Name: Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mitochondriale Atmung aus Maus-Skelettmuskel mit Hochdurchsatz-Mikroplatten-Technologie messen. Diese Methode ermöglicht effiziente Sauerstoffverbrauchsanalysen bei minimalem Probenmaterial.

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Das Fralin Life Science Research Institute und das Metabolic Phenotyping Core an der Virginia Tech unterstützten diese Arbeit.

Hinweis: Dieses Protokoll beginnt, nachdem man Mitochondrien aus roten Skelettmuskel isoliert. Mitochondrien wurden isoliert, wie zuvor von ~ 75 beschrieben - 100 mg rote Skelettmuskel 13. Zwischen 5-10 ug / ul der mitochondrialen Protein aus dieser Menge an Gewebe durch Resuspendieren des endgültigen mitochondriale Pellet in ≤50 ul Isolationspuffer für Mitochondrien (IBM) 2 (Siehe Frisard et al 13) erreicht werden. 1. Setup- <ol><li> Bereiten Sie Arbeitsstammlösungen (Tabelle 1) und mitochondriale Assay-Lösung (MAS) Mischungen (Tabelle 2) für nachfolgende Tests. Hinweis: Die meisten der Vorbereitung auf die Tests können im Voraus erfolgen, da die meisten Aktien-Lösungen und MAS gespeichert werden können, werden. </li><li> Die Nacht hydratisieren eine respirometrischen Analysenkartusche in 1 ml Kalibrierungslösung vor dem Experiment in einem nicht-CO 2 Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Der Tag des Experiments, take aus gefrorenen Beständen (Substrate und mitochondriale Modulatoren, MAS-Mix, MAS W / O-BSA, Tabelle 1) und Tauwetter in 37ºC Bad oder Inkubator. </li><li> Bereiten Sie alle Substratlösungen (Tabelle 3) und Injektionen (Tabelle 4-5) und stellen pH nach Wunsch (pH 7,4). Nachdem der pH-Wert eingestellt, gespeichert auf Eis. </li><li> Programmieren Sie die Multi-Well-Sauerstoffverbrauch Messmaschine die richtige Mischung, warten, und messen Parameter (siehe Tabelle 6) und Label Hintergrund und Gruppe / Zustand Vertiefungen durch Eingabe der ersten Analyse-Software, gefolgt von dem Modus &quot;Standard&quot;. <ol><li> Geben Sie in das &quot;Gast&quot; Forums und klicken Sie auf die &quot;Test-Assistent&quot;. Einmal in der &quot;Test-Assistent&quot;, klicken Sie auf &quot;Protokoll&quot;, um Mischung zu ändern, warten Sie, und messen Parameter. Beschriften Sie die Hintergrundbrunnen unter dem &quot;Back. Correction &quot;Registerkarte und sicher sein, die Option&quot; Do Grundkorrektur &quot;. </li><li> Label conditions indem Sie zuerst auf die Registerkarte &quot;Gruppen &amp; Labels&quot;, gefolgt von der Registerkarte &quot;Gruppen-Info&quot;. Nachdem diese Parameter eingegeben haben, klicken Sie auf &quot;Ende&quot;, gefolgt von &quot;Vorlage speichern&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Der Testlauf <ol><li> Laden Sie die Injektionslösungen in einen Testlauf Patrone und starten Sie die Kalibrierung durch Eingabe der ersten Analyse-Software, gefolgt von der Eingabe der &quot;Standard&quot; Modus. Geben Sie in das &quot;Gast&quot; Forum. Öffnen Sie die Vorlage in Schritt 1.5 unter der &quot;XF&quot; Platte gespeichert, auf der Registerkarte &quot;Vorlagen&quot;. Einmal geöffnet, klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um die Kalibrierung zu starten. Hinweis: Der Testlauf Patrone muss mit der abgeschrägten Ecke nach links unten in die Maschine eingegeben werden. Dies dauert etwa 30 min. Achten Sie darauf, Lösungen in die richtigen Anschlüsse zu injizieren. Injektionen in Tabelle 4-5 werden in der Reihenfolge der Lade aufgeführt. </li><li> Sanft, aber gründlich mischen die mitochondria Lager durch Rühren der Lösung mit 200 ul Pipettenspitze, gefolgt von sanft Verreiben des Lager mit einer 200 ul Pipettenspitze, die seine Öffnung durch Schneiden ~ 3 mm vom Ende der Spitze mit einer Schere erweitert hatte. </li><li> Führen Bicinchoninsäure (BCA) Assay, um die Proteinkonzentration der mitochondrialen Lager zu bestimmen. </li><li> Verwendung der aus Schritt 2.3 erworbene Stoffkonzentration resuspendieren 10 ug mitochondrialen Protein / 200 ul des Succinat / Rotenon Substratmischung (Tabelle 3). Resuspendieren 14 ug mitochondrialen Protein / 200 &amp; mgr; l der verbleibenden Substratmischungen (Dies muss für jedes Substrat Mischung durchgeführt werden) (Tabelle 3). Legen Sie alle mitochondrialen Protein / Substratmischungen auf Eis. Anmerkung: Die optimale Menge an Mitochondrien-Protein pro Well für jeden Assay wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. 9 Es wurde festgestellt, daß das Pyruvat / Malat, Palmitoylcarnitin / Malat, Glutamat / Malat eind Elektronenfluss Assays verwendet 3,5 ug des mitochondrialen Proteins, während das Succinat / Rotenon Assay verwendet 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Vertiefung. Daher muss der Forscher genug mitochondrialen Protein resuspendieren 4 repliziert in diesem Schritt, da entweder 2,5 ug oder 3,5 ug pro 50 ul pro Vertiefung geladen (siehe Schritt 2.6). </li><li> Mischen Sie die Mitochondrien / Substratlösungen sanft, aber gründlich durch Rühren der Lösung mit 200 ul Pipettenspitze, gefolgt von sanft Verreiben des Lager mit einer 200 ul Pipettenspitze, die ~ 3 mm von seinem Ende gehabt hat abgeschnitten. </li><li> Legen Sie eine Zellkulturplatte auf Eis und in dreifacher Ausfertigung, Last 50 ul / Vertiefung von jedem der Mitochondrien / Substratmischungen. Die Entwickler des auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assay empfehlen Verlassen ein Minimum von zwei Leerprobe (ohne Mitochondrien) Brunnen, vorzugsweise auf beiden Seiten auf der Zellkulturplatte. </li><li> Spin der Zellkulturplatte bei 2.000 g für 20 min bei 4 ° C. Während die Platte sPinning, Aufwärmen der Substratlösungen in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Nach der Spin vollständig ist, sorgfältig 450 ul jeder Substratlösung auf seiner entsprechenden Wells laden (dh, legen Sie das Pyruvat / Malat-Substrat in die Vertiefungen, die Mitochondrien zunächst in der Substratlösung resuspendiert haben). Achten Sie darauf, die Platte bei RT zu laden. Hinweis: Blank Brunnen sollte mit 500 ul Substrat geladen werden. Für den Elektronenfluss Assay bezeichnet leere Vertiefungen sollten mit dem Elektronenfluss Substrat (Pyruvat / Malat + FCCP) geladen werden, während die gekoppelten Assay Blindvertiefungen mit jedem Kopplungsassay Substrat geladen werden. Hinweis: Bei der Durchführung der gekoppelten und Elektronenfluss-Tests auf der gleichen Platte, muss der Forscher Hintergrund Brunnen an die jeweiligen Tests neu zuweisen, nachdem der Testlauf abgeschlossen ist, mit Hilfe der &quot;XF Reader&quot; Plattform über den Reiter &quot;Instrument&quot;. Einmal in der &quot;Instrument&quot; Einstellung, klicken Sie auf die &quot;Verwaltung&quot;Reiter, gefolgt von &quot;Background Correction&quot;. Hit &quot;Geräte Setup beenden&quot;, wenn Sie fertig. Dies ist, weil die Kombination von Ascorbat / TMPD können O 2, wodurch eine separate Hintergrundkorrektur für jeden Assay benötigten Typ zu verbrauchen. </li><li> Nachdem das 450 &amp; mgr; l Substrat zu jeder Vertiefung zugegeben, Ansicht der Schicht aus Mitochondrien in der Vertiefung zu gewährleisten, die Mitochondrien sind gleichmäßig in einem einzigen Monoschicht dispergiert (20-facher Vergrößerung [siehe Rogers 9, 4]). Wells, die scheinbar nicht um eine gleichmäßig verteilte Monolage haben können post hoc entfernt werden. </li><li> Nach der Überprüfung für mitochondriale Einhaltung, legen Sie die Mikroplatte in die respirometrischen Assay Instrument und starten Sie den Test, indem Sie auf &quot;OK&quot; ausgeführt werden. Hinweis: Die Kalibrierung von Schritt 2.1 muss abgeschlossen sein, bevor der Lauf beginnt. Sobald die Forscher klickt &quot;OK&quot;, wird die Maschine das Dienstprogramm Platte, die für die Kalibrierung verwendet wurde ausgeworfen. <ol> &lt;li&gt; Entfernen Sie das Dienstprogramm Platte und setzen Sie den Zellkulturplatte, die die Mitochondrien auf dem Tablett enthält. Die blaue Kerbe auf der Zellkulturplatte sollte in der unteren linken Ecke des Behälters platziert werden. Klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;, um den Testlauf zu starten. </li></ol></li><li> Nach dem Durchlauf abgeschlossen ist, werfen die Zellkulturplatte und Kassette mit der Taste &quot;Auswerfen&quot; auf dem Bildschirm. <ol><li> Sobald die Platte ausgeworfen wird, entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturplatte und Kassette und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot; auf dem Bildschirm. Der Lauf wird automatisch als .xls-Datei in der Datei &quot;Data&quot; gespeichert werden. </li></ol></li><li> Öffnen Sie diese Datei und ändern Sie die Anzeige von &quot;O2&quot; auf &quot;OCR&quot;, indem Sie auf den Abwärtspfeil unter dem &quot;Y1:&quot; Marker. <ol><li> Nächste Änderung &quot;Middle Point&quot; auf &quot;Punkt-zu-Punkt-Preise&quot; unter dem &quot;Rate Daten angezeigt, wie:&quot; -Option. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um diese Änderungen zu übernehmen. </li></ol&gt; </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Nun Gruppen-Modus&quot; auf unten links auf dem Bildschirm, um Gruppe Näpfe ähnlichen Bedingungen zusammen. Schließlich klicken Sie auf &quot;Probe Mittelwert / Standardfehler&quot; Registerkarte in Richtung auf die Mitte des Bildschirms, auf der linken Seite. Alternativ können diese Befehle eingerichtet werden, bevor der Test beginnt in der &quot;Test Wizard&quot; -Einstellung. Hinweis: Jeder Zustand wird ein Mittelwert ± Standardabweichung für jede Rate und jede Bedingung anzuzeigen. Es gibt Rate Messungen pro Zustand (State 2 [Kupplung] / State3u [Elektronenfluss] Atmung durch vier Injektionen folgten) übernommen. Verwenden Sie den Mittelwert des Staates 2 Rate der zweiten Messung zu bestimmen Staat 4o bei der minimalen Punkt nach Oligomycin Injektion, verwenden Sie den Maximalpunkt für Zustand 3 und Zustand 3U nach ADP und FCCP Injektion, bzw., und verwenden Sie die Mindestpunkt für Antimycin A induzierte Atmung für die Kopplung Assays. Verwenden Sie den Maximalpunkt für die Pyruvat / Malat-induzierten Zustand 3u Atmung, verwenden Sie die MindestPunkt für Rotenon induzierte Respiration, verwenden Sie den Maximalpunkt für Bernsteinsäure-induzierte Staat 3u Atmung, und verwenden Sie die Mindestpunkt für Antimycin A induzierte Atmung für den Elektronenfluss-Assay. Alle Versuche wurden 3-mal durchgeführt, und die gezeigten Daten sind die Ergebnisse einer repräsentativen Verfolgung. </li></ol>

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</ol>

George W. Rogers ist Mitarbeiter von Seahorse Bioscience, die das Instrument für die diese Tests wurden entwickelt, produziert.

Die in diesem Artikel vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mitochondrien aus 75 isoliert - 100 mg Maus-Skelettmuskel. Diese Tests können mit hoher Präzision durchgeführt werden, wie durch die enge Standardabweichung zwischen den drei Vertiefungen belegt. Wichtig ist, dass diese respirometrischen Assays erlauben die Ermittlung von wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der ETC, TCA-Zyklus, β-Oxidationswegs, Substrat-Transporter etc. auftreten werden, in einem häufig verwendeten Tiermodell. Es ist wichtig, den Grund für die Verwendung verschiedener Brennstoffe und Inhibitoren in diesem Protokoll verwendet markieren. Pyruvat / Malat und Glutamat / Malat respirometrischen Assays erlauben die Beurteilung komplexer I vermittelte Atmung, sowie die Beurteilung der jeweiligen Transporter, und im Fall von Glutamat, Desaminase 15. Alternativ kann die Kombination vonSuccinat / Rotenon ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Atmungsfluss durch Complex II des ETC seit Rotenon hemmt Komplex I und Succinat bietet Elektronen-Komplex II über die Reduktion von Flavinadenindinucleotid (FADH 2) 15. Diese Untersuchungen liefern substratspezifischen Information, die Kopplungseffizienz und maximale Atmung. Der Elektronenstrom Assay ist, daß die Kombination von Substraten und Inhibitoren ermöglicht die Bewertung von Mehrfachkomplexen in mitochondrialen Atmungsfluss 9 einzigartig. Das Ausgangssubstrat Mischung von Pyruvat / Malat + FCCP erlaubt die Auswertung von maximal Atmung durch Komplex I angesteuert, während die Injektion von Rotenon gefolgt von Succinat ermöglicht die Beurteilung maximale Atmung durch Complex II angetrieben. Die Injektion von Antimycin A, ein Inhibitor der Komplex III, gefolgt von der Injektion von Ascorbat / TMPD ermöglichen die für die Auswertung der Atmung durch Komplex IV da die Ascorbate angetrieben / TMPD istElektronendonor zu Cytochrom C / Complex IV. Während keine Informationen über die Kopplungseffizienz erreicht wird, ist das Verfahren ideal für sehr kleine Probengrößen, die das Ausführen mehrerer Substrate unabhängig auszuschließen. Schließlich ermöglicht die Analyse der Koordinierung zwischen β-Oxidation und die ETC da die aus der Oxidation von Palmitinsäure (β-Oxidation) hergestellt Reduktionsäquivalent der Einsatz von Palmitoylcarnitin / Malat Einspeisung ins ETC durch das Elektronenübertragungs Flavoprotein 15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Kupplung und die Elektronen fließen Assays können auch in Tandem aufgrund einiger Eingriff (medikamentöse Behandlung, genetische Manipulation) verwendet werden, um Veränderungen in der mitochondrialen Funktion identifiziert werden. Die hohe Präzision für diese Assays erreicht ist vor allem eine gute Durchmischung der Mitochondrien, sei es vor der Proteinbestimmung, bzw. mit den Substratlösungen ist. In diese Richtung einmal den Mitochondrien in das Substrat solutio resuspendendns, ist es wichtig, diese Lösung gut vor dem Laden der Zellkultur-Platte, wie in Schritt 2.2 mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze beschrieben mischen. Die Nichtbeachtung der Mitochondrien gründlich mischen wird, um große Variation innerhalb des Assays führen. Zusätzlich mit einer schmalen Öffnung Pipettenspitze wird Scherkräfte zu erzeugen, während das Mischen der Mitochondrien und erhöht das Potential, um die Membranen der Mitochondrien und die Freisetzung von Cytochrom C. Die Einhaltung der Schritt (2.7) ist ebenfalls ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll zu beschädigen. Bei Nichtbeachtung der geladenen Zellkulturplatte lang / schnell genug drehen wird in unvollständiger Einhaltung der Mitochondrien zum Brunnen führen, so führen erhöhte Variabilität zwischen den Bohrlöchern und Messungen. Die beschriebenen Protokoll wurde optimiert, um die folgenden: Laden eine optimale Menge an mitochondrialer Protein pro Loch, mit den richtigen Konzentrationen / Herstellungsverfahren, um Lager und Substratlösungen zu machen, die Änderung der Testlauf, um mitochondriale Zustand pla sicherzustellen,teaus und geeignete Durchmischung der mitochondrialen Lager und mitochondriale / Substratmischungen. Vor diesen Optimierungsbemühungen stießen die Autoren Fallstricke in der Testlauf. Im Folgenden beschreibt Methoden zur Problembehandlung / Änderungen, die hilfreich bei der Optimierung dieses Protokoll gab. In Bezug auf die optimale Beladung wird geladen zu wenig Mitochondrien nicht eine robuste Reaktion hervorzurufen, während das Laden zu viel Mitochondrien wird die Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer erschöpfen und führen zu ungenauen Messungen. Rogers et al 9 enthält Beispiele für die Bestimmung der optimalen Beladungsmengen der Mitochondrien pro Vertiefung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays. Häufiger zu viel Mitochondrien pro über 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten&gt; 1500 pmol / min / Vertiefung geladen sowie durch staatliche belegt 2 Raten. Wenn über Laden auftritt, ein Experiment mit verschiedenen Konzentrationen von mitochondriales Protein (beispielsweise zwischen 1 -. 10 ug) zu OCR innerhalb des dynamischen r hervorrufenange des Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine. Herstellung und Verwendung der richtigen Konzentrationen von Substraten und Aktien ist von größter Bedeutung. Verwenden Sie immer die Säureform von Substraten / Injektionen und der pH-Wert mit Kaliumhydroxid oder HCl; Natrium-Puffer / Lösungen sind nicht zu empfehlen. Darüber hinaus Resuspendieren Substrate / Aktien in DMSO oder 100% Ethanol wird in der Messfehler oder Fehler. Achten Sie darauf, 95% Ethanol zu verwenden, wo gemerkt. Es ist üblich, Palmitoylcarnitin, um aus dem 95% Ethanol nach dem Auftauen des gefrorenen stock auszufällen, wodurch große Variabilität. Seien Sie sicher zum Aufwärmen der Palmitoylcarnitin Lager und Wirbel vor Gebrauch gut. Darüber hinaus kann ein sehr variables Pyruvat / Malat-Assay-Ergebnis durch die Pyruvat stock Befinden&gt; 2 Wochen alt sein. Achten Sie darauf, gefrorenen Aliquots von Pyruvat alle 2 Wochen erneuern. Der Testlauf wurde auf 2-min-Messungen modifiziert, um mitochondriale Staatsebenen zu gewährleisten. Wenn Beobachtung der Erschöpfung der ADP gewünscht wird, kann der Forschererstrecken sich die Messzeit auf der Registerkarte &quot;Protokoll&quot; unter dem &quot;Test Wizard&quot; Forum. Schließlich tritt große Variabilität bei der mitochondrialen Lager und Mitochondrien sowie Substratlösungen sind nicht vollständig vor dem Verladen homogenisiert. Wenn Variabilität zwischen Brunnen hoch ist nach dem Testlauf, müssen Sie vollständig vor dem nächsten Versuch mischen die Substratlösung. Nie vortexen die Mitochondrien / Substratlösungen, sondern rühren, Maische, und sanft verreiben mit einem verbreiterten Öffnung Pipettenspitze. Es gibt einige Einschränkungen dieser Technik, die erwähnenswert sind. Erstens ist die Anzahl der Vertiefungen auf der Zellkulturplatte für diese Assays verwendeten relativ niedrig ist (dh., Mit 24 Vertiefungen und die Blindvertiefungen bezeichnet mindestens 2). Wenn es gewünscht ist, alle 5 dieser Assays auf einer Platte durchzuführen, ist der Forscher nur in der Lage, die Reaktionen aus einer Maus zu einem Zeitpunkt zu untersuchen. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass 96 auch Instrumente zur Verfügung steht higher Durchsatz. Zweitens gibt es inhärente Stärken und Schwächen bei der Beurteilung mitochondriale Dysfunktion in isolierten Mitochondrien im Vergleich zu intakten Zellen 1. Einige Schwachstellen sind mit weniger physiologische Relevanz im Vergleich zu intakten Zellen und induzieren Artefakte aus dem Isolationsprozess. Schließlich ist der Erfolg dieser Methode abhängig von der Qualität der mitochondrialen Isolationsprozesses. Obwohl einige dieser Assays wurden entweder in verschiedenen Systemen entwickelt haben oder in anderen Tiermodellen validiert, die hier vorgestellten Verfahren sind die ersten, alle zuvor erwähnten Tests für die optimale Verwendung in einer Multi-Well-Sauerstoffverbrauchs-Messmaschine mit Maus synthetisieren Skelettmuskulatur. Wichtiger ist, daß alle 5 dieser Assays mit der Menge an Mitochondrien aus ~ 75 getrennt durchgeführt werden, - 100 mg Maus Skelettmuskel, wodurch hohen Durchsatz bei geringen Material. Von großer Bedeutung ist die Fähigkeit der MultiwellSauerstoffverbrauch Technologien auf Assays mit minimalen Mengen von Mitochondrien, in Kombination mit einer optimierten Isolierungsverfahren durchzuführen, ermöglicht es dem Forscher, eine Vielzahl weiterer Experimente mit dem Rest des Skelettmuskelgewebe (z. B. Western-Blots durchzuführen, RT-PCR, enzymatische Assays, etc.), die oft ein Kampf mit diesem Tiermodell. Abschließend können die hier vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung von einer Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests unter Verwendung von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden benötigen nur minimale Mengen von Gewebe und Mitochondrien. Einmal gemeistert werden die hierin beschriebenen Techniken können die Forscher einen potentiellen Mechanismus, einer Verbindung oder eines Genprodukts mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem üblicherweise verwendeten Tiermodell zu bestimmen.

Die wichtigste physiologische Rolle von Skelettmuskel Mitochondrien ist es, ATP aus oxidative Phosphorylierung 1 zu produzieren. Wichtig ist, zu spielen Skelettmuskel Mitochondrien eine besondere Rolle bei der körperlichen Leistungsfähigkeit 2, Alterung 3, degenerative Erkrankung 4 und Diabetes Typ II 5. Als einer alternden Gesellschaft und Typ-II-Diabetes als die 7. führende Todesursache in den Vereinigten Staaten 6, der Bedarf an Methoden, die die Funktion der Mitochondrien zu beurteilen hat sich immer häufiger in der biomedizinischen Forschung 7,8. Insbesondere ist die Messung des Sauerstoffverbrauchs hat außergewöhnliche Nützlichkeit bei der Beurteilung der Mitochondrienfunktion, da sie das koordinierte Zusammenwirken zwischen mitochondrialen und nuklearen Genome stellt den funktionalen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung 9 auszudrücken. Mehrere Technologien existieren, ermöglichen die Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen und zu isolieren,d Mitochondrien 7-10. Darüber hinaus haben Tests für mehrere Zelltypen und Geweben entwickelt worden und in einer Vielzahl von Arten, die für die Messung der mitochondrialen Atmungswege und Steuer 9,11,12 ermöglichen. Allerdings gibt es derzeit eine Lücke in der Literatur in Bezug auf die Zusammenstellung aller dieser Tests unter Verwendung von isolierten Mitochondrien aus Maus Skelettmuskel für die Verwendung in auf Mikrotiterplatte Sauerstoffverbrauch Technologien. Wichtig ist, dass Verwendung auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays unter mitochondrialen Biologen wächst und ermöglicht hohe Durchsatzmessungen mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien 9. Daher ist eine Sammlung von auf Mikrotiterplatte respirometrischen Tests wurden entwickelt, die die Ermittlung, wo Anomalien und / oder Anpassungen können in der Elektronentransportkette (ETC) auftreten werden, zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden zwei weitere auf Mikrotiterplatte respirometrischen Assays entwickelt, die die Analyse der Koordinierung betwee aktivierenn der Tricarbonsäure (TCA) Zyklus und der ETC und zwischen ß-Oxidation und der ETC. Wichtig ist, dass die vorgestellten Methoden liefern eine klare und präzise Art und Weise, um mechanistische Veränderungen im mitochondrialen Funktion in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>lagern D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>Bei RT lagern</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch, mindestens 99,0 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>Bei RT aufbewahren</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat, ACS-Reagenz, 99,0-102,0 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>HEPES mindestens 99,5 % Titration</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Essentially Fatty&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>Store at 4 &deg; </td></tr><tr><td>C-Säure-frei - BSA-Brenztraubensäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 98%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Bei 4 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>Bernsteinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>lagern L(-) Apfelsäure, BioXtra, &ge; 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>aufbewahren L-Glutaminsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Bei RT</td></tr> aufbewahren <tr><td>n,n,N&Prime;,N&prime;-Tetramethyl-p-phenylendiamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>aufbewahren 99%, Pulver [TMPD]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-Carnitinchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Oligomycin A, &ge 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Bei 2 - 8 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Phenylhydrazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (DC), Pulver [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A aus Streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Store at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-diphosphat monopotassium salt dehydrate [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Bei -20 μg lagern; C</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Store bei RT</td></tr><tr><td>Pierce&trade; BCA-Protein-Assay-Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

verwendung von isolierten mitochondrien aus minimalen mengen an maus-skelettmuskel für die hochdurchsatz-mikroplatten-atemmessungen

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Mitochondrien der Skelettmuskulatur spielen eine spezifische Rolle bei vielen Krankheitspathologien. Daher hat sich die Messung des Sauerstoffverbrauchs als Indikator für die mitochondriale Funktion in diesem Gewebe immer mehr durchgesetzt. Obwohl es viele Technologien und Assays gibt, die mitochondriale Atmungswege in einer Vielzahl von Zellen, Geweben und Spezies messen, gibt es derzeit eine Lücke in der Literatur in Bezug auf die Zusammenstellung dieser Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus dem Skelettmuskel der Maus für die Verwendung in Mikroplatten-basierten Technologien. Wichtig ist, dass der Einsatz von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays unter Mitochondrienbiologen zunimmt, da sie Messungen mit hohem Durchsatz mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien ermöglichen. Aus diesem Grund wurde eine Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays entwickelt, die in der Lage sind, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu beurteilen. Die hierin vorgestellten Verfahren bieten Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung dieser Assays mit einer optimalen Menge an mitochondrialem Protein und Reagenzien und hoher Präzision, wie durch die minimale Varianz über den dynamischen Bereich jedes Assays nachgewiesen wird.

Abbildung 1 für Sauerstoff Verbrauchsraten (OCR) für die Pyruvat / Malat, Succinat / Rotenon, Palmitoylcarnitin / Malat und Glutamat / Malat-Assays (Coupling-Assays). Diese Assay-Kurven werden als Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR, als Funktion der Zeit angezeigt wird, werden Hintergrund correceted und werden als Punkt-zu-Punkt-Preise angezeigt. Jedes Panel repräsentiert Sauerstoffverbrauch in verschiedenen mitochondrialen Zustände wie durch Zufall und Williams 14 beschrieben. Die erste Platte darstellt basale Sauerstoffverbrauch oder Zustand 2 der zweiten Platte, nach der Injektion von ADP stellt maximale gekoppelt Atmung oder Zustand 3 der dritten Platte nach Injektion Oligomycin A (ein Inhibitor der Komplexe V) darstellt, die Atmung durch Protonenleck oder Staats 4o. Die vierte Platte nach Injektion FCCP stellt maximale entkoppelt Atmung oder Staats 3u. Schließlich wird das fünfte Panel nach der Injektion von Antimycin A, stellt die Hemmung der oxidativen Atmung. Bemerkenswerterweise all mitochondrialen Staaten haben minimale Standardabweichung. Dies ist auf eine gute Durchmischung der mitochondrialen Lager und den Mitochondrien / Substratmischungen und die Verwirklichung eines einzelnen Monoschicht der Mitochondrien nach der Einhaltung Spin (Schritt 2.6). Auf der anderen Seite, das Laden ungleiche Mitochondrien in jede Vertiefung geben und nicht das Erreichen einer einzigen Monoschicht aus Mitochondrien in der Vertiefung der Mikroplatte führt zu der Standardabweichung in jedem Zustand erhöht, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Kurven in Abbildung 1 Anzeigeebenen für jedes mitochondriale Staat und für jedes Substrat. Das Plateau nach zwei Meßzyklen erreicht schlägt gute mitochondrialen Qualität und die Mitochondrien bleiben an dem auch während der gesamten Dauer des Assays haftet. Zusätzlich kann das Erreichen des Maximalplateau Raten wünschenswert sein, da dies ermöglicht es dem Forscher, die durchschnittliche OCR an diesen mitochondrialen Zustände einnehmen, wodurch Vorspannung, die auftreten können Reduktionsdurch willkürliches Auswählen eines Punktes. Die Höhe der Mitochondrien pro Vertiefung wurde durch Optimierungsversuche ermittelt. Die optimale Menge an Mitochondrien pro Vertiefung sollte in State 2 Raten zwischen 100-200 pmol / min / Loch und Zustand 3 Raten &lt;1,500 pmol / min / Loch, da diese Werte in dem dynamischen Sauerstoffmessbereich des Multiwell-Sauerstoff- Verbrauchsmessung Maschine. Laden zuviel mitochondrialen Protein pro Well in OCRs über den dynamischen Bereich des Instruments (3A) führen. 3 veranschaulicht das Laden mit 3,5 ug des mitochondrialen Protein pro Well (blaue Spur) im Vergleich zum Lade 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Well (red Tracing) für die Succinat / Rotenon Assay. Laden zuviel mitochondrialen Protein pro Vertiefung kann auch auf die Erschöpfung der Sauerstoff innerhalb der Mikrokammer des Bohrlochs zu führen, wodurch eine genaue Messung der OCR für jede aufeinanderfolgende Messung 9 (3B &lt;/ strong&gt;). Punkt-zu-Punkt OCR die momentane Änderungsrate des OCR. Wenn flach, ist das OCR stetigen / stable, aber wenn abnimmt, dann kann es eine biologische oder technische Problem sein. Der starke Rückgang in OCR in Zustand 3 und Zustand 3u Atmung (3A) wird von den Mitochondrien anstrengend die Sauerstoffversorgung vor dem Ende der Messung (3B) verursacht. 4 stellt OCR gegen die Zeit für den Elektronenfluss Assay. Das Verfolgen korrigiert und angezeigt, wie für Figur 1 beschrieben wurde. Die erste Platte in diesem Test entspricht dem Stand 3u Atmung auf Pyruvat / Malat über komplexe I. die zweite Platte nach Injektion Rotenon stellt die Hemmung der Komplex I vermittelte Atmung. Das dritte Panel, nach der Injektion von Succinat, stellt Substrat angeregt Staat 3u mit Elektronen in die ETC in Complex II (Complex II vermittelten Atmung). Die vierte Platte nach Injektion Antimycin A stellt die Hemmung der Komplex III und damit insgesamt die Atmung. Schließlich wird das fünfte Panel nach Injektion von Ascorbat / TMPD stellt Komplex IV vermittelten Atmung. Ähnlich den Kurven in Figur 1 haben alle mitochondrialen Zustände minimale Standardabweichung und jeweils Rate hat oder beinahe ein Plateau erreicht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Abbildung 1. Kupplung Assays. (A) 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat, (B) 10 mM Succinat / 2 uM Rotenon, (C) 40 &amp; mgr; M Palmitoylcarnitin / 1 mM Malat und (D) 10 mM Glutamat / 10 mM Malat gekoppelt mitochondriale Atmung Assay-Kurven, wie durch Multi-Well-Messung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 &amp; mgr; g für alle Tests außer Succinat / rotEnon, das 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Vertiefung verwendet. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvat; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; PAL-C = Palmitoylcarnitin; GLUT = Glutamat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Abbildung 2 sehr unterschiedlich Pyruvat / Malate Assay. Sehr variabel 10 mM Pyruvat / 5 mM Malat-Test durch unvollständig Misch Mitochondrien aus der mitochondrialen Lager im Substrat / MAS-Mix, damit variable mitochondrialen pro führenden verursachtProteinbeladung in jede Vertiefung. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 &amp; mgr; g. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Pyruvat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Abbildung 3. Überlastung mitochondriale Protein für die Succinat / Rotenon Assay. (A) Die Sauerstoffverbrauchsraten außerhalb des dynamischen Bereichs der Multiwell Sauerstoffverbrauchsmessmaschine durch Laden 3,5 ug mitochondrialen Protein pro Well (blau Verfolgung) verursacht im Vergleich zum Lade 2,5 ug der mitochondrialen Protein pro Well (rot Verfolgung). (B ) OxyGen Spannung nähert folgenden ADP und FCCP Injektionen durch Laden übermäßige mitochondriale Protein (3,5 ug) pro Vertiefung (blaue Spur) verursacht im Vergleich zu dem Laden eine optimale Menge (2,5 ug) der mitochondrialen Protein pro Well (rot Verfolgung) Null. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikate pro mitochondriale Proteinmenge. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; ADP = Adenosindiphosphat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanid- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; O 2 = Sauerstoff; mm Hg = Millimeter Quecksilber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Abbildung 4. Elektronenfluss Assay. 5 mM Pyruvat / 1 mM Malat + 4 uM FCCP, Elektronen fniedrige mitochondriale Atmung Assay Verfolgung durch Multi-Well-Messung des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Werte sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Mitochondriale Protein pro Vertiefung geladen betrug 3,5 &amp; mgr; g. Daten für n = 3 gepaart biologischen Replikaten. OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; Anti-A = Antimycin A; Asc = Ascorbate; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethyl- p-Phenylendiamin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lizenz Konzentration </td><td> MW </td><td> Schluss Volume </td><td> Masse gegeben </td><td> Kommentare / Beschreibung </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (g oder ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml 1 M Tris-Base </td><td> 3,801 g </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> 250 ml DiH 2 O </td><td> 59. 57 g </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl 2, Hexahydrat </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml DiH 2 O </td><td> 50,82 g </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Pyruvat-pH-Wert 7,4 </td><td> 0.1 </td><td> 88.06 (Kommt als 14.11 M Lösung) </td><td> 40 ml DiH 2 O </td><td> 0,283 ml Pyruvinsäure </td><td> Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C, stellen frische alle zwei Wochen </td></tr><tr><td> Bernsteinsäure pH-Wert 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 118,09 </td><td> 100 ml DiH 2 O </td><td> 9,4 g succinic Säure </td><td> Stellen Sie 1 ml Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Malate, pH 7,4, </td><td> 0,5 </td><td> 134,09 </td><td> 100 ml 95% Ethanol </td><td> 6,7 g Apfelsäure </td><td> Stellen Sie 200 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0,01 </td><td> 164,25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Stellen Sie 300 ul Aliquots und bei -20 ° C; Mischen Sie mit einer äquimolaren Menge von Ascorbat zu TMPD zu halten reduziert </td></tr><tr><td> Palmitoyl-L-Carnitinchlorid </td><td> 0,01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml 95% Ethanol </td><td> 0,005 g </td><td> Machen Sie 40 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 0,006 </td><td> 791,06 </td><td> 0,987 ml 95% Ethanol </td><td> 0,005 g </td><td> Machen Sie 20 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0,01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml 95% Ethanol </td><td> 0,01 g </td><td> Machen Sie 40 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> 0,001 </td><td> 394,4 </td><td> 10 ml 95% Ethanol </td><td> 0,0039 g </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 0,005 </td><td> 548,63 </td><td> 9,12 ml 95% Ethanol </td><td> 0,025 g </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0,5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml DiH 2 O </td><td> 1,0 g </td><td> Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Äpfelsäure, pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 134,09 </td><td> 40 ml </td><td> 2,68 g </td><td> Stellen Sie 200 ul Aliquots und bei -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Table 1. Stammlösungen <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagens </td><td> Lizenz Konzentration </td><td> Masse gegeben </td><td rowspan="2"> Endmolarität / Percent </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g oder ml) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> - </td><td> 11.98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Mannit </td><td> - </td><td> 20,04 g </td><td> 220 mM </td></tr><tr><td> Monobasisches Kaliumphosphat </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2, Hexahydrat </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5,0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Im Wesentlichen Fettsäure Free- BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0,20% </td></tr></tbody></table> . Tabelle 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml Aliquot und bei -20 ° C * Hinweis: Ausschließen BSA für die Assay-Injektionen verwendet MAS-Mix. <table border="0"><tbody><tr><td> Substrat Medium </td><td> Endkonzentration </td><td> Lagerbestand (ul) </td><td> Anzahl der MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Pyruvat / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mm / 5 mM </td><td> Pyruvat: 1.000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malate: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenon </td><td rowspan="2"> 10 mm / 2 &amp; mgr; M </td><td> Succinate: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenon 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Pyruvat / Malate + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mm / 1 mm / 4 &amp; mgr; M </td><td> Pyruvat: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malate: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoyl L-Carnitin / Malate </td><td> 40 uM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitin: 40 Malate: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamat / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mm / 10 mM </td><td> Glutamate: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malate: 200 </td></tr></tbody></table> Table 3. Substratlösungen pH 7,4: Stellen Sie frischen der Tag des Experiments. * Electron-Flow-Assay-Lösung. <table border="0"><tbody><tr><td> Injektionsmittel </td><td> Konzentration </td><td> Lagerbestand (ul) </td> &lt;td&gt; Anzahl der MAS (ml) </td><td> Menge in Patrone injiziert </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Nach dem in der Platte eingespritzt) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 20 &amp; mgr; M </td><td> 10 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 2,0 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 &amp; mgr; M </td><td> 12 ul </td><td> 3 </td><td> 60 &amp; mgr; </td><td> 4,0 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 &amp; mgr; M </td><td> 24 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 65 &amp; mgr; </td><td> 4,0 &amp; mgr; M </td></tr></tbody></table> TLage 4. Injektionen zur gekoppelten Assays pH 7,4:. Machen Sie frische der Tag des Experiments. * Kupplung Tests umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Pyruvat / Malat, Succinat / Rotenon, Palmitoylcarnitin / Malat und Glutamat / Malat. <table border="0"><tbody><tr><td> Injektionsmittel </td><td> Konzentration </td><td> Lagerbestand (g oder ul) </td><td> Anzahl der MAS (ml) </td><td> Menge in Patrone injiziert </td><td> Endkonzentration (Nach dem in der Platte eingespritzt) </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> 20 &amp; mgr; M </td><td> 60 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 2,0 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Bernsteinsäure- </td><td> 50 mM </td><td> 300 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 &amp; mgr; M </td><td> 24 μ; l </td><td> 3 </td><td> 60 &amp; mgr; </td><td> 4,0 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 &amp; mgr; </td><td> 3 </td><td> 65 &amp; mgr; </td><td> 100 uM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbate: 0.059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Injektionen zur Elektronenfluss Assay pH 7,4:. Machen Sie den Tag des Experiments Frisch <table border="0"><tbody><tr><td> Befehl </td><td> Zeit (min) </td><td> # Von Zyklen </td></tr><tr><td> Kalibrieren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Warte ab </td><td> 10 min (zu ermöglichen Platte aus Einhaltung Schritt erwärmen) </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Michasure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Inject A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injizieren B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injizieren C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injizieren D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1 Minute </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 2 min </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Instrument Run Protocol.

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe einer Mikroplatten-basierten Sauerstoffverbrauchstechnologie die Funktion der Atmungskette, des Zitronensäurezyklus, der Beta-Oxidationsbahn und der Substrattransporter zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Substrat und die Injektionslösungen für den Assay vorbereitet werden. Im zweiten Schritt werden die Injektionslösungen in eine zuvor hydratisierte Tric-Assay-Kartusche gegeben, um das Sauerstoffverbrauchsmessgerät zu kalibrieren.Bereiten Sie anschließend die mitochondrialen Substratlösungen vor und geben Sie diese in die Zellkulturschale. Zentrifugieren Sie die Zellkulturschale, um eine Anheftung der Mitochondrien an die Mulden der Schale zu ermöglichen, bevor die Schale in den Respirometer-Assay eingebracht wird. Die Instrumentenergebnisse liefern Angaben zu den Sauerstoffverbrauchsraten, die auf der mitochondrialen Atmung für jeden Respirometer-Assay basieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Clark-Elektrode liegt darin, dass Technologien auf Basis von Mikroplatten eine effizientere und hochdurchsatzfähigere Erfassung des Sauerstoffverbrauchs mit geringeren Mengen an Mitochondrien ermöglichen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da viele Einzelschritte bei der Vorbereitung der Lösungen für den Assay berücksichtigt werden müssen. Am Abend vor dem Experiment hydratisieren Sie die Tric-Assay-Kartusche in einem Milliliter Kalibrierlösung in einem Inkubator ohne CO2 bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag entnehmen Sie alle gefrorenen Stiele und tauchen sie in einem Wasserbad oder Inkubator bei 37 Grad Celsius auf. Bereiten Sie alle Substratlösungen und Injektionslösungen vor und lagern Sie diese auf Eis. Der nächste Schritt besteht darin, das Messgerät für den Sauerstoffverbrauch in mehreren Vertiefungen mit den richtigen Misch-, Wäge- und Messparametern zu programmieren.Starten Sie die Analyse-Software und wählen Sie den Standardmodus aus. Betreten Sie das Seahorse-Gastforum und klicken Sie auf den Assay-Assistenten. Klicken Sie im Assay-Assistenten auf Protokoll, um die Mischgewichts- und Messparameter zu ändern.Markieren Sie die Hintergrundlöcher unter der Registerkarte Hintergrundkorrektur und vergewissern Sie sich, dass sie hervorgehoben sind. Führen Sie die Hintergrundkorrektur durch. Beschriften Sie die Bedingungen, indem Sie zuerst auf die Registerkarte Gruppen und Beschriftungen und anschließend auf die Registerkarte Gruppeninformationen klicken.Nachdem diese Parameter eingegeben wurden, klicken Sie auf Ende und anschließend auf Vorlage speichern. Um diesen Vorgang zu beginnen, laden Sie die Injektionslösungen in eine Kartusche für den Assay-Durchlauf. Achten Sie darauf, die Lösungen in die richtigen Anschlüsse einzubringen.Laden Sie die Assay-Laufkartusche mit abgeschrägter Ecke links unten in das Gerät ein. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie zunächst die Analyse-Software und anschließend den Standardmodus aufrufen. Treten Sie in das Seahorse-Guest-Forum ein.Öffnen Sie die gespeicherte Vorlage im XF-Laufwerk unter der Registerkarte „Vorlagen“. Klicken Sie nach dem Öffnen auf „Start“, um die Kalibrierung zu beginnen, die etwa 30 Minuten dauert. Die für dieses Verfahren verwendeten Mitochondrien wurden aus rotem Skelettmuskel isoliert und vorsichtig, aber gründlich, mit der Substrat-Stammlösung vermischt, indem die Lösung mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, an deren Ende etwa drei Millimeter abgeschnitten wurden, mehrfach umgerührt wurde.Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration des mitochondrialen Stammsuspendats werden 10&nbsp;Mikrogramm mitochondriales Protein pro 200&nbsp;Mikroliter des bekannten Substratgemischs aus Succinat und Rot suspendiert. Das Mitochondrien-Substrat-Gemisch vorsichtig, aber gründlich durch leichtes Umwirbeln mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mischen, deren Ende um etwa drei Millimeter abgeschnitten wurde. Für die übrigen Substratgemische jeweils 14&nbsp;Mikrogramm mitochondriales Protein pro 200&nbsp;Mikroliter verwenden und alle Mitochondrien-Protein-Substrat-Gemische auf Eis stellen.Stellen Sie eine 24-Loch-Zellkulturplatte auf Eis und geben Sie jeweils 50 Mikroliter der mitochondrialen Substratmischungen pro Brunnen im Dreifachansatz in die Platte. Die Entwickler des mikroplattenbasierten TRIC-Assays empfehlen, mindestens zwei Leerprobenbrunnen ohne Mitochondrien vorzusehen, vorzugsweise auf beiden Seiten der Zellkulturplatte. Zentrifugieren Sie die Zellkulturplatte 20 Minuten lang bei 2000 G und vier Grad Celsius, um die Mitochondrien während des Zentrifugierens an die Brunnen anzulagern.Erwärmen Sie die Substratlösungen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Nach Beendigung des Schritts vorsichtig 450 Mikroliter jeder Substratlösung auf die jeweiligen Brunnen auftragen. Stellen Sie sicher, dass die Platte bei Raumtemperatur beladen wird.Füllen Sie leere Wells mit 500 µL Substrat-Blank. Wells, die für den Elektronentransport-Assay vorgesehen sind, sollten mit dem entsprechenden Elektronentransport-Substrat beladen werden, während die Blank-Wells für den gekoppelten Assay mit jedem geeigneten Substrat für den Kopplungsassay gefüllt werden können. Nachdem 450 µL Substrat zu jedem Well hinzugefügt wurden, betrachten Sie die Mitochondrienschicht im Well bei 20-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sich die Mitochondrien gleichmäßig in einer einzigen Monoschicht verteilen.Wie in diesem Beispiel gezeigt, können Bild-Vertiefungen, die keine gleichmäßig verteilte Monoschicht aufweisen, nach dem Verschluss entfernt werden. Nach Bestätigung der mitochondrialen Anheftung bringen Sie die Zellkulturplatte zum Respirometrie-Assay-Gerät. Klicken Sie auf „Okay“.Die Maschine wird die zuvor für die Kalibrierung verwendete Hilfsplatte auswerfen. Entfernen Sie die Hilfsplatte und stellen Sie die Zellkulturplatte, die die Mitochondrien enthält, auf das Tablett. Die blaue Markierung an der Zellkulturplatte sollte in die linke untere Ecke des Tabletts eingesetzt werden.Klicken Sie auf „Weiter“, um den Assaylauf zu starten, der etwa 40 Minuten dauert. Nach Abschluss des Laufs drücken Sie auf dem Bildschirm auf „Auswerfen“, um die Zellkulturplatte auszuwerfen. Sobald die Platte ausgeworfen wurde, nehmen Sie die Zellkulturplatte und die Kartusche heraus und entsorgen Sie diese.Klicken Sie auf dem Bildschirm auf Weiter. Der Durchlauf wird automatisch als XLS-Datei in der Daten Datei gespeichert. Öffnen Sie diese Datei und ändern Sie die Anzeige von O2 auf OCR, indem Sie unter dem Y-Marker auf den nach unten zeigenden Pfeil klicken.Als Nächstes ändern Sie den Mittelpunkt auf punktuelle Raten unter den als Option angezeigten Ratedaten. Klicken Sie auf „Okay“. Um diese Änderungen anzuwenden, klicken Sie auf die Registerkarte „Brunnen-Gruppenmodus“ unten links auf dem Bildschirm, um Brunnen mit ähnlichen Bedingungen gemeinsam zu gruppieren.Klicken Sie abschließend auf der linken Seite in der Mitte des Bildschirms auf den Reiter „Standardfehler des Stichprobenmittelwerts“. Diese Befehle können auch vor dem Assay eingerichtet werden. Diese Kurven stellen die Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR über die Zeit für vier Kopplungsassays dar.Das erste Panel stellt Zustand zwei dar, die Atmung oder Atmung in Abwesenheit eines DP. Das zweite Panel nach Injektion eines DP zeigt die maximale gekoppelte Atmung, auch als Zustand-drei-Atmung bezeichnet. Das dritte Panel nach Injektion von Oligomycin stellt die durch Protonenleck verursachte Atmung dar, auch als Zustand-vier-o-Atmung bezeichnet.Das vierte Panel nach der Injektion von FCCP stellt die maximale entkoppelte Atmung dar, auch als State-three-U-Atmung bezeichnet. Das fünfte Panel nach der Injektion von Antimycin A zeigt die Hemmung der oxidativen Atmung. Alle mitochondrialen Zustände weisen eine minimale Standardabweichung auf, bedingt durch eine gründliche Mischung des mitochondrialen Stamms und der Mitochondrien-Substrat-Mischungen sowie durch das Erreichen einer einzigen Monolage von Mitochondrien nach der Adhärenz-Zentrifugation.Im Gegensatz dazu führt die ungleiche Beladung der Mitochondrien pro Brunnen und das Nichterreichen einer einzigen monolayerartigen Schicht der Mitochondrien zu einer erhöhten Standardabweichung in jedem Zustand, wie durch die blaue Kurve veranschaulicht, die OCR-Werte über 1.500 pmol pro Minute sowie abnehmende Atmungsraten im Verlauf der Messdauer zeigt, was sich in dem Rückgang der punktgenauen Ratenwerte widerspiegelt. Beachten Sie, dass die rote Kurve konsistente punktgenaue Raten aufweist und maximale OCR-Werte unter 1.500 pmol pro Minute liegen. Ein Übermaß an mitochondrialem Protein kann außerdem zu einer Erschöpfung des Sauerstoffs innerhalb der Mikrokammer des Brunnens führen, wodurch eine genaue Messung des OCR bei jeder nachfolgenden Messung verhindert wird, wie durch die blaue Kurve angezeigt, die O₂-Werte nahe null während des Messzeitraums sowie deutlich verminderte Ausgangs-O₂-Werte nach jeder nachfolgenden Messung zeigt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Geduld zu bewahren, wenn die Mitochondrien und die Substratlösungen gemischt werden. Sobald diese Methoden beherrscht sind, können weitere Experimente angepasst werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie beeinflusst eine gezielte pharmakologische Behandlung eines bestimmten Substrattransporters den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano...

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hier wird eine Quadrizeps-Muskelprobe von einem anästhesierten Schwein entnommen und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Anschließend werden die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV mittels hochauflösender Respirometrie bestimmt.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Erfahren Sie, wie Sie mitochondriale Atmung aus Maus-Skelettmuskel mit Hochdurchsatz-Mikroplatten-Technologie messen. Diese Methode ermöglicht effiziente Sauerstoffverbrauchsanalysen bei minimalem Probenmaterial.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen (Video) | JoVE Journal

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

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