Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Das übergeordnete Ziel dieses Videoartikels ist es, qualitativ hochwertige Mitochondrien aus kleinen Mengen von Maus-Skelettmuskeln zu isolieren, um sie in Mikroplatten-basierten Tric-Assays zu verwenden. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen in der biomedizinischen Forschung zu beantworten, z. B. zu beschreiben, wie bestimmte Medikamente und Proteine den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch der Skelettmuskulatur modulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass qualitativ hochwertige Mitochondrien aus kleineren Mengen an Skelettmuskulatur der Maus isoliert werden können, als bisher berichtet wurde.

Führen Sie die Euthanasie der Maus in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institution durch. Positionieren Sie dann die Maus auf der Seite und machen Sie mit einer feinen Schere einen Schnitt in die Haut. Überlagerung des lateralen Epicondylus des Femurs.

Schälen Sie die Haut in Richtung Maus und entfernen Sie dann das Fettpolster, das sich über dem Ursprungspunkt des Quadrizeps befindet. Als nächstes schneidest du die Quadrizepssehne durch, die an der Patella befestigt ist. Schneiden Sie die Apo-Neurose langsam zwischen Knochen und Quadrizeps ab und vermeiden Sie dabei die Oberschenkelarterie.

Schneiden Sie dann die Sehne am Ursprungspunkt am Oberschenkelknochen durch, um den Quadrizepsmuskel zu befreien, und platzieren Sie den Quadrizepsmuskel in gekühltem PBS. Entfernen Sie sichtbares Fettgewebe über dem Quadrizeps mit einer Schere. Sobald er sauber ist, drehe den Quadrizeps um, so dass der Teil des Muskels, der über dem Oberschenkelknochen lag, nach oben zeigt.

Öffnen Sie den Quadrizepsmuskel mit einer Pinzette in einer fächernden Bewegung. Entferne die beiden sichtbaren roten Muskelteile von jedem Lappen und lege sie in ein Becherglas mit fünf Millilitern gekühlten Mitochondrien. Isolations-Puffer.

Schneiden Sie anschließend die Haut über der Achillessehne mit einer feinen Schere ab und schälen Sie die Haut in Richtung Maus. Schneiden Sie die freiliegende Achillessehne ab und schälen Sie den Muskel in Richtung des Körpers der Maus. Schneiden Sie die Sehne an den lateralen und medialen Kondylen des Femurs durch, um den Gastrocnemius zu befreien, und legen Sie den Gastrocnemius, der an seinen Sehnen befestigt ist, in eine mit gekühltem PBS gefüllte Schale.

Drehen Sie den Gastrocnemius um und schälen Sie den Soleus-Muskel ab. Legen Sie den Soleus-Muskel in das Becherglas, das fünf Milliliter gekühlte Mitochondrien enthält. Isolations-Puffer.

Ein nächster Ventilator öffnete den Gastroc und entfernte die drei sichtbaren roten Muskelanteile. Es gibt zwei laterale Abschnitte und einen medialen oberflächlichen roten Streifen. Nach der Isolierung geben Sie den roten Muskel in das Becherglas mit fünf Millilitern gekühlten Mitochondrien.

Isolationspuffer eins. Entfernen Sie weitere 75 bis 100 Milligramm roten Muskel aus dem anderen Bein der Maus. Wiederholen Sie den gerade gezeigten Vorgang.

Legen Sie den präparierten Muskel aus dem zweiten Bein in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem der Protease- und Phosphatasehemmer-Cocktail und der Zelllysepuffer wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vorbereitet sind. Die zweite Probe wird sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, um sie für das Western Blotting zu verwenden. Legen Sie eine vorverheilte flache Kunststofffläche auf Eis in einen großen Eimer.

Gießen Sie dann einen Tropfen Mitochondrien-Isolationspuffer auf die Kunststoffoberfläche und legen Sie mit einer Pinzette den gesamten geschnittenen roten Muskel in ein Tröpfchen der Isolation. Puffer. Hacken Sie das Muskelgewebe zwei Minuten lang mit einschneidigen Rasierklingen, wechseln Sie alle 40 Sekunden zu einem neuen scharfen Rasiermesser. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein neues Becherglas mit fünf Millilitern frischen Mitochondrien.

Isolationspuffer eins. Nehmen Sie dann die Lösung und lassen Sie sie durch ein 100-Mikron-Zellsieb abtropfen, das auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben wird. Tupfen Sie das Gewebe mit einem feinen Wischer ab und geben Sie es dann in fünf Milliliter einer 0,05%igen Tryinlösung.

Entfernen Sie mit einer Pinzette das restliche Gewebe aus dem Aufgabenwischer und geben Sie es zum Trypsin. Inkubieren Sie das Muskelgewebe in der Trypsinlösung 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 200 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.

Gießen Sie nach der Zentrifugation das Trypsinsupinat in einen Abfallbehälter und resuspendieren Sie das Pellet mit drei Millilitern eiskaltem Mitochondrien-Isolationspuffer eins. Übertragen Sie dann das Gewebe in ein 45-Milliliter-Homogenisatorröhrchen aus Glas. Spülen Sie das konische 15-Milliliter-Röhrchen mit weiteren 1,5 Millilitern Mitochondrien-Isolationspuffer, um die verbleibende Probe zu sammeln, und geben Sie diese in das Glas-Homogenisatorröhrchen.

Legen Sie dann das Glashomogenisatorröhrchen in ein Becherglas oder einen Plastikbehälter, der zur Hälfte mit Eis gefüllt ist. Der Glashomogenisator bewegt sich also nur minimal innerhalb des Becherglases. Homogenisieren Sie die Probe mit einem Polytetrafluorethylen-Stößel, der an einem motorbetriebenen Gewebe befestigt ist.

Homogenisator mit 10 bei 80 U/min. Halten Sie die Unterseite jedes Durchgangs etwa zwei Sekunden lang gedrückt. Übertragen Sie dann das Gewebehomogenat in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie das Glashomogenisatorröhrchen mit 6,5 Millilitern Mitochondrien-Isolationspuffer eins. Gießen Sie den Puffer in das konische 15-Milliliter-Röhrchen, in dem sich der Rest des Gewebes befindet. Homogenisieren. Drehen Sie die Probe 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 700 Mal G, gießen Sie dann das Supinat vorsichtig in ein Zentrifugenröhrchen aus hochfestem Glas und entsorgen Sie das Pellet.

Als nächstes drehen Sie die Snat 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 8.000 Mal G. Um die Mitochondrien zu pelletieren, entfernen Sie die Schlinge und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie langsam 500 Mikroliter Mitochondrien-Isolationspuffer zwei hinzufügen, das Ende einer Pipettenspitze abschneiden und das Pellet im Puffer vorsichtig mit Misch- und Rührbewegungen homogenisieren. Fügen Sie dann weitere 4,5 Milliliter Mitochondrienisolierung hinzu.

Puffer zwei in die Mischung Nachdem das Pellet vollständig suspendiert ist, drehen Sie das Homogenat bei 8.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Mitochondrien erneut zu pelletieren. Entfernen Sie den S-Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, aber vollständig, indem Sie 2 25-Mikroliter-Schritte Mitochondrienisolierung hinzufügen. Puffer zwei mit einer Pipettenspitze, deren Spitze abgeschnitten ist, das Pellet nach jeder Ausgabe von 25 Mikrolitern Puffer vorsichtig umrühren und mischen.

Wenn Sie fertig sind, legen Sie diesen mitochondrialen Vorrat auf Eis. Machen Sie zwei separate Verdünnungen von einer bis 20 Verdünnungen des mitochondrialen Stammes in hochreinem Wasser. Geben Sie 0,1 % Triton 100 x zu einer Probe und beschallen Sie es 10 Sekunden lang bei niedriger Einstellung.

Die andere Verdünnung wird auf Eis gelassen und die beschallte Probe wieder auf Eis gelegt. Nach der Beschallung führen Sie dann einen Citratsynthase-Assay mit sowohl der nicht beschallten als auch der beschallten mitochondrialen Verdünnung unter Verwendung eines photometrischen Assays unter Verwendung von Standardtechniken durch und bestimmen Sie den Prozentsatz intakter Mitochondrienmembranen unter Verwendung der Gleichungen, die im begleitenden Textprotokoll bereitgestellt sind. Die Syndizierung der Mitochondrien führt zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Citratsyntase-Aktivität.

Die Citratsyntaseaktivität in nicht beschallten mitochondrialen Proben im Vergleich zu beschallten Proben zeigt, dass 92,5% der Mitochondrien nach der Isolierung der Expression von ga intakt waren. DH und COX vier sind im gesamten Gewebelysat nachweisbar, in den isolierten Mitochondrien wird die Expression von Cox vier beobachtet. Obwohl nur schwache Banden von GA DH erkennbar sind, deuten diese Befunde auf eine gute mitochondriale Isolierung mit geringer Kontamination durch nicht-mitochondriale Komponenten während des Isolierungsverfahrens hin.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den mitochondrialen Bestand mit Vorsicht zu behandeln und ihn nach diesem Verfahren niemals zu wirbeln oder kräftig zu mischen. Andere Methoden, wie die Messung der Produktion von reaktiven Spezies, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob ein Eingriff die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in isolierten Mitochondrien beeinflusst.