beschrieben.

45 Mikroliter Master-Mix aus der als „Mix zwei“ eines kommerziellen somatischen IGH-HYPERMUTATION-Assays zur Gel-Detektion gekennzeichneten Röhrchen, 25 Mikroliter TAC-DNA-Polymerase und 5 Mikroliter Probendesoxiribonukleinsäure (DNA) hinzufügen, um die DNA unter den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen zu amplifizieren. Um suboptimale DNA-PCR-Bedingungen zu verbessern, kann die Verweilzeit verlängert oder die Anzahl der Amplifikationszyklen erhöht werden. Trennen Sie die gesamten PCR-Produkte mittels Elektrophorese in einem 2 %igen Agarose-Gel. Färben Sie das Agarose-Gel mit einer Lösung von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid und detektieren Sie die PCR-Produkte.

Mit einem Gel-Imaging-System wird ein monoklonaler Amplifikationsprodukt in der Größenordnung von 310 bis 380 Basenpaaren erwartet. Schneiden Sie den Gelabschnitt mit dem monoklonalen Amplifikationsprodukt aus. Reinigen Sie anschließend die DNA aus dem ausgeschnittenen Gelabschnitt mithilfe eines Standard-Gel-Extraktionskits gemäß der Herstelleranweisung.

Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie das gereinigte V-D-J-P-C-R-Produkt in ein PCR-Gefäß und geben Sie den Resus-Aufschwemmungspuffer aus dem DNA-Probenpräparationskit hinzu, um das Volumen auf 60 Mikroliter aufzufüllen. Geben Sie 40 Mikroliter Endreparatur-Mix aus dem DNA-Probenpräparationskit hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten bei 30 Grad Celsius in einem vorgewärmten Thermocycler mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 Grad Celsius. Als Nächstes mischen Sie 136 Mikroliter magnetische Partikel und 24 Mikroliter PCR-Reinstwasser in einem 1,5-Milliliter-Gefäß und überführen Sie die gesamte Endreparatur-Reaktion in das Gefäß. Mischen Sie gut mit der Partikellösung.

Stellen Sie die Röhrchen zwei Minuten lang auf einen Magnethalter, um die Trennung der Kügelchen von der Lösung zu ermöglichen. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit frisch hergestelltem 80%igen Ethanol. Entfernen Sie die Ethanol-Lösung vollständig und lassen Sie die Kügelchen 15 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

Nach 15 Minuten die Röhrchen vom Magnethalter nehmen und die Perlen in 17,5 µL Resus-Suspensionspuffer resuspendieren. Die Röhrchen für zwei Minuten wieder auf den Magnethalter stellen, um die Perlen vom Resus-Suspensionspuffer zu trennen. Den Resus-Suspensionspuffer, der nun das Endreparaturprodukt enthält, in ein sauberes PCR-Röhrchen überführen.

Der nächste Schritt besteht darin, einen A-Schwanz zum Endreparaturprodukt hinzuzufügen. Geben Sie 12,5 µL der A-Schwanz-Mischung in das PCR-Röhrchen, das das Endreparaturprodukt enthält, und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie die PCR-Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 °C in einem vorgewärmten Thermocycler mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 °C.

Für die Adapterligation 2,5 µL Resus-Suspensionspuffer, 2,5 µL Ligationsmix und 2,5 µL DNA-Adapterindex zu der A-Tailing-Reaktion hinzufügen. Die Reaktion 30 Minuten lang bei 30 °C in einem vorgewärmten Thermocycler mit einer vorgewärmten Deckeltemperatur von 100 °C inkubieren. Nach 30 Minuten jeweils 5 µL Stopp-Ligationspuffer zu jeder Reaktion hinzufügen und gründlich mischen.

Geben Sie 42,5 µL gut gemischte magnetische Kügelchen zu jeder Reaktion hinzu und waschen Sie diese mit 80 % Ethanol, wie zuvor gezeigt. Geben Sie 50 µL Resus-Aufschlämmungspuffer hinzu, um das Adapter-ligiertes Produkt zu eluieren. Reinigen Sie das Adapter-ligiertes Produkt ein zweites Mal unter Verwendung von 50 µL gut gemischten Ampu-XP-Kügelchen und eluieren Sie das Produkt in 25 µL Resus-Aufschlämmungspuffer in ein sauberes PCR-Röhrchen.

Um das VDJ-Amplicon zu amplifizieren, geben Sie fünf Mikroliter PCR-Primer-Cocktail und 25 Mikroliter PCR-Master-Mix in die PCR-Röhrchen, die das adapterligierte Produkt enthalten, und mischen Sie gründlich. Führen Sie die Amplifikation in einem Thermocycler unter den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen durch. Sobald die Amplifikation abgeschlossen ist, reinigen Sie die Reaktion mit 50 Mikrolitern gut gemischten magnetischen Bärtchen und eluieren das Endprodukt in 30 Mikrolitern Resus-Puffer. Die VTJ-Amplicon-Bibliothek wird anschließend wie im Protokolltext beschrieben validiert, gepoolt und sequenziert.

Da die Komplexität der VVG-Sequenzierbibliothek gering ist, empfehlen wir, 20 bis 50 % FI-Spiking in zugelassenen Sequenzierproben hinzuzufügen, um eine genaue Basenaufrufung zu ermöglichen. Diese repräsentativen Gelelektrophoresebilder zeigen V-D-J-P-C-R-Ampliconprodukte aus aus Lymphompatientenproben extrahierter DNA. Die Qualität des V-D-J-P-C-R-Amplicons vor und nach der Bibliotheksherstellung wurde mittels eines Bioanalyzer beurteilt.

Die Größenverschiebung von 334 Basenpaaren auf 459 Basenpaaren weist auf die Hinzufügung des Adapters hin, um die klonale Evolution eines Rezidivfalls eines diffusen großzelligen B-Zell-Lymphoms nachzuverfolgen. Die phylogenetische Analyse der somatischen Hypermutation oder SHM-Profile der majoren schweren Ketten-VDJ-Umlagerungen zwischen den Proben zur Diagnosezeit und zum Rezidivzeitpunkt wurde durchgeführt.

Der späte divergente klonale Evolutionsmodus wurde beobachtet. Es wurden neue grafische Methoden zur Visualisierung der klonalen Evolution entwickelt. Die dargestellten Muster sind Mehrdimensionale-Skalierungs-Diagramme eines spät divergenten und eines früh divergenten Rezidivmodells.

Der Radius jedes Kreises zeigt die Anzahl der Teilklone an, die einem bestimmten SHM-Profil entsprechen. Blau steht für die Diagnoseprobe, rot für die Rezidivprobe. Ebenso weicht die Verteilung der Teilklonanzahlen im Fall später Divergenz von der frühen Divergenz ab, wie die ungerichteten Graphen zeigen.

Die Kanten entsprechen zwei SHM-Profilen mit einem String-Abstand von einem Buchstaben und die Farbskala zeigt den Anteil der Sequenzen an, die einem bestimmten SHM-Profil zugeordnet werden, entsprechend der roten Diagnoseprobe oder der gelben Rezidivprobe. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Qualität von Lymphomtumorproben beurteilt werden kann.

Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um das Restmineralerkrankungsniveau zu verfolgen und die Immunüberwachungsreaktion auf Krebserkrankungen zu untersuchen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.