VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die klonale Zusammensetzung von Lymphomproben zu charakterisieren, um klonale Evolutionsmuster des Lymphomrezidivs zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet des Lymphoms zu beantworten, z. B. wie rezidivierte Tumoren aus den ursprünglichen Tumoren hervorgehen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die neueste Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie anpasst, um eine umfassendere Kartierung der Gemeinsamkeiten von Lymphomen zu ermöglichen.

In diesem Protokoll wird DNA aus Dünnschnitten von gefrorenem OCT-eingebettetem sowie formalem und fixiertem, in Paraffin eingebettetem normalem oder bösartigem Gewebe extrahiert, um DNA aus gefrorenem OCT-eingebettetem Gewebe zu extrahieren. Zuerst werden 10 bis 30 Dünnschliffe in vier Millilitern Nukleinlysepuffer mit Protase K und 0,625 % SDS in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad über Nacht verdaut. Am folgenden Tag fügen Sie der Aufschlussmischung einen Milliliter gesättigtes fünfmolares Natriumchlorid hinzu und schütteln Sie es 15 Sekunden lang kräftig, zentrifugieren Sie es 15 Minuten lang bei 1.100 mal G.

Bei Raumtemperatur wird das Supinat in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Fügen Sie zwei Volumina 100%iges Ethanol hinzu und fügen Sie die Mischung hinzu, indem Sie das Röhrchen sechs- bis achtmal umdrehen und 60 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 5.000 mal G zentrifugieren. Um die ausgefällte DNA zu sammeln, waschen Sie das DNA-Pellet zweimal mit einer 70%igen Ethanolzentrifuge bei 5.000 mal G für jeweils 15 Minuten.

Um das Pellet zu sammeln, lösen Sie das DNA-Pellet über Nacht in 100 bis 400 Mikrolitern TE-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttler auf, um DNA aus dünnen Schnitten von forminfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe zu extrahieren. Zuerst wird die Paraffinabschnitte zweimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem Milliliter Xylol inkubiert. Sammeln Sie die Gewebeschnitte, indem Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.000 G drehen.

Entfernen Sie anschließend Elenenreste, indem Sie die Abschnitte zweimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem Milliliter 100%iges Ethanol inkubieren. Sammeln Sie die Gewebeschnitte, indem Sie sie fünf Minuten lang mit dem 13.000-fachen G drehen. Bei Raumtemperatur trocknen Sie die Abschnitte 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.

Geben Sie den Proben eine frisch zubereitete Protease-Falllösung in einem Endvolumen von 50 bis 100 Mikrolitern und inkubieren Sie am Folgetag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um die Proteinase zu inaktivieren. Die DNA-Ausbeute aus den im vorherigen Segment gezeigten Extraktionen beträgt je nach Größe des Gewebes fünf bis 200 Mikrogramm.

Der nächste Schritt besteht darin, die Qualität jeder DNA-Probe in einer PCR-Röhrchenmischung zu beurteilen. Punkt: 25 Mikroliter TDNA-Polymerase mit 45 Mikrolitern Mastermix aus einem handelsüblichen Leiterkit. Geben Sie fünf Mikroliter DNA in das PCR-Röhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie mindestens fünfmal auf und ab pipettieren.

Amplifizieren Sie die DNA gemäß den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen. Mischen Sie als Nächstes 20 Mikroliter der PCR-Reaktion mit vier Mikrolitern sechsfachem Ladefarbstoff und laden Sie es auf ein 2%aros-Gel. Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, färben Sie das AGROS-Gel mit Ethereumbromid und weisen Sie die PCR-Produkte nach.

Mit einem Gel-Imaging-System werden die Proben, die fünf PCR-Produkte in den Größen 100, 200, 300, 400 und 600 Basenpaare ergeben, nur zur Erzeugung von VDJ-Amplikons verwendet. In diesem Video wird die Verstärkung des rekombinierten I-G-H-V-D-J-Segments aus der Gerüstregion eins oder IGV HFR eins demonstriert. Die Amplifikation des rekombinierten I-G-H-B-D-J-Segments aus der Gerüstregion zwei folgt einem ähnlichen Verfahren und wird im Protokolltext in einem PCR-Röhrchen-Mix beschrieben.

45 Mikroliter Mastermix aus der mit Tube beschrifteten Mischung, zwei eines kommerziellen somatischen IGH-HYPERMUTATION-Assays für den Gel-Nachweiskit-Punkt, 25 Mikroliter TAC-DNA-Polymerase und fünf Mikroliter Proben-DNA amplifizieren die DNA gemäß den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen: Zur Amplifikation suboptimaler D-N-A-P-C-R-Bedingungen können durch Verlängern einer Kniezeit oder Erhöhen des Amplifikationszyklus angepasst werden. Zahlen. Lösen Sie die gesamten PCR-Produkte durch Elektrophorese und eine 2%ige AGROS-Gelfärbung auf. Das AGROS Gel mit einer 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethereum-Bromid-Lösung und dem Nachweis von PCR-Produkten.

Mit einem Gel-Imaging-System wird ein monoklonales Amplikon mit einem Größenbereich von 310 bis 380 Basenpaaren erwartet. Exzitieren Sie den Gelteil, der das monoklonale Amplikon enthält. Anschließend reinigen Sie die DNA von der Verbrauchsteuer zu einem Gel mit einem Standard-Gelextraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Um dieses Verfahren zu starten, überführen Sie das gereinigte V-D-J-P-C-R-Produkt in ein PCR-Röhrchen und fügen Sie den Resus-Suspensionspuffer aus dem DNA-Probenvorbereitungskit hinzu, um das Volumen auf 60 Mikroliter zu erhöhen. Fügen Sie 40 Mikroliter Endreparaturmischung aus dem DNA-Probenvorbereitungskit hinzu und mischen Sie die Reaktion gründlich, inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius in einem vorgeheizten Thermocycler mit vorgeheiztem Deckel bei 100 Grad Celsius. Mischen Sie anschließend 136 Mikroliter magnetische Kügelchen und 24 Mikroliter Wasser in PCR-Qualität in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, übertragen Sie die gesamte Endreparaturreaktion in das Röhrchen und mischen Sie es gut mit der Bead-Lösung.

Legen Sie die Röhrchen für zwei Minuten auf einen Magnetständer, damit sich die Kügelchen von der Lösung trennen können. Aspirieren Sie das Supnatant und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit frisch zubereitetem 80%igem Ethanol. Saugen Sie die Ethanollösung vollständig an und lassen Sie die Kügelchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

Nehmen Sie nach 15 Minuten die Röhrchen vom Magnetständer und suspendieren Sie die Kügelchen in 17,5 Mikrolitern Resus Suspension Buffer. Legen Sie die Röhrchen für zwei Minuten wieder auf den Magnetständer, um die Kügelchen vom Resus-Suspensionspuffer zu trennen. Übertragen Sie den Resus-Suspensionspuffer, der nun das Endreparaturprodukt enthält, in ein sauberes PCR-Röhrchen.

Der nächste Schritt besteht darin, dem Endreparaturprodukt ein Heck hinzuzufügen. Geben Sie 12,5 Mikroliter der Tailing-Mischung in das PCR-Röhrchen mit dem Endreparaturprodukt und mischen Sie es gründlich. Inkubieren Sie die PCR-Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem vorgeheizten Thermocycler mit vorgewärmtem Deckel bei 100 Grad Celsius.

Für die Adapterligation geben Sie 2,5 Mikroliter Resus-Suspensionspuffer, 2,5 Mikroliter Ligationsmischung und 2,5 Mikroliter DNA-Adapterindex in die A-Tailing-Reaktion. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius und einen vorgeheizten Thermocycler mit vorgeheiztem Deckel bei 100 Grad Celsius. Nach 30 Minuten fügen Sie fünf Mikroliter Stop-Ligationspuffer in jede Reaktion hinzu und mischen Sie gründlich.

Fügen Sie jeder Reaktion 42,5 Mikroliter gut gemischte magnetische Kügelchen hinzu und waschen Sie sie mit 80 % Ethanol, wie zuvor gezeigt. Fügen Sie 50 Mikroliter Resus-Suspensionspuffer hinzu, um das adapterligierte Produkt zu eluieren. Reinigen Sie das ligierte Adapterprodukt ein zweites Mal, indem Sie 50 Mikroliter gut gemischte ampu XP Kügelchen verwenden und das Produkt in 25 Mikrolitern Resus Suspension Buffer in ein sauberes PCR-Röhrchen eluieren.

Um das VDJ Amplicon zu amplifizieren, geben Sie fünf Mikroliter PCR-Primer-Cocktail und 25 Mikroliter PCR-Mastermix in das PCR-Röhrchen, das das ligierte Adapterprodukt enthält, und mischen Sie gründlich, führen Sie die Amplifikation in einem Thermocycler unter den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen durch. Wenn die Amplifikation abgeschlossen ist, reinigen Sie die Reaktion mit 50 Mikrolitern gut gemischter magnetischer Beads und eluieren Sie das Endprodukt in 30 Mikrolitern Resus-Puffer. Die VTJ Amplicon-Bibliothek wird anschließend validiert, gepoolt und sequenziert, wie im Protokolltext beschrieben.

Da die Komplexität der VVG-Sequenzierungsbibliothek gering ist, empfehlen wir, in zugelassenen Sequenzierungsproben eine FI-Spezifikation von 20 bis 50 % hinzuzufügen, um einen genauen basierten Aufruf zu ermöglichen. Diese repräsentativen Gelbilder zeigen V-D-J-P-C-R Amplikon-Produkte aus DNA, die aus Lymphom-Patientenproben extrahiert wurde. Die Qualität des V-D-J-P-C-R-Amplikons vor und nach dem Bibliotheksaufbau wurde mit einem Bioanalysator bewertet.

Die Größenverschiebung von 334 Basenpaaren auf 459 Basenpaare deutet auf die Hinzufügung des Adapters hin, um die klonale Evolution eines diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom-Rezidivfalls zu verfolgen. Phylogenetische Analyse der somatischen Hypermutation oder SHM-Profile der wichtigsten VDJ-Umlagerungen in schweren Ketten. Zwischen der Diagnose und dem Rückfall wurden Proben durchgeführt.

Es wurde der spätdivergente klonale Evolutionsmodus beobachtet. Es wurden neue grafische Methoden entwickelt, um die klonale Evolution sichtbar zu machen. Die gezeigten Muster sind mehrdimensionale Skalierungsdiagramme eines spätdivergenten und eines frühen divergenten Rezidivmodells.

Der Radius jedes Kreises gibt die Anzahl der Sub-Klone an, die einem bestimmten SHM-Profil entsprechen. Blau entspricht der Diagnosestichprobe und Rot der Rückfallstichprobe. Ebenso zeigen ungerichtete Diagramme, dass die Verteilung der Sub-Klon-Zählungen im späten divergenten Fall von der des frühen divergenten Falls abweicht.

Die Kanten entsprechen zwei SHM-Profilen mit einem Zeichenfolgenabstand von einem Buchstaben und die Farbskala zeigt den Anteil der Sequenzen an, die einem bestimmten SHM-Profil zugeordnet sind, das der roten Diagnoseprobe oder der gelben Rezidivprobe entspricht. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Effektivität von Lymphomtumorproben beurteilen können.

Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um mineralische Resterkrankungen zu verfolgen und die Immunüberwachungsreaktion auf Krebs zu untersuchen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.