Studieren Mikrobielle Gemeinschaften In-vivo-: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen Candida albicans Und Pseudomonas aeruginosa In den Atemwegen
13. Januar 2016
Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Modell zu erstellen, um die Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen Bakterium und einem einzelnen Pilz zu untersuchen. Diese Nachricht kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Erregerinteraktionen zu beantworten, z. B. welche Faktoren an der Wechselwirkung zwischen den Arten beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die aus diesem In-vivo-Modell generierten Daten klinische Relevanz haben.
Um den Pilz intranasal zu installieren, verdünnen Sie zuerst zwei mal zehn bis zur sechsten KBE von C.albicans pro Milliliter in sterilem PBS. Nachdem Sie den Verlust des Aufrichtreflexes bei einer erwachsenen hypotonen Maus bestätigt haben, aspirieren Sie mindestens 50 Mikroliter der Pilzsuspension in eine 200-Mikroliter-Pipette. Fassen Sie nun die Maus mit einer Hand und drehen Sie das Tier so, dass es mit dem Bauch nach oben auf dem Rücken liegt.
Wenn die Maus in Position ist, stützen Sie den Kopf mit dem Zeigefinger der Hand, die die Maus hält, und mit dem Daumen, um den Kiefer geschlossen zu halten, und bewegen Sie die Pipettenspitze nahe an die Nase des Tieres. Geben Sie dann vorsichtig einen 50-Mikroliter-Tropfen Pilz in die Nasenlöcher, so dass der Tropfen durch die spontane Atmung der Maus eingeatmet werden kann. Und legen Sie die Maus allein in einen Käfig, bis sie vollständig geborgen ist.
Vier Tage nach der Installation von C.albicans wird der Bauch des euthanasierten Tieres rasiert, gefolgt von einer Ethanolsterilisation der exponierten Haut. Als nächstes öffnen Sie mit einer Schere die Haut vom Brustbein bis zur Mitte des Bauches. Verlängern Sie dann den Schnitt entlang des Brustkorbs auf beiden Seiten der Mittellinie und falten Sie die Haut auf beiden Seiten des Brustkorbs zurück.
Wenn der Brustkorb sichtbar ist, machen Sie einen vertikalen Schnitt auf beiden Seiten der Brust in Richtung der Schlüsselbeine und verwenden Sie das Brustbein, um die gesamte vordere Brustwand zurückzulehnen, um Herz und Lunge sichtbar zu machen. Punktieren Sie dann mit einer vorheparinisierten Spritze das Herz neben der intraventrikulären Arterie und entnehmen Sie mindestens 500 Mikroliter Blut. Lege die Blutprobe auf Eis.
Machen Sie dann einen zervikalen Schnitt in der Mittellinie, um die Luftröhre freizulegen. Präparieren Sie vorsichtig die Faszie um die Luftröhre und legen Sie anschließend eine Naht unter die Luftröhre. Verwenden Sie dann eine modifizierte 20-Gauge-Sondennadel, um die Luftröhre zu katheterisieren und die Kanüle mit der zuvor platzierten Naht zu sichern.
Um eine bronchoalveoläre Lavage durchzuführen, geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter eiskaltes PBS in die Lunge ab. Saugen Sie dann die Spülflüssigkeit an und überführen Sie die Flüssigkeit in ein zwei Milliliter Zentrifugenröhrchen auf Eis. Nachdem Sie zwei weitere 500-Mikroliter-Proben entnommen haben, entfernen Sie die Lunge aus der Brust und legen Sie ein Stück Lunge in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um es sofort bei minus 80 Grad Celsius zu lagern.
Legen Sie dann ein weiteres Stück Lungengewebe in ein vorgewogenes Hämolyseröhrchen, das PBS auf Eis enthält. Zum Schluss machst du einen Schnitt in der linken Seite des Bauches. Entnehmen Sie die Milz in ein zweites Hämolyseröhrchen, das einen Milliliter PBS enthält, und legen Sie das Röhrchen auf Eis.
Ein viertägiges Persistenzmodell wird durch intranasale Installation von fünfmal zehn bis fünfter KBE von C.albicans pro Maus erhalten. Während dieser vier Tage nehmen die Mäuse an Gewicht zu, zeigen aber keine Lungenverletzungen. Mit zunehmender KBE des Inokulums nimmt jedoch auch die Lungenverletzung zu.
Die maximale Lungenschädigung wird zwischen 24 und 36 Stunden nach der Infektion beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigt die bakterielle Belastung eine Abnahme um einen log KBE pro Milliliter alle 24 Stunden, wobei eine kumulative Zunahme der bakteriellen Ausbreitung über jeden Tag beobachtet wird. In der bronchoalveolären Lavage, die von infizierten Mäusen entnommen wurde, werden Neutrophile in großem Umfang rekrutiert, wobei die differentielle Zellzahl eine 90-prozentige Neutrophilen- und 10-prozentige Makrophagen-Lymphozyten-infiltrierende Immunzellpopulation zeigt.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Analyse der bronchoalveolären Lavage, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion zu beantworten. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Kolonisation Pseudomonas aufbaut. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lumineszierendem Candida äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen von Schutzausrüstung, um eine Tröpfchenkontamination zu vermeiden, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.
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Überblick
Diese Studie etabliert ein murines Modell zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Candida albicans und Pseudomonas aeruginosa im Kontext einer beatmungsassoziierten Pneumonie. Das Modell zielt darauf ab, die komplexen Immunantworten zu klären, die bei diesen Pathogen-Interaktionen beteiligt sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Immunologie
- Pathogen-Interaktionen
Hintergrund
- In-vitro-Studien liefern Einblicke in Immunantworten.
- In-vivo-Modelle sind wesentlich für das Verständnis komplexer Interaktionen.
- Beatmungsassoziierte Pneumonie ist ein bedeutendes klinisches Anliegen.
- Candida albicans und Pseudomonas aeruginosa sind häufige Pathogene bei solchen Infektionen.
Zweck der Studie
- Ein Modell zur Untersuchung von Interaktionen zwischen einem Bakterium und einem Pilz zu entwickeln.
- Faktoren zu identifizieren, die an der interspezifischen Kommunikation beteiligt sind.
- Klinisch relevante Daten aus In-vivo-Studien zu generieren.
Verwendete Methoden
- Intranasaler Einbau von Candida albicans bei Mäusen.
- Verwendung eines hypotonischen Mausmodells zur Beobachtung von Reaktionen.
- Beurteilung des Rückstellreflexes als Gesundheitsmaßstab.
- Analyse der mikrobischen Interaktionen im Lungenumfeld.
Hauptergebnisse
- Etablierung eines zuverlässigen murinen Modells zur Untersuchung von Pathogen-Interaktionen.
- Identifizierung von Schlüsselfaktoren im Cross-Talk zwischen Candida und Pseudomonas.
- Demonstration der klinischen Relevanz des Modells.
- Einblicke in die Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Modell ist effektiv für die Untersuchung komplexer mikrobischer Interaktionen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pathogenese der beatmungsassoziierten Pneumonie bei.
- Zukünftige Studien können auf diesem Modell aufbauen, um therapeutische Interventionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Modeling host-mediated interactions between Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa in vivo addresses a critical gap in understanding polymicrobial dynamics relevant to airway infections. This approach enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by capturing immune complexity and pathogen cross-talk not accessible in vitro. The model supports predictive confidence for translational research targeting ventilator-associated and chronic lung infections.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen and interspecies signaling pathways in a physiologically relevant context.
- Supports biological de-risking by revealing immune cell recruitment and inflammatory profiles during co-infection.
- Facilitates functional target validation for interventions modulating microbial interactions or immune responses.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for downstream analysis of immune cell populations and pathogen burden.
- Enables quantitative assessment of neutrophil and macrophage infiltration via bronchoalveolar lavage.
- Supports reproducible measurement of microbial load and tissue injury for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for chronic lung infection and ventilator-associated pneumonia.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective or immunomodulatory strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling clinically relevant pathogen interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo model bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of microbial and immune interactions in the airway. It provides a platform for lead identification and mechanistic de-risking in infection biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of cross-kingdom pathogen interactions and immune modulation.
- Screening: Delivers quantitative outputs on pathogen burden and immune cell recruitment for comparative studies.
- Analytics: Enables statistical analysis of microbial load, immune infiltration, and tissue injury across experimental conditions.
- Translational Research: Models clinically relevant infection scenarios for biomarker and therapeutic evaluation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable in vivo platform adaptable to other polymicrobial or host-pathogen studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes in vivo infection protocols and immune readouts for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for anti-infective and immunomodulatory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting polymicrobial or immune-mediated pathologies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine infection models and immune cell analysis.
- Needs access to animal facilities, biosafety protocols, and analytical infrastructure for lavage and tissue processing.
- Demands cross-team standardization of inoculum preparation, infection timing, and sample collection.
- Adaptation may be needed for different microbial species or host genetic backgrounds.
- Safety precautions are essential when handling luminescent Candida or infectious agents.
