Studieren Mikrobielle Gemeinschaften
13. Januar 2016
Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell aufzubauen, um die Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen Bakterium und einem einzelnen Pilz zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pathogeninteraktionen zu beantworten, beispielsweise, welche Faktoren an der Kommunikation und dem zwischenartlichen „Dialog“ beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die aus diesem In-vivo-Modell gewonnenen Daten klinische Relevanz besitzen.
Um den Pilz intranasal zu verabreichen, verdünnen Sie zunächst zwei mal zehn hoch sechs KBE von C.albicans pro Milliliter in steriler PBS. Danach, nachdem Sie den Verlust des Aufstellreflexes bei einer erwachsenen hypotonen Maus bestätigt haben, saugen Sie mindestens 50 Mikroliter der Pilzsuspension in eine 200-Mikroliter-Pipette auf. Fassen Sie nun die Maus mit einer Hand und drehen Sie das Tier so, dass es auf dem Rücken liegt und der Bauch nach oben gerichtet ist.
Wenn sich die Maus in der richtigen Position befindet, stützen Sie mit dem Zeigefinger der Hand, die die Maus hält, den Kopf und halten mit dem Daumen den Kiefer geschlossen. Bringen Sie dann die Pipettenspitze nahe an die Nase des Tieres heran. Geben Sie anschließend vorsichtig einen Tropfen mit einem Volumen von 50 µL Pilz auf die Nasenöffnungen, sodass der Tropfen durch die spontane Atmung der Maus eingeatmet werden kann. Stellen Sie die Maus danach allein in einen Käfig, bis sie sich vollständig erholt hat.
Vier Tage nach der Infektion mit C.albicans rasieren Sie den Bauch des euthanasierten Tieres und desinfizieren die freigelegte Haut mit Ethanol. Öffnen Sie anschließend mit einer Schere die Haut vom Brustbein bis zum mittleren Bauchbereich. Erweitern Sie dann den Schnitt entlang des Rippenbogens beidseits der Mittellinie und klappen die Haut an beiden Seiten des Brustkorbs zurück.
Wenn der Brustkorb sichtbar ist, führen Sie einen vertikalen Schnitt beidseits des Brustkorbs in Richtung der Schlüsselbeine durch und heben mithilfe des Brustbeins die gesamte vordere Brustwand an, um Herz und Lunge sichtbar zu machen. Anschließend wird mit einer vorher mit Heparin behandelten Spritze das Herz neben der intraventrikulären Arterie durchstochen und mindestens 500 Mikroliter Blut entnommen. Stellen Sie die Blutprobe auf Eis.
Anschließend einen medianen zervikalen Schnitt anlegen, um die Trachea freizulegen. Die Faszie um die Trachea vorsichtig dissezieren und danach einen Faden unter der Trachea platzieren. Danach die Trachea mit einer modifizierten 20-Gauge-Gavagekanüle katheterisieren und die Kanüle mit dem zuvor platzierten Faden sichern.
Um eine Bronchoalveolärlavage durchzuführen, geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter eiskaltes PBS in die Lunge. Danach saugen Sie die Lavageflüssigkeit ab und überführen diese in ein zwei Milliliter fassendes Zentrifugenröhrchen, das auf Eis steht. Nachdem zwei weitere Proben à 500 Mikroliter gesammelt wurden, entfernen Sie die Lunge aus dem Brustkorb und legen ein Stück Lunge in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zur sofortigen Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.
Danach eine weitere Probe des Lungengewebes in ein vorgewogenes Hämolyseröhrchen mit PBS auf Eis geben. Abschließend einen Schnitt auf der linken Seite des Bauches durchführen. Die Milz in ein zweites Hämolyseröhrchen mit einem Milliliter PBS gewinnen und das Röhrchen auf Eis stellen.
Ein Persistenzmodell über vier Tage wird durch die intranasale Applikation von fünf mal zehn hoch fünf KBE von C.albicans pro Maus erhalten. Während dieser vier Tage nehmen die Mäuse an Gewicht zu, weisen jedoch keine Lungenschädigung auf. Mit zunehmender KBE des Inokulums nimmt jedoch auch die Lungenschädigung zu.
Die maximale Lungenschädigung wird zwischen 24 und 36 Stunden nach der Infektion beobachtet. Die bakterielle Belastung zeigt dagegen eine Abnahme um eine log-Stufe CFU pro Milliliter alle 24 Stunden, wobei eine kumulative Zunahme der bakteriellen Streuung über jeden Tag hinweg zu beobachten ist. In der Bronchoalveolärlavage von infizierten Mäusen werden Neutrophile weitgehend rekrutiert, wobei die Differenzialblutbildanalyse eine Zusammensetzung der eindringenden Immunzellen von 90 Prozent Neutrophile und 10 Prozent Makrophagen-Lymphozyten aufzeigt.
Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Analyse der Bronchoalveolärlavage durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Charakterisierung der entzündlichen Reaktion zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Kolonisation durch Pseudomonas durchführt. Vergessen Sie dabei nicht, dass die Arbeit mit lumineszierenden Candida-Formen äußerst gefährlich sein kann, und stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung zum Schutz vor Tröpfchenkontamination getroffen werden sollten.
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Übersicht
Diese Studie etabliert ein murines Modell, um die Wechselwirkungen zwischen Candida albicans und Pseudomonas aeruginosa im Kontext einer beatmungsassoziierten Pneumonie zu untersuchen. Das Modell zielt darauf ab, die komplexen immunologischen Reaktionen, die an diesen Pathogen-Wechselwirkungen beteiligt sind, aufzuklären.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Immunologie
- Pathogen-Interaktionen
Hintergrund
- In-vitro-Studien liefern Erkenntnisse über Immunantworten.
- In-vivo-Modelle sind entscheidend, um komplexe Wechselwirkungen zu verstehen.
- Beatmungsassoziierte Pneumonie ist ein bedeutendes klinisches Problem.
- Candida albicans und Pseudomonas aeruginosa sind häufige Erreger solcher Infektionen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Interaktionen zwischen einem Bakterium und einem Pilz.
- Identifizierung von Faktoren, die an der Kommunikation zwischen Arten beteiligt sind.
- Erzeugung klinisch relevanter Daten aus In-vivo-Studien.
Verwendete Methoden
- Intranasale Applikation von Candida albicans bei Mäusen.
- Verwendung eines hypotonen Mausmodells zur Beobachtung von Reaktionen.
- Beurteilung der Aufstellreflexe als Gesundheitsparameter.
- Analyse mikrobieller Interaktionen im Lungenumfeld.
Hauptergebnisse
- Entwicklung eines zuverlässigen murinen Modells zur Untersuchung von Pathogen-Interaktionen.
- Identifizierung zentraler Faktoren in der Kommunikation zwischen Candida und Pseudomonas.
- Nachweis der klinischen Relevanz des Modells.
- Erkenntnisse zur Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Modell eignet sich zur Untersuchung komplexer mikrobieller Wechselwirkungen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pathogenese der beatmungsassoziierten Pneumonie bei.
- Zukünftige Studien können auf diesem Modell aufbauen, um therapeutische Interventionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Modellierung der vom Wirt vermittelten Interaktionen zwischen Candida albicans und Pseudomonas aeruginosa in vivo schließt eine entscheidende Lücke beim Verständnis der polymikrobiellen Dynamik, die für Atemwegsinfektionen relevant ist. Dieser Ansatz ermöglicht eine mechanistische Absicherung therapeutischer Hypothesen, indem er die immunologische Komplexität und den Interaktionen zwischen Erregern erfasst, die in vitro nicht zugänglich sind. Das Modell unterstützt die Vorhersagekraft für translationsorientierte Forschung, die auf beatmungsassoziierte und chronische Lungeninfektionen abzielt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Pathogen- und Interartensignalwegen in einem physiologisch relevanten Kontext.
- Unterstützt die biologische Ent风险bewertung, indem sie die Rekrutierung von Immunzellen und inflammatorische Profile während einer Ko-Infektion aufdeckt.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung für Interventionen, die mikrobielle Wechselwirkungen oder Immunantworten modulieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes In-vivo-System für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellpopulationen und Pathogenlast.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Neutrophilen- und Makrophageninfiltration mittels Bronchoalveolärlavage.
- Ermöglicht die reproduzierbare Messung der mikrobiellen Belastung und von Gewebeschäden zur Evaluierung von Substanzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anwendung krankheitsrelevanter Modelle für chronische Lungeninfektionen und beatmungsassoziierte Pneumonien.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von antiinfektiösen oder immunmodulatorischen Strategien.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch Modellierung klinisch relevanter Pathogen-Interaktionen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses In-vivo-Modell schließt die Lücke zwischen der frühen Entdeckung und der präklinischen Forschung, indem es die Überprüfung von Hypothesen zu mikrobiellen und immunologischen Wechselwirkungen in den Atemwegen ermöglicht. Es bietet eine Plattform für die Identifizierung von Leitstrukturen und die mechanistische Risikominderung in der Infektionsbiologie.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt hypothesengeleitete Analysen von interreichweiten Pathogenwechselwirkungen und immunmodulatorischen Prozessen.
- Screening: Liefert quantitative Ergebnisse zur Pathogenlast und Rekrutierung von Immunzellen für vergleichende Studien.
- Analysen: Ermöglicht die statistische Auswertung von mikrobieller Belastung, Immunzellinfiltration und Gewebeschädigung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Modelliert klinisch relevante Infektionsszenarien zur Evaluierung von Biomarkern und Therapeutika.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare In-vivo-Plattform, die an andere polymikrobielle oder Wirt-Pathogen-Studien angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Infektionsbiologie.
- Operativer Wert: Standardisiert In-vivo-Infektionsprotokolle und immunologische Endpunkte zur Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Programmen zur Entwicklung antiinfektiöser und immunmodulatorischer Wirkstoffe.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten, die gegen polymikrobielle oder immunvermittelte Pathologien gerichtet sind.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in murinen Infektionsmodellen und der Analyse von Immunzellen.
- Benötigt Zugang zu Tierhaltungseinrichtungen, Biosicherheitsprotokollen sowie analytischer Infrastruktur für Lavage- und Gewebeprozessierung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Herstellung des Inokulums, der Infektionszeitpunkte und der Probenentnahme voraus.
- Kann je nach mikrobieller Spezies oder genetischem Hintergrund des Wirts einer Anpassung bedürfen.
- Es sind Sicherheitsvorkehrungen unerlässlich, wenn mit lumineszierenden Candida-Stämmen oder infektiösen Agenzien gearbeitet wird.
