Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die auf Mikroplatten basierende Sauerstoffverbrauchstechnologie zu verwenden, um die Funktion der Elektronentransportkette, des Beta-Oxidationswegs des TCA-Zyklus und der Substrattransporter zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Substrat und die Injektionslösungen für den Assay vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Injektionslösungen in eine zuvor hydratisierte Tric-Assay-Kartusche zu geben, um das Sauerstoffverbrauchsgerät zu kalibrieren.

Bereiten Sie als Nächstes die mitochondrialen Substratlösungen vor und laden Sie diese Lösungen in die Zellkulturplatte. Drehen Sie die Zellkulturplatte, um eine mitochondriale Adhärenz an der Platte zu ermöglichen, bevor Sie die Platte in den metrischen Respira-Assay einlegen. Es werden Instrumentenergebnisse erhalten, die die Sauerstoffverbrauchsraten basierend auf der mitochondrialen Atmung für jeden respirometrischen Assay anzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Clark-Elektrode besteht darin, dass Mikrotiterplatten-basierte Technologien eine effizientere und höhere Durchsatzerfassung des Sauerstoffverbrauchs mit kleineren Mengen an Mitochondrien ermöglichen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da all die beweglichen Teile an der Vorbereitung der Lösungen für den Assay beteiligt sind. In der Nacht vor dem Experiment Hydrate tric Assay-Kartusche in einem Milliliter Kalibrierlösung in einem nicht CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius Am Folgetag alle gefrorenen Stiele herausnehmen und in einem 37 Grad Celsius warmen Bad oder Inkubator auftauen. Bereiten Sie alle Substratlösungen und Injektionslösungen vor und lagern Sie sie auf Eis. Der nächste Schritt besteht darin, das Multiwell-Sauerstoffverbrauchsmessgerät auf das richtige Mischgewicht und die richtigen Messparameter zu programmieren.

Rufen Sie die Analysesoftware auf und wählen Sie den Standardmodus. Treten Sie in das Seepferdchen-Gastforum ein und klicken Sie auf den Assay-Assistenten. Klicken Sie im Assay-Assistenten auf Protokoll, um das Mischgewicht und die Messparameter zu ändern.

Beschriften Sie die Hintergrundfelder unter der Registerkarte "Rückkorrektur", und markieren Sie sie. Führen Sie eine Hintergrundkorrektur durch. Beschriften Sie die Bedingungen, indem Sie zuerst auf die Registerkarte Gruppen und Beschriftungen klicken, gefolgt von der Registerkarte Gruppeninformationen.

Nachdem Sie diese Parameter eingegeben haben, klicken Sie auf Ende und dann auf Vorlage speichern. Um dieses Verfahren zu starten, laden Sie die Injektionslösungen in eine Assay-Run-Kartusche. Achten Sie darauf, die Lösungen in die richtigen Öffnungen zu injizieren.

Legen Sie die Assay-Run-Kartusche mit einer gekerbten Ecke unten links in das Gerät ein. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie zuerst die Analysesoftware aufrufen und dann in den Standardmodus wechseln. Treten Sie in das Seepferdchen-Gästeforum ein.

Öffnen Sie die gespeicherte Vorlage unter dem XF Drive auf der Registerkarte Vorlagen. Klicken Sie nach dem Öffnen auf Start, um die Kalibrierung zu starten, die etwa 30 Minuten dauern wird. Die Mitochondrien für dieses Verfahren wurden aus rotem Skelettmuskel isoliert, das Mitochondriensubstrat durch sanftes Rühren sanft gemischt, wobei die Lösung mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, deren Ende etwa drei Millimeter abgeschnitten wurde, vorsichtig und iteriert wurde.

Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration des mitochondrialen Stammes werden 10 Mikrogramm mitochondriales Protein pro 200 Mikroliter des bekannten Succinatfäule-Substratmixes suspendiert. Mischen Sie die Mitochondriensubstratlösung vorsichtig, aber gründlich durch sanftes Rühren und tieren Sie die Lösung mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, deren Ende auf die gleiche Weise etwa drei Millimeter abgeschnitten wurde. Reeses Band, 14 Mikrogramm mitochondriales Protein pro 200 Mikroliter jeder der verbleibenden Substratmischungen legen alle mitochondrialen Proteinsubstratmischungen auf Eis.

Legen Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte auf Eis und laden Sie in dreifacher Ausfertigung 50 Mikroliter pro Well jeder der Mitochondrien-Substratmischungen. Die Entwickler des Mikrotiterplatten-basierten Tric-Assays empfehlen, mindestens zwei leere Vertiefungen ohne Mitochondrien zu belassen, vorzugsweise auf beiden Seiten der Zellkulturplatte. Drehen Sie die Zellkulturplatte bei 2000 g für 2000 g bei vier Grad Celsius, um die Mitochondrien an den Vertiefungen zu haften, während sich die Platte dreht.

Erwärmen Sie die Substratlösungen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Nachdem das Schleudern abgeschlossen ist, laden Sie vorsichtig 450 Mikroliter jeder Substratlösung auf die jeweiligen Vertiefungen. Achten Sie darauf, die Platte bei Raumtemperatur zu beladen.

Laden Sie die Blank-Wells mit 500 Mikrolitern Substratrohling. Vertiefungen, die für den Elektronenfluss-Assay bestimmt sind, sollten mit dem Elektronenflusssubstrat beladen werden, während die gekoppelten Assay-Blank-Wells mit jedem Kopplungs-Assay-Substrat geladen werden können. Nachdem jeweils 450 Mikroliter Substrat hinzugefügt wurden, betrachten Sie die Mitochondrienschicht in der Vertiefung bei 20-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die Mitochondrien gleichmäßig in einer einzigen Monoschicht verteilt sind.

Wie in diesem Beispiel gezeigt, können Bildfelder, die keine gleichmäßig verteilte Monoschicht zu haben scheinen, nach dem OC entfernt werden. Nachdem Sie die mitochondriale Adhärenz bestätigt haben, bringen Sie die Zellkulturplatte zum metrischen Respir-Assay-Instrument. Klicken Sie auf OK.

Das Gerät wirft die Utility-Platte aus, die zuvor für die Kalibrierung verwendet wurde. Entfernen Sie die Versorgungsplatte und legen Sie die Zellkulturplatte, die die Mitochondrien enthält, auf das Tablett. Die blaue Kerbe auf der Zellkulturplatte sollte in der unteren linken Ecke des Tabletts platziert werden.

Klicken Sie auf Weiter, um den Assay-Lauf zu starten, der etwa 40 Minuten dauert. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, drücken Sie auf dem Bildschirm auf Auswerfen, um die Zellkulturplatte auszuwerfen. Sobald die Platte ausgeworfen ist, entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturplatte und die Kartusche.

Klicken Sie auf dem Bildschirm auf Weiter. Der Lauf wird automatisch als XLS-Datei in der Datendatei gespeichert. Öffnen Sie diese Datei und ändern Sie die Anzeige von O2 auf OCR, indem Sie auf den Abwärtspfeil unter der Y-Eins-Markierung klicken.

Ändern Sie als Nächstes den Mittelpunkt in Punkt-zu-Punkt-Sätze unter den als Option angezeigten Kursdaten. Klicken Sie auf OK. Um diese Änderungen zu übernehmen, klicken Sie unten links auf dem Bildschirm auf die Registerkarte Well-Gruppenmodus, um Wells mit ähnlichen Bedingungen zu gruppieren.

Klicken Sie abschließend auf die Registerkarte für den mittleren Standardfehler in der Mitte des Bildschirms auf der linken Seite. Diese Befehle können auch vor dem Assay eingerichtet werden. Diese Tracings stellen die Sauerstoffverbrauchsraten oder OCR über der Zeit für vier Kupplungsassays dar.

Das erste Feld stellt den zweiten Zustand dar, die Atmung oder die Atmung in Abwesenheit eines DP. Das zweite Panel nach der Injektion von A DP stellt die maximale gekoppelte Atmung dar, die auch als Atmung des dritten Zustands bezeichnet wird. Das dritte Panel nach der Injektion von Oligomycin. A steht für die Atmung aufgrund eines Protonenlecks, auch Zustand vier oh Atmung genannt.

Das vierte Panel nach der Injektion von FCCP repräsentiert die maximale ungekoppelte Atmung, auch Atmung des Zustands drei U genannt. Das fünfte Panel nach der Injektion von Antimycin A stellt die Hemmung der oxidativen Atmung dar. Alle mitochondrialen Zustände weisen eine minimale Standardabweichung auf, was auf eine gründliche Durchmischung des Mitochondrienbestands und der Substratmischungen der Mitochondrien und das Erreichen einer einzigen Monoschicht von Mitochondrien nach dem Adhärenzspin

Im Gegensatz dazu führt das Laden ungleicher Mitochondrien in jeder Vertiefung und das Erreichen einer einzigen Monoschicht von Mitochondrien zu einer erhöhten Standardabweichung in jedem Zustand, wie durch die blaue Spur angezeigt, die OCR-Werte über 1.500 ole pro Minute zeigt, sowie zu abnehmenden Atemfrequenzen im Laufe des Messzeitraums, was durch den Abfall der Punkt-zu-Punkt-Ratenwerte veranschaulicht wird. Beachten Sie, dass die rote Ablaufverfolgung konsistente Punkt-zu-Punkt-Raten anzeigt und die maximalen OCR-Werte unter 1.500 ole pro Minute liegen. Eine Überladung mit mitochondrialen Proteinen kann auch zur Erschöpfung des Sauerstoffs in der Mikrokammer des Wells führen, wodurch eine genaue Messung der OCR für jede aufeinanderfolgende Messung verhindert wird, wie durch die blaue Spur angezeigt, die O2-Werte zeigt, die sich während des Messzeitraums dem Nullpunkt nähern, sowie signifikant reduzierte Ausgangs-O2-Werte nach jeder aufeinanderfolgenden Messung.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, beim Mischen der Mitochondrien und der Substratlösungen an Patienten zu denken. Sobald diese Methoden beherrscht sind, können zusätzliche Experimente verformt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Wie beeinflusst die medikamentöse Behandlung eines bestimmten Substrattransporters den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch?