Name: Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Quorum-Quenching-Lactonasen Biofilme von Acinetobacter baumannii S1 in vitro effektiv zerstören. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Biofilm-Disruption und eröffnet neue Strategien gegen antibiotikaresistente Pathogene.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Academic Research Fund des Bildungsministeriums, des National Medical Research Council und der National Research Foundation, Singapur, unterstützt.

1. Kristallviolett Quantifizierung von Biofilm-Bildung in A. baumannii S1 <ol><li> Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB-Medium (LB) (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / L) bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden. </li><li> Stellen Sie die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte OD 600 von 0,8 auf. Verwendung eines 96-Well-Platte, zu inokulieren Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frisches LB, das 10 &amp; mgr; l gereinigtes GKL-Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 100 ul. </li><li> Bereiten Sie eine Kontrollkultur als auch, Dies hat jedoch keinerlei Enzym enthalten. Wiederholen ähnlichen Bedingungen, um die gewünschte Anzahl an Wiederholungen ergeben. </li><li> Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Die Platte bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien. </li><li> Fügen Sie eine weitere 100 ul frischem LB-Medium zu der Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 21 Stunden bei 30 ° C. </li&gt; <li> Nach der zweiten Inkubationszeit, entfernen Sie vorsichtig alle Medien. Waschen Sie die planktonischen Bakterien-Zelle mit 200 ul sterilem Wasser. Sicherzustellen, dass es nur eine minimale Störung der Zellen während des Waschvorgangs. </li><li> Fügen Sie 100 ul von 1% Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei RT. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Waschen der gut mit 200 ul sterilem Wasser. Wiederholen Sie den Waschgang für zwei weitere Male. </li><li> 100 l 33% Essigsäure in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 15 min unter leichtem Schütteln; Dies wird den Farbstoff aufzulösen. </li><li> Quantifizieren der Menge des Biofilms durch Messung der Absorption des Kristallviolett bei 600 nm ausgebildet. Die Menge an Kristallviolett, ist proportional zu der Menge an Biofilm gebildet. </li></ol> 2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie von A. baumannii S1 Biofilm <ol><li> Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden. </li><li> Anzeigenur die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte OD 600 von 0,8 auf. Mit Hilfe eines 35-mm-Glasboden μ-Dish, zu impfen die Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frischem LB, das 30 &amp; mgr; l des gereinigten GKL Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 1 ml. </li><li> Decken Sie die μ-Dish mit Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Inkubieren Sie die μ-Dish bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien. Werden 30 &amp; mgr; l gereinigtes GKL Enzym und frisches Medium, das bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml zu bringen. Inkubation für weitere 21 h bei 30 ° C. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.3 und inkubieren Sie die μ-Dish für einen weiteren 24 Stunden bei 30 ° C. Dann entfernen Sie die Medien vorsichtig. </li><li> Gib 500 ul 5 ug / ml Alex Fluo 488 konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin (WGA) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit dem μ-Geschirr gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird das gebildete Biofilm färben. Entfernen Sie die Farblösung und waschen ter u-Teller mit 2 ml HBSS. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l von 3,7% igem Formaldehyd in HBSS gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird den Biofilm auf den μ-Dish beheben. Einmal Waschen Sie die μ-Dish mit 2 ml HBSS und entfernen Sie die Lösung vollständig. Die μ-Schale mit Biofilm fixiert kann in der Dunkelheit bei 4 ° C vor dem CLSM Abbildungs ​​gespeichert werden. </li><li> Für CLSM Bildgebung und Analyse sind 63-facher Vergrößerung und 97 Stapel pro Bild mit einem Abstand von 0,21 um pro Stapel zu erzeugen. </li></ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
<li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li>
<li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li>
<li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li>
<li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion%2Fpower%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li>
<li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li>
<li>Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgarashi%2C+J+%22Quorum+Sensing%22">Quorum Sensing</a>. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).</li>
<li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li>
<li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li>
<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
<li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li>
<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In beiden Sätzen von Experiment A. baumannii S1 wurde in LB-Medium ohne NaCl weise einer hohen Salzkonzentration kann die Menge des Biofilms von den Bakterien 15 ausgebildet reduzieren kultiviert. Das Vorhandensein solcher Artefakt könnte die Menge der Biofilm gebildet, sowie die Auswirkungen der Quorum-Abschrecken Enzyme in verschiedenen Behandlungsbedingungen unterschätzen. Die Verwendung einer katalytisch inaktiven Enzym ist wichtig, da eine negative Kontrolle, die möglichen Effekte der Enzymbindu...

Behandlungsmöglichkeiten für Infektionskrankheiten durch die rasche Zunahme der Multidrug-resistenten Bakterien, die immun gegen ein breites Spektrum von Antibiotika 1 sind kompliziert. Mit hoher Morbidität und Mortalität von resistenten Bakterien-vermittelte Infektionen, gibt es einen Bedarf an Arzneimittelentwicklungsprozesse zu eskalieren und / oder entdecken bessere antibakterielle Alternativen Therapiemöglichkeiten zu verbessern. In letzter Zeit wird die anti-Virulenz Ansatz gewinnen an Interesse gegeben sein Potenzial bei der Verhinderung von Virulenz über nicht bakterizide Methoden, damit Minderung der Risiken der Resistenzmechanismen 2. Quorum-Sensing ist ein &quot;Hauptschalter&quot; in bakteriellen Virulenz und Störung dieses Signal Phänomen ist eine vielversprechende anti-Virulenz Verfahren gegen Pathogenese 3. Der Beginn der Virulenz erfordert die Ansammlung von Quorum-Moleküle in der extrazellulären Umgebung, nachdem ein kritischer bakterielle Bevölkerungsdichte erreicht ist. Wie quorum Moleküle diffundieren in die intrazelluläre Matrix, die Bindung mit ihren verwandten Rezeptoren führt zur Aktivierung von Virulenzfaktoren sowie Gene mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung 4 verbunden. Im Allgemeinen Quorum-Sensing-Störung beinhaltet Hemmung Quorum Molekül und Rezeptor-Wechselwirkung, ohne die primären Stoffwechselwege. Daher spielt es keine direkten Auswirkungen auf das Zellwachstum. Da Fitness nicht beeinträchtigt wird, es eine minimale Selektionsdruck für Bakterien zu entwickeln und zu erhalten Widerstand gegen solche Behandlungen 5. Zusätzlich kann ein Quorum-sensing Störung mit inhärenten Bakterienschutzmechanismen interferieren, wie im Fall der Bildung von Biofilmen, die Schutz gegen antibakterielle Mittel bereitstellt und Wirt-Immunantworten. Es wird geschätzt, dass 99% der Mikroben auf der Erde existieren in komplexen Biofilm artigen Matrizes verleih entscheidende Lebensvorteil für die lebenden Mikroorganismen innerhalb these Strukturen 6. Noch wichtiger ist, ist die Bildung dieser sessile Domains die Ursache der hartnäckigsten und chronischer Krankenhausinfektionen 7. Acinetobacter baumannii ist eine der wichtigsten menschlichen Krankheitserreger, die mit der globalen Krankenhausinfektionen verbunden ist und dessen Virulenz ist weitgehend auf die Quorum-Sensing zurückzuführen vermittelte Biofilmbildung 8. Quorum-Abschrecken Enzyme erfolgreich in stören Quorum-vermittelte Signaltransduktion durch gezielt eine Gruppe von Verbindungen, wie N-Acyl Homoserinlactone (AHLs), die von Gram-negativen Bakterien 9 sind bekannt dafür verwendet worden. Mehrere Studien haben auch von der Verwendung dieser Enzyme erweitert, um bakterielle Pathogenese durch die Reduktion von Virulenzfaktor Expression und Zellzahlen in Biofilmen 10,11 blockieren. Leider gibt es nach wie vor ein Mangel an greifbaren Beweis für die effektive Nutzung von Quorum-Abschrecken Enzyme gegen die Biofilmbildung durch bakterielle Erreger. dasre es Versuche, Quorum-Inhibitoren (AHL-Analoga), anstelle von Quorum-Abschrecken Enzyme verwenden, um A. zu stören baumannii Biofilmbildung 12. Obwohl diese Methode der Verwendung von kleinen Molekülen Inhibitoren ist ein gültiger Ansatz können erhalt seine Bioverfügbarkeit in der translationalen Verwendungen eine Herausforderung sein. Im Gegenteil könnte die Verwendung von katalytischen quorum Abschrecken Enzyme die Bioverfügbarkeit Problem zu umgehen, wie Enzyme sind empfänglicher gegen Immobilisierung an Oberflächen von biomedizinischen Vorrichtungen für therapeutische Wirkungen. Hier beschreiben wir eine Bewertung der Auswirkungen von gentechnisch Quorum lösch Lactonasen von Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 auf bakterielle Biofilmbildung, mit Kristallviolett-Färbung und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Diese Studie ist die erste erfolgreiche Demonstration von Biofilm Störung in einem klinisch relevanten A. baumannii S1-Stamm unter Verwendung Quorum lösch Enzyme. Beschriebenen Verfahrenin dieser Studie sind nützlich für die Beurteilung der Wirksamkeit anderer quorum Abschrecken Enzyme in nachfolgenden therapeutischen Entwicklungsbemühungen gegen pathogene gramnegative Bakterien.

<table><tbody><tr><td>Trypton &nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Crystal</td><td>Violet Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Lab-Scan</td><td>PLA00654X</td><td>Achtung: Entzündlich</td></tr><tr><td>&mu;-Schale</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-konjugiert WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s ausgewogene Salzlösung&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Vorsicht: Korrosiv &nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anti-virulenten störung der pathogene biofilme mit engineered quorum lösch lactonasen

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

Das rasche Auftreten multiresistenter Bakterien hat den Bedarf an neuartigen therapeutischen Ansätzen zur Bekämpfung lebensbedrohlicher Infektionen beschleunigt. Die Persistenz einer bakteriellen Infektion ist oft mit der Bildung von Biofilmen verbunden, die durch Quorum Sensing vermittelt werden. Die Unterbrechung dieses Signalschaltkreises stellt daher eine attraktive Anti-Virulenz-Strategie dar. Es wurde berichtet, dass Quorum-Quenching-Lactonasen wirksame Disruptoren von Quorum-Sensing-Schaltkreisen sind. Es gibt jedoch nur sehr wenige Berichte über den wirksamen Einsatz dieser Enzyme bei der Störung der Bildung bakterieller Biofilme. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Unterbrechung der Biofilmbildung in einem klinisch relevanten A. baumannii S1-Stamm durch die Verwendung einer technischen Quorum-Quenching-Lactonase. Acinetobacter baumannii ist ein wichtiger humanpathogener Erreger, der weltweit an schweren Krankenhausinfektionen beteiligt ist, und seine Virulenz wird hauptsächlich auf die Zähigkeit seines Biofilms zurückgeführt. Durch die technische Lactonase-Behandlung wurde eine signifikante Reduktion des A. baumannii S1-Biofilms erreicht. Diese Studie zeigte auch die Möglichkeit, gentechnisch veränderte Quorum-Quenching-Enzyme in der zukünftigen Behandlung von Biofilm-vermittelten bakteriellen Erkrankungen einzusetzen. Schließlich kann das Verfahren verwendet werden, um die Kompetenz vielversprechender Quorum-Quenching-Enzyme zu bewerten.

In der Kristallviolett Quantifizierung Experiment wurden zwei Quorum lösch Enzyme verwendet, um Machbarkeit stören Biofilmbildung zu demonstrieren: Wildtyp-GKL und eine verbesserte GKL Doppelmutante (E101G / R230C). Beide Enzyme wurde gezeigt, Lactonase-Aktivität gegen demonstrieren 3-Hydroxy-decanoyl-L-homoserinlacton (3-OH-C 10 -HSL), der Haupt Quorum Molekül von A. verwendet baumannii S1 14. Für gültige Beurteilung der Biofilm Unterbrechung wurd...

Quorum-Quenching-Enzyme sind antivirulente und antibakterielle Optionen, die die Pathogenese abschwächen können, ohne das Risiko einer Resistenz einzugehen, indem sie die Expression von Virulenzfaktoren und Genen verhindern, die mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung verbunden sind. In dieser Studie berichten wir über eine Methode, die die Wirksamkeit von Quorum-Quenching-Enzymen bei der Störung des bakteriellen Biofilms demonstriert.

Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wirksamkeit von Quorum-quenching-Enzymen bei der Störung bakterieller Biofilme zu demonstrieren. Diese Methode wird helfen, zentrale Fragen im Bereich der antibakteriellen Therapeutika zu beantworten und die Wirkung von Quorum-quenching-Lactonasen auf pathogene Bakterien in einem Biofilm-Milieu besser zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Quorum-quenching-Lactonasen direkt in einem In-vitro-Umfeld hinzugefügt werden können.Daher lassen sich seine Auswirkungen auf die Biofilmentfernung leicht quantifizieren. Terrence Tay, ein Techniker in unserem Labor, demonstriert dieses Verfahren. Beginnen Sie damit, eine 5-Milliliter-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator für 16 Stunden zu kultivieren.Stellen Sie die Kultur auf einen OD 600 von 0,8 ein. Verdünnen Sie die Kultur anschließend im Verhältnis 1:100 mit frischem LB, das 4 Milligramm pro Milliliter gereinigtes GKL-Enzym enthält. Geben Sie 100 Mikroliter in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Verwenden Sie die Deckel, um die Platten abzudecken, und stellen Sie sie in einen 10-Liter-Kunststoffbehälter. Versiegeln Sie den Behälter und inkubieren Sie ihn bei 30 Grad Celsius für drei Stunden, bevor Sie das Medium vorsichtig entfernen. Geben Sie weitere 100 Mikroliter frisches LB-Medium in die Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius für 21 Stunden.Nachdem das Medium vorsichtig entfernt wurde, verwenden Sie 200 Mikroliter sterilem Wasser, um die planktonischen Bakterienzellen sanft zu waschen. Positionieren Sie die Pipettenspitze am Boden der Vertiefung und entfernen Sie vorsichtig die flüssige Phase, um Störungen des Biofilms an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit möglichst gering zu halten. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter einer 1 %igen Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung, indem Sie die Vertiefungen dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern steriler Wasser waschen. Geben Sie 100 Mikroliter 33 %iger Essigsäure in jede Vertiefung und inkubieren Sie unter leichtem Schütteln für 15 Minuten, um den Farbstoff aufzulösen. Quantifizieren Sie die Menge des Biofilms durch Messung der Absorption von Kristallviolett bei 600 Nanometern.Die Menge an Kristallviolett steht in Relation zur Menge des gebildeten Biofilms. Um die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) von A.baumannii-S1-Biofilmen durchzuführen, züchten Sie eine fünf Milliliter große Kultur von A.baumannii S1 in LB bei 30 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator über 16 Stunden. Stellen Sie die Kultur von A.baumannii S1 auf einen OD 600 von 0,8 ein.Verwenden Sie anschließend frisches LB, das 1,2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes GKL-Enzym enthält, um die Kultur 1:100 zu verdünnen, und geben Sie ein Milliliter in eine 35-Milliliter-Glasboden-Mikroschale. Decken Sie die Mikroschale mit einem Deckel ab, stellen Sie sie in einen 10-Liter-Kunststoffbehälter und verschließen Sie diesen, bevor Sie die Schale drei Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach vorsichtigem Entfernen des Mediums geben Sie ein Milliliter frisches Medium mit 30 Mikrolitern gereinigtem GKL-Enzym hinzu und inkubieren anschließend weitere 21 Stunden bei 30 Grad Celsius.Entfernen Sie das Medium erneut vorsichtig und ersetzen Sie es durch ein Milliliter GKL-Enzym in frischem Medium. Inkubieren Sie 24 Stunden bei 30 Grad Celsius. Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium vorsichtig und geben 500 Mikroliter fünf Mikrogramm pro Milliliter Alexa Fluor 488-konjugiertes Weizenkeimagglutinin, gelöst in HBSS, hinzu.Inkubieren Sie die Mikroschale 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Biofilme anzufärben. Um die Biofilme zu fixieren, geben Sie 500 Mikroliter 3,7 % Formaldehyd, gelöst in HBSS, hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie die Mikroschale einmal mit zwei Millilitern HBSS und entfernen Sie die Lösung anschließend vollständig.Bewahren Sie die Petrischale vor der CLSM-Bildgebung im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf. Verwenden Sie für die CLSM-Bildgebung und -Analyse ein 63X-Objektiv, um pro Bild 97 Stapel mit einem Intervall von 0,21 Mikrometern pro Stapel zu erzeugen. Im Kristallviolett-Quantifizierungsversuch wurden der Wildtyp GKL und ein verbesserter GKL-Doppelmutant-Quorum-Quenching-Enzym zur Lactonase-Aktivität gegenüber drei Hydroxydecanoyl-l-Homoserinlacton oder 3OHC10HSL, dem wichtigsten Quorum-Molekül von A. baumannii S1, verwendet. Wie hier gezeigt, konnten beide Enzyme die Biofilmbildung in vorbehandeltem Wildtyp A. baumannii S1 signifikant reduzieren. Der Grad der Biofilmstörung durch beide Enzyme steht nicht in proportionalem Verhältnis zu ihrer Wirksamkeit gegen 3OHC10HSL.Wie in dieser Tabelle zu sehen ist, ist die Umsatzrate des mutierten GKL sechsmal höher als die des Wildtyp-GKL gegenüber 3OHC10HSL. Der Unterschied im Ausmaß der Biofilmentstörung zwischen den Enzymen beträgt jedoch nur das Zweifache. In diesem Experiment wurden das verbesserte GKL-Mutantenenzym und sein catecholylinaktives Enzym zum Vergleich verwendet.Dieses DIC-Bild zeigt, dass die Behandlung mit dem verbesserten GKL-Mutantenenzym im Vergleich zum inaktiven Enzym zu einer Verringerung der Biofilmbreite führte. Die Analyse der Fluoreszenzbilder zeigte außerdem eine Abnahme der Oberfläche, der Biomasse und der durchschnittlichen Dicke der Biofilme, wenn diese mit dem verbesserten GKL-Mutantenenzym behandelt wurden. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, ausgenommen die Inkubationszeit, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Entfernung und Störung des Biofilms während der Waschschritte so gering wie möglich zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Zellzählungen und Enzymstabilitätsassays durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Beantwortung zusätzlicher Fragestellungen, beispielsweise bezüglich der Auswirkungen von Quorum-quenching-Lactonasen auf die Zellpopulation innerhalb des Biofilms sowie deren Wirkdauer.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Infektionsbehandlung den Weg, um die Wirkung potenzieller Quorum-quenching-Lactonasen in den von pathogenen Bakterien gebildeten Biofilmen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Biofilmdestruktion mittels Kristallviolett-Färbung quantifiziert und morphologische Veränderungen im Biofilm mittels konfokaler Bildgebung beurteilt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit pathogenem Material äußerst gefährlich sein kann.Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Nutzung geeigneter Einrichtungen zur biologischen Risikokontainment getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Tay, S. B., et al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen.  J. Vis. Exp. (2016)Das Video demonstriert eine Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse in einem pathogenen Bakterium, indem unbehandelte Kontrollen mit Proben verglichen werden, die mit einem Quorum-Abschreckungsenzym behandelt wurden. Das Enzym stört die bakterielle Signalübertragung während der frühen Inkubation und verringert so die Zelladhäsion. Nach dem Waschen und...

Quantifizierung enzyminduzierter Biofilmsuppression bei pathogenen Bakterien

Quelle: Tay, S. B., et.al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen.  J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert den Prozess der Hemmung der Biofilmbildung, indem ein Enzym eingeführt wird, das die Signalübertragung der bakteriellen Zellen stört. Das Enzym verhindert, dass die Bakterien extrazelluläre polymere Substanzen produzieren, wodurch die Biofilmentwicklung auf einer Glasboden-Mikroschüssel reduziert wird. Abschließend wird die...

Mikroskopische Bewertung der enzymvermittelten Hemmung der Biofilmbildung

Diese Studie präsentiert die Entwicklung reproduzierbarer Methoden zur Untersuchung von Biofilm-Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bacillus subtilis-Vielzelligkeit.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Biofilminfektionen zeigen eine hohe Toleranz gegenüber Chemotherapien. Kein einzelner Assay erfasst die Komplexität von Biofilmen. Stattdessen werden komplementäre Assays benötigt. Wir präsentieren eine Screening-Plattform (entwickelt für S. aureus), die Assays für Viabilität, Biomasse und Biofilmmatrix kombiniert. Es ermöglicht die Entdeckung von Anti-Biofilm-Medikamenten, einschließlich der Bewertung langfristiger chemotherapeutischer Wirkungen.

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Antimikrobiell induzierte Veränderungen der Biofilmarchitektur von Pseudomonas aeruginosa unterscheiden sich zwischen klinischen Isolaten, die von Patienten mit Mukoviszidose und chronischer Lungeninfektion kultiviert wurden. Nach der konfokalen Mikroskopie kann die COMSTAT-Software verwendet werden, um Variationen in der Biofilmarchitektur (z. B. Oberfläche, Dicke, Biomasse) für einzelne Isolate zu quantifizieren und so die Wirksamkeit von Antiinfektiva zu bewerten.

Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software

Dieses Protokoll stellt die Methodik zur Durchführung von Biofilmwachstums- und Biomassemessungen unter Verwendung von selbstmontierten Tiefbrunnen-PCR-Plattengeräten für ein statisches Biofilm-Screening mit 96-Well-Deckel mit hohem Durchsatz vor.

Erzeugung größerer bakterieller Biofilm-Biomasse mit PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, der statische und dynamische Methoden kombiniert, um die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen in der Milchindustrie zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer biologischer oder chemischer Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen zu testen.

Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Thiophenesulfonamidverbindungen sind potente und spezifische Inhibitoren der Vibrio quorum sensing Regulatoren LuxR/HapR, die deren Aktivität in vivo blockieren und so die Transkription von Genen für Virulenz, Motilität und Biofilme verhindern. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Verbindungen synthetisiert, in silico modelliert und in vivo auf ihre Aktivität gegen LuxR/HapR getestet werden.

Synthese und Assay von Vibrio Quorum Sensing Inhibitoren

Das Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Violaceinproduktion durch Chromobacterium violaceum ATCC 12472 als Proxy für die Beurteilung der Quorum-Sensing-Hemmung durch bioaktive Verbindungen.

Quantifizierung von Violacein in Chromobacterium violaceum und seine Hemmung durch bioaktive Verbindungen

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere...

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Erfahren Sie, wie Quorum-Quenching-Lactonasen Biofilme von Acinetobacter baumannii S1 in vitro effektiv zerstören. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Biofilm-Disruption und eröffnet neue Strategien gegen antibiotikaresistente Pathogene.

Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen

Weitere Videos entdecken