Name: Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Mitochondrien aus kleinen Mengen Maus-Skelettmuskel für Hochdurchsatz-Atemmessungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Sauerstoffverbrauchsrate und Arzneimittelwirkungen.

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Das Fralin Life Science Research Institute und das Metabolic Phenotyping Core an der Virginia Tech unterstützten diese Arbeit.

Tierexperimentelle Studien wurden im Rahmen einer genehmigten Protokoll von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt am Virginia Polytechnic Institute und State University. 1. Setup (Zeit: ~ 45 min) <ol><li> Tauwetter gefrorenen Filialen von 0,25% Trypsin, Isolation Puffer für Mitochondrien (IBM) 1 und IBM2 in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Spülen Sie Gläser und Sezieren Instrumente in 70% Ethanol, gefolgt von hochreinem Wasser. </li><li> Bereiten 0,05% Trypsin-Lösung von 0,25% Trypsin Lager durch Verdünnen von 1 Teil Trypsin in 4 Teilen IBM1. </li><li> Mischen Sie Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail mit Zelllysepuffer (1: 100-Verhältnis) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> Aliquots von 5 ml (5 ml / Maus) von 0,05% Trypsin in ein 15 ml Kunststoffröhrchen. </li><li> Set Motor angetrieben Gewebehomogenisator zu 80 RPM. </li></ol> 2. Isolierung der Skelettmuskulatur Mitochondrien (Zeit: ~ 90 min) <ol><li> Euthanize eine Maus mit CO 2 </sub&gt; Einatmen, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li><li> Entfernen Sie rote Muskel von der Quadrizeps und M. gastrocnemius, der die soleus (~ 75-100 mg insgesamt), wie in den folgenden Schritten beschrieben beinhaltet: <ol><li> Schälen Sie die Haut in Richtung der Maus. </li><li> Entfernen Sie die Fettpolster über der Quadrizeps-Ursprungspunkt. Schneiden Sie die Quadrizeps-Sehne, die die Kniescheibe mit feiner Spitze Schere angebracht ist. Hinweis: Der Quadrizeps durch seine anatomische Position an dem vorderen Abschnitt des proximalen Femur identifiziert. </li><li> Langsam schnippeln die Aponeurose zwischen dem Knochen und der Quadrizeps, unter Vermeidung der Oberschenkelschlagader, um die Quadrizeps aus dem Knochen zu befreien. Schneiden Sie die Sehne mit feiner Spitze Schere am Ursprungspunkt auf dem Femur um den Quadrizeps zu befreien und legen Sie die Quadrizeps in gekühltem PBS. </li><li> Entfernen Sie sichtbaren Fettgewebe in den Quadrizeps mit einer Schere. Flip Quadrizeps um, so dass der Teil des Muskels, der über den Oberschenkelknochen wurde zugewandt ist uSeite Öffnen Sie die Quadrizeps mit einer Pinzette in einem pendelnden Bewegungen. Entfernen Sie die beiden sichtbaren roten Muskelabschnitte von jedem Lappen mit feiner Spitze Schere und in ein Becherglas mit 5 ml gekühlt IBM1. Hinweis: Quadrizeps als zwei Lappen mit einem Streifen aus roten Muskel in der Nähe der Seitenkante jedes Flügels angeordnet angezeigt. </li><li> Schneiden Sie die Haut über der Achillessehne mit feiner Spitze Schere und schälen die Haut in Richtung der Maus. Schneiden Sie die freiliegenden Achillessehne und schälen die Muskeln auf den Körper der Maus. </li><li> Schneiden Sie die Sehne am lateralen und medialen Kondylen des Oberschenkelknochens mit feiner Spitze Schere, um die gastrocnemius zu befreien und legen Sie die gastrocnemius, seine Sehnen in gekühltem PBS angeschlossen. </li><li> Klappen Sie den gastrocnemius auf und ziehen Sie die Soleusmuskel und legen Sie in den Becher, die 5 ml gekühlt IBM1. Fan öffnen Sie die gastrocnemius. Entfernen Sie die drei visuellen roten Muskelabschnitte (zwei seitlichen und einem medialen oberflächliche rote Streifen) mit feinen Spitzen versehenen Scherens und übertragen diese zu dem Becherglas gegeben, 5 ml gekühlter IBM1. </li></ol></li><li> Entfernen weiteres ~ 75-100 mg von roten Muskel aus dem anderen Schenkel des Maus (wie in Schritt 2.2 beschrieben) und in einen 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und Zelllyse-Puffer (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Polyoxyethylen (9) nonylphenylether, verzweigt. Unmittelbar Blitz-einfrieren dieses zweite Probe in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung in Western Blot (siehe Schritt 6.1). </li><li> Legen Sie eine vorgekühlte, flache Kunststoffoberfläche auf Eis in einem großen Eimer. Gießen Sie einen Tropfen IBM1 auf die Kunststoffoberfläche und verwenden Pinzette, um das gesamte geschnittene rote Muskel (Schritt 2.2.4 und 2.2.7) in IBM1 Tröpfchen zu platzieren. Hackfleisch das Muskelgewebe für 2 min mit 3 Einzelklingen durch Ändern Rasierer alle 40 sec. </li><li> Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem neuen Becherglases mit 5 ml frischem IBM1, indem die Kunststoffoberfläche, über the-Becherglas und Abkratzen der Muskeln in den Becher mit einer Rasierklinge. Nutzen Sie diese Lösung und lassen es durch einen 100 &amp; mgr; m Zellsieb auf eine 50 ml konischen Röhrchen platziert. </li><li> Tupfen Sie das Gewebe mit einer heiklen Aufgabe Wischer und dann übertragen sie in 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung. Verwenden einer Pinzette, um das Gewebe von der Aufgabe Wischer zu entfernen. </li><li> Inkubieren des Muskelgewebes auf Eis für 30 min in 0,05% Trypsin-Lösung. </li><li> Spinnen Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit Trypsin / Muskel Mischung bei 200 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Gießen Sie die Trypsin-Überstand in einen Abfallbehälter und das Pellet mit 3 ml eiskaltem IBM1. Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer 45 ml Glas-Homogenisator Rohr. Mit einem weiteren 1,5 ml IBM1 Spülen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, um alle verbleibenden Proben sammeln und fügen Sie diese in die Glas-Homogenisator Rohr. </li><li> Legen Sie das Glas-Homogenisator Rohr in ein Becherglas oder Kunststoffbehälter gefüllt zur Hälfte mit Eis, so dass die Glas-Homogenisator bewegt sich minimal in das Becherglas. </li><li&gt; Homogenisieren des Gewebes / IMB1 Mischung mit den PTFE-Pistill zu einem Motor angetrieben Gewebehomogenisator mit 10 Durchgängen bei 80 UpM angebracht ist. Halten Sie den unteren Rand jeder Pass für ca. 2 Sek. </li><li> Übertragen Sie die Gewebehomogenat auf ein neues 15 ml konischen Rohr und spülen Sie das Glas-Homogenisator Rohr mit 6,5 ml IBM1. Gießen Sie die IBM1 in die 15 ml konischen Röhrchen mit Gewebehomogenat. </li><li> Spin der konischen 15 ml-Röhrchen bei 700 g für 10 min bei 4 ° C. Gießen Sie vorsichtig den Überstand in ein Glas mit hoher Festigkeit Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. </li><li> Spin der Überstand aus dem obigen Schritt bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und IBM1 resuspendieren Sie das Pellet durch langsame Zugabe von 500 ul IBM2. Schnitt das Ende einer Pipettenspitze und schonend homogenisiert das Pellet in IBM2 mit Mischen und Rühren von Bewegungen. Fügen Sie ein weiteres 4,5 ml IBM2 zu der Mischung, nachdem das Pellet vollständig aufgehängt ist. Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Verreiben, während brechen größere Pellet Stücke tsein kann die Mitochondrienmembranen beschädigen. </li><li> Spin der IBM2 / Gewebehomogenisat bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Hinweis: Dieser Schritt kann in einem sauberen hohe Festigkeit Zentrifugenröhrchen für eine genauere Quantifizierung der Protein isolierten Mitochondrien in Schritt 4, da Rest BSA wiederholen kann, um den Gesamtproteingehalt beiträgt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und sanft, aber vollständig resuspendieren Sie das Pellet durch Zugabe von zwei 25 &amp; mgr; l-Schritten IBM2 mit einer Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Vorsichtig umrühren und mischen das Pellet nach jeder Zugabe von 25 ul IBM2. Dieses mitochondriale Lager auf Eis. </li></ol> 3. Homogenisierung Whole Gewebelysat (Zeit: ~ 45 min; kann getan werden während Schritt 7) <ol><li> Entfernen Sie den Muskel aus, dass in den flüssigen Stickstoff aus dem Schritt 2.3 gelegt und bei Raumtemperatur, bis sie vollständig aufgetaut. </li><li> Hackfleisch das Gewebe für ~ 30 sec auf Eis mit feiner Spitze Schere. </li><li> Fügen Sie zwei 100 ul Kugeln Zirconium-Perlen mit dem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss aus Schritt 3.2, die das zerkleinerte Gewebe enthält. Homogenisieren des Gewebes in einer Perlmühle Gewebehomogenisator mit zwei, um drei 5-Minuten-Zyklen bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 4-6 (mittlere Einstellung). </li><li> Spin der Mischung aus Schritt 3.3 bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000 ul Pipettenspitze nach dem Spin und Transfer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet und platzieren Sie den Überstand auf Eis. </li></ol> 4. Proteinbestimmung (Zeit: ~ 30 min) <ol><li> Bestimmung der Proteinkonzentration des gesamten Gewebelysat (Schritt 3.4) und mitochondriale Lager (Schritt 2.17) unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kit nach den Angaben des Herstellers. </li></ol> 5. Mitochondrien Membranintegrität; Citratsynthase (CS) Activity (Zeit: ~ 15 min) <ol><li> Machen Sie zwei 1: 20-Verdünnungen der mitochondrialen Lager in hochreinem Wasser. Hinzufügen0,1% Triton X-100 zu einer Probe und beschallen es bei einer niedrigen Einstellung (765 Watts, Amplitude 2). Lassen Sie die anderen Verdünnung auf Eis. Bringen Sie die Probe auf Eis nach der Beschallung. </li><li> Führen Citratsynthase Assay sowohl die nicht-beschallte und beschallt mitochondrialen Verdünnungen mit einem spektrophotometrischen Test, wie zuvor beschrieben 11,12. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der intakten Mitochondrien-Membranen unter Verwendung der folgenden Gleichungen: (Non-beschallt CS Aktivität ÷ beschallt CS-Aktivität) * 100 </li></ol> 100- N (Prozent von oben erreicht) 6. Mitochondrien Isolation Qualität; Western Blot (Zeit: Nach Lab Protocol) <ol><li> Zuführen Western Blot auf die gesamte Gewebelysat und isolierte Mitochondrien, wie zuvor beschrieben 12. Anmerkung: Die Verwendung Primärantikörper für GAPDH (1: 1.000 Verdünnung in 5% BSA / TBS-T) und COXIV (1: 1.000 Verdünnung in 5% fettMilch / TBS-T), gefolgt von anti-Ziege und Kaninchen-Sekundärantikörper, die jeweils (1: 10.000). </li></ol> 7. Respirometrische Testlauf (Zeit: ~ 90 min) <ol><li> Führen Sie gewünschte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mikroplatten-basierten O 2 Verbrauchsmesstechnik, wie zuvor beschrieben (siehe Begleitartikel und Rogers et al 8). </li><li> Bestimmen Sie die Atemkontrollverhältnis (RCR) durch Division State 3 durch staatliche 4o (RCR) oder Division Staat 3U durch staatliche 4o. Verwenden Sie entweder die mittlere (durchschnittliche) Punkt oder die höchste (State 3) und die niedrigsten Preise (State 4o) von den Punkt-zu-Punkt-Spuren bei der Ermittlung RCR. </li></ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746(2011).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subjects+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol.%3A+Respir.%2C+Envir.+and+Ex.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li>
<li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+functions%2C+mitochondrial+DNA+copy+numbers%2C+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

George Rogers ist ein Mitarbeiter von Seahorse Bioscience, die das Instrument herstellen, für das dieses Protokoll modifiziert wurde.

Die hier vorgestellten Methoden liefern eine detaillierte Beschreibung eines mitochondrialen Isolierungsverfahren von minimalen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel. Dieses Isolierungsverfahren ist in der Lage, High-Functioning, reine Mitochondrien (~ 450 &amp; mgr; g) zu ergeben, wie durch O 2 Verbrauchsraten, RCR-Werte, Maximal Citrat-Synthase-Aktivität und Proteinexpression von Immunoblotting nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Mitochondrien von diesem Verfahren getrennt für mehrere respirometirc As...

Die Hauptfunktion der Mitochondrien besteht darin, ATP aus oxidativer Phosphorylierung zu produzieren. Mitochondrien haben jedoch viele andere wichtige zelluläre Funktionen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: die Produktion und Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies, die Regulierung von zytoplasmatischem und mitochondrialem Kalzium, den Organellentransport, die Ionenhomöostase und die Beteiligung an der Apoptose1,2. Daher ist es nicht verwunderlich, dass dysfunktionale Mitochondrien bei vielen Krankheitspathologien wie Alterung, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Fettleibigkeit und Diabetes eine Rolle spielen3,4. Wichtig ist, dass die Mitochondrien der Skelettmuskulatur speziell an vielen dieser Pathologien beteiligt sind3-5.
Mitochondriale Atmungsassays mit isolierten Mitochondrien ermöglichen die Beurteilung der Elektronentransportkette und der oxidativen Phosphorylierungsfunktion sowie die Bestimmung von Wirkungsmechanismen von Arzneimitteln und Proteinen, die den Stoffwechsel modulieren. Mitochondriale Isolierungsverfahren gibt es für mehrere Gewebe- und Zelltypen für eine Vielzahl von Spezies6,7. Diese Verfahren erfordern jedoch oft große Mengen an Gewebe/Zellen für eine qualitativ hochwertige Mitochondrienausbeute, die für klassische respirometrische Assays erforderlich ist. 
Mikrotiterplatten-basierte Respirometirc-Assays ermöglichen Messungen mit hohem Durchsatz mit minimalen Mengen an isolierten Mitochondrien, oft nur einige μg pro Vertiefung8. Daher stellen wir eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Methoden7 vor, um die Isolierung hochwertiger Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln für die Verwendung in Mikrotiterplatten-basierten Respiromerc-Assays zu ermöglichen. Darüber hinaus werden Methoden zur Verfügung gestellt, um die Qualität der mitochondrialen Isolationsvorbereitung und die Integrität der mitochondrialen Membranen zu bestimmen. Angesichts der Tatsache, dass die Mitochondrien der Skelettmuskulatur an vielen pathologischen Zuständen beteiligt sind, wird die Messung des O2 -Verbrauchs in mechanistisch getriebenen Studien in der biomedizinischen Forschung immer häufiger9,10.

<table><tbody><tr><td>Im Wesentlichen Fett</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Säurefrei - BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Natriumchlorid weiße Kristalle oder kristallines Pulver &ge; 99,0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Polyoxyethylen (12)-nonylphenylether, verzweigt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Single Edge Rasierklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Nylon Zellsiebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halt Protease & Phosphatinhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkonoxidkügelchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Antikörper (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti-COXIV Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4844s</td><td>Jedes mitochondriale innere Membranprotein reicht</td></tr> aus <tr><td>Peroxidase konjugiert affinipure Esel, Anti Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase konjugiert affinipure Ziege, Anti Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Brenztraubensäure, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Bei 4 Grad lagern; C, pH bis 7,4 mit KOH vor der Verwendung im respirometrischen Assay</td></tr><tr><td>Bernsteinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Bei Raumtemperatur, pH bis 7,4 mit KOH vor der Verwendung im respirometrischen Assay</td></tr><tr><td>lagern L(-) Apfelsäure, BioXtra, &ge; 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td> Lagerung <td>bei Raumtemperatur, auf 7,4 mit KOH vor der Verwendung in respirometrischen Assays</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Lagerung bei Raumtemperatur, auf 7,4 mit KOH vor der Verwendung in respirometrischen Assays, auf 7,4 mit KOH vor der Verwendung in respirometrischen Assays</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-Carnitinchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Lagerung bei -20 °C</td></tr><tr><td>Oligomycin A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Bei -20 > lagern C</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Bei 2-8 μg lagern; C</td></tr><tr><td>Phenylhydrazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (DC), Pulver [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A aus Streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Store at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-diphosphat monopotassium salt dehydrate [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Bei -20 μg lagern; C, auf 7,4 mit KOH vor der Verwendung im respirometrischen Assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr></tbody></table>

isolierung von mitochondrien von minimalen mengen an maus-skelettmuskel für die hochdurchsatz-mikroplatten-atemmessungen

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunktionalen Skelettmuskel Mitochondrien spielen eine Rolle in Zusammenhang mit der Alterung, Übergewicht und Diabetes Typ II beobachtet veränderten Stoffwechsel. Mitochondriale respirometrischen Assays aus isolierten Mitochondrien Zubereitungen erlauben die Beurteilung der Mitochondrienfunktion sowie die Bestimmung des Mechanismus (en) der Wirkung von Arzneimitteln und Proteinen, die den Stoffwechsel modulieren. Aktuelle Isolierungsverfahren erfordern häufig große Mengen von Gewebe, um qualitativ hochwertige Mitochondrien für respirometrischen Assays notwendig ergeben. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben, wie hohe Qualität gereinigt Mitochondrien (~ 450 &amp; mgr; g) von geringen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel isoliert werden für den Einsatz in Hochdurchsatz-Atemmessungen. Wir stellten fest, dass unsere Trennung Verfahren ergibt 92,5 ± 2,0% intakte Mitochondrien durch Messung Citrat-Synthase-Aktivität spektralphotometrisch. Darüber hinaus Western Blot-Analyse in isolierten Mitochondrien führte das schwache Expression des cytosolic Protein, GAPDH und die robuste Expression des mitochondrialen Proteins, COXIV. Die Abwesenheit eines bekannten GAPDH Band in den isolierten Mitochondrien indikativ für kleine Verunreinigungen von nicht mitochondrialen Quellen während des Isolierungsverfahrens. Am wichtigsten ist, die Messung des O 2 Verbrauchsrate mit Mikroplatte basierte Technologie und Bestimmen des respiratorischen Steuerungsverhältnis (RCR) für gekoppelte respirometrischen Assays zeigen hoch gekoppelt (RCR,&gt; 6 für alle Assays) und funktionelle Mitochondrien. Im Ergebnis ist die Zugabe eines separaten Zerkleinern Schritt und Motor angetrieben Homogenisierungsgeschwindigkeit eines zuvor beschriebene Verfahren erheblich reduziert ist die Isolierung von hoher Qualität und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskel, in stark gekoppelt Mitochondrien, die mit hoher Funktions respire Ergebnisse führten während auf Mikrotiterplatte respirometirc Assays.

Citrat-Synthase-Aktivität als Maß für die Unversehrtheit der Membran, da Citratsynthase ist in der inneren Mitochondrienmembran, und sollte daher nicht in Suspensionen von Mitochondrien mit intakten Membranen vorliegen. 1 stellt Citrat-Synthase-Aktivität in nicht-beschallten mitochondrialen Proben verglichen, die mit beschallter Proben aus der gleichen Isolation. Beschallen der Mitochondrien führt zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Citrat-Synthase-Aktivität (P &lt;0,01). Wichtig ist, dass 92...

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Video-Artikels besteht darin, Mitochondrien von hoher Qualität aus geringen Mengen der Skelettmuskulatur von Mäusen zu isolieren, um sie in Mikroplatten-basierten Tric-Assays zu verwenden. Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen in der biomedizinischen Forschung zu beantworten, beispielsweise wie bestimmte Arzneistoffe und Proteine den Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien in der Skelettmuskulatur beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Mitochondrien hoher Qualität aus geringeren Mengen der Skelettmuskulatur von Mäusen isoliert werden können als bisher berichtet wurde.Führen Sie die Tötung der Maus gemäß den Richtlinien der Institution durch. Anschließend positionieren Sie die Maus auf die Seite und verwenden feine Scheren, um einen Schnitt in die Haut vorzunehmen, über dem lateralen Epicondylus des Femurs.Schälen Sie die Haut in Richtung Maus und entfernen Sie dann das Fettgewebe, das über dem Ansatzpunkt des Quadrizeps liegt. Schneiden Sie anschließend das am Patella ansetzende Quadrizepssehnenband durch. Schneiden Sie langsam die aponeurotische Verbindung zwischen Knochen und Quadrizeps durch, wobei Sie die Arteria femoralis vermeiden.Schneiden Sie danach das Sehnenursprung am Femur durch, um den Musculus quadriceps zu lösen, und legen Sie den Musculus quadriceps in kaltes PBS. Entfernen Sie mit einer Schere jegliches sichtbares Fettgewebe über dem Quadrizeps. Sobald der Muskel gereinigt ist, drehen Sie den Quadrizeps um, sodass der Teil des Muskels, der zuvor über dem Femur lag, nach oben zeigt.Öffnen Sie den Quadrizepsmuskel mit einer Pinzette in Fächerform. Entfernen Sie die beiden sichtbaren roten Muskelanteile von jedem Lappen und geben Sie sie in ein Becherglas, das fünf Milliliter kaltes Isolierungspuffer für Mitochondrien enthält.Schneiden Sie anschließend die Haut über der Achillessehne mit einer feinen Schere auf und ziehen Sie die Haut in Richtung der Maus zurück. Durchtrennen Sie die freigelegte Achillessehne und ziehen Sie den Muskel in Richtung des Körpers der Maus ab. Durchtrennen Sie die Sehne an den lateralen und medialen Kondylen des Femurs, um den Musculus gastrocnemius zu lösen, und legen Sie den Musculus gastrocnemius mit anhängenden Sehnen in eine Schale, die mit kaltem PBS gefüllt ist. Drehen Sie den Musculus gastrocnemius um und lösen Sie den Musculus soleus ab. Legen Sie den Musculus soleus in den Becher mit fünf Millilitern kaltem Puffer zur Isolierung von Mitochondrien.Ein weiterer Assistent öffnete den Musculus gastrocnemius und entfernte die drei sichtbaren roten Muskelanteile. Es gibt zwei laterale Anteile und einen medialen, oberflächlichen roten Streifen. Nach der Isolierung wird das rote Muskelgewebe in den Becher mit fünf Millilitern gekühlten Mitochondrien überführt.Puffer zur Isolierung, Schritt eins. Entfernen Sie weitere 75 bis 100 Milligramm rote Muskulatur aus dem anderen Bein der Maus. Wiederholen Sie dabei den soeben gezeigten Vorgang.Legen Sie den präparierten Muskel aus dem zweiten Bein in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail sowie dem Zelllysepuffer, die gemäß der begleitenden Textanleitung hergestellt wurden. Schockgefrieren Sie die zweite Probe unverzüglich in flüssigem Stickstoff, um sie später für die Western-Blot-Analyse zu verwenden. Stellen Sie eine vorgewärmte flache Kunststoffoberfläche auf Eis in einen großen Eimer.Danach einen Tropfen Mitochondrien-Isolationspuffer auf die Kunststoffoberfläche geben und mit einer Pinzette das gesamte geschnittene rote Muskelgewebe in einen Tropfen Isolationspuffer geben. Das Muskelgewebe zwei Minuten lang mit Einweg-Klingenklingen zerkleinern, dabei alle 40 Sekunden zu einer neuen scharfen Klinge wechseln. Das zerkleinerte Gewebe in einen neuen Becher mit fünf Milliliter frischem Mitochondrien-Isolationspuffer überführen.Pufferlösung zur Isolierung. Anschließend die Lösung durch einen Zellfilter mit 100 Mikrometer Porengröße ablaufen lassen, der auf einem 50-Milliliter-Konischgefäß steht. Das Gewebe mit einem empfindlichen Abwischvlies antrocknen und dann in fünf Milliliter einer 0,05 %igen Trysin-Lösung überführen.Entfernen Sie mit einer Pinzette jegliches verbleibende Gewebe vom Arbeitsplatzwischer und geben Sie es zum Trypsin hinzu. Inkubieren Sie das Muskelgewebe 30 Minuten lang auf Eis in der Trypsin-Lösung. Zentrifugieren Sie danach die Probe bei 200 × g drei Minuten lang bei vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation das Trypsin-Supernatant in einen Abfallbehälter gießen und das Pellet mit drei Millilitern eiskaltem Mitochondrien-Isolierpuffer 1 resuspendieren. Anschließend das Gewebe in einen 45-Milliliter-Glashomogenisator geben. Den 15-Milliliter-Konusrohr mit weiteren 1,5 Millilitern Mitochondrien-Isolierpuffer 1 spülen, um verbliebene Probenanteile zu sammeln, und diese zum Glas-Homogenisatorrohr hinzufügen.Als Nächstes stellen Sie das Glas-Homogenisierrohr in ein Becherglas oder einen Kunststoffbehälter, der bis zur Hälfte mit Eis gefüllt ist, sodass sich das Glas-Homogenisierrohr im Becherglas möglichst wenig bewegt. Homogenisieren Sie die Probe mit einem an einen motorbetriebenen Gewebemischer angeschlossenen Polytetrafluoroethylen-Stößel.Homogenisator mit 10 bei 80 U/min. Den Boden jedes Durchlaufs etwa zwei Sekunden lang halten. Anschließend das Gewebepüree in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Und spülen Sie das Glas-Homogenisierrohr mit 6,5 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer eins aus. Geben Sie den Puffer in das 15-Milliliter-Konusrohr, das den Rest des Gewebes enthält. Homogenisat. Zentrifugieren Sie die Probe bei 700 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und gießen Sie anschließend vorsichtig das Überstandsgemisch in ein hitzebeständiges Glaszentrifugenrohr, während das Pellet verworfen wird.Als Nächstes die Probe 10 Minuten lang bei 8.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Um die Mitochondrien zu pelletieren, die Überstände entfernen und das Pellet aufnehmen, indem langsam 500 µL Mitochondrien-Isolierpuffer 2 zugegeben werden; schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze ab und homogenisieren Sie das Pellet vorsichtig im Puffer durch Mischen und Rühren. Anschließend weitere 4,5 mL Mitochondrien-Isolierpuffer zugeben.Puffer zwei zur Mischung. Nachdem das Pellet vollständig suspendiert ist, zentrifugieren Sie das Homogenat bei 8.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Mitochondrien erneut zu pelletieren. Entfernen Sie das Überstand-Supernatant und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, aber vollständig, indem Sie nacheinander 25 µL-Portionen des Mitochondrien-Isolierpuffers zwei hinzufügen. Rühren und mischen Sie das Pellet nach jeder Zugabe von 25 µL Puffer vorsichtig mit einer Pipettenspitze, deren Spitze abgeschnitten wurde.Wenn fertig, diesen mitochondrialen Vorrat auf Eis stellen. Bereiten Sie zwei separate Verdünnungen des mitochondrialen Vorrats im Verhältnis 1 zu 20 in hochreinem Wasser her. Geben Sie 0,1 % Triton 100 x zu einer Probe hinzu und sonifizieren Sie 10 Sekunden bei niedriger Einstellung.Lassen Sie die andere Verdünnung auf Eis und geben Sie die sonifizierte Probe zurück auf Eis. Führen Sie nach der Sonifikation einen Zitrat-Synthase-Assay mit der nicht sonifizierten und der sonifizierten mitochondrialen Verdünnung mithilfe eines photometrischen Assays unter Verwendung standardisierter Techniken durch, und ermitteln Sie den Prozentsatz intakter mitochondrialer Membranen anhand der in dem begleitenden Textprotokoll angegebenen Gleichungen. Die Sonifikation der Mitochondrien führt zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Zitrat-Synthase-Aktivität.Die Aktivität der Zitrat-Synthase in nicht sonifizierten mitochondrialen Proben im Vergleich zu sonifizierten Proben zeigt, dass 92,5 % der Mitochondrien nach der Isolierung intakt waren. Der Ausdruck von GA-DH und COX IV ist in der gesamten Gewebelysate sowie in den isolierten Mitochondrien nachweisbar. Während nur schwache Banden von GA-DH sichtbar sind, weisen diese Ergebnisse auf eine gute mitochondriale Isolierung mit geringer Kontamination durch nicht mitochondriale Bestandteile während des Isolierverfahrens hin.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den mitochondriellen Vorrat sorgfältig zu behandeln und ihn niemals zu wirbeln oder kräftig zu mischen. Andere Methoden, wie die Messung der Produktion reaktiver Spezies, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob eine Intervention die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in isolierten Mitochondrien beeinflusst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano...

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hier wird eine Quadrizeps-Muskelprobe von einem anästhesierten Schwein entnommen und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Anschließend werden die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV mittels hochauflösender Respirometrie bestimmt.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselorganellen, die eine hohe phänotypische Plastizität in der Skelettmuskulatur aufweisen. Der Import von Proteinen aus dem Zytosol ist ein kritischer Weg für die Organellenbiogenese, der für die Expansion des Retikulums und die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion unerlässlich ist.  Daher dient der Proteinimport als Barometer für die Zellgesundheit.

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Verfahren zur enzymatischen Dissoziation Oberfläche Kennzeichnung und Reinigung mittels Durchflusszytometrie von fibro / adipogene und myogenen Vorläuferzellen aus murinen Skelettmuskel.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Lernen Sie die Isolierung von Mitochondrien aus kleinen Mengen Maus-Skelettmuskel für Hochdurchsatz-Atemmessungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Sauerstoffverbrauchsrate und Arzneimittelwirkungen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

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