Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen
1. Januar 2016
Quorum-Quenching-Enzyme sind antivirulente und antibakterielle Optionen, die die Pathogenese abschwächen können, ohne das Risiko einer Resistenz einzugehen, indem sie die Expression von Virulenzfaktoren und Genen verhindern, die mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung verbunden sind. In dieser Studie berichten wir über eine Methode, die die Wirksamkeit von Quorum-Quenching-Enzymen bei der Störung des bakteriellen Biofilms demonstriert.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirksamkeit von Quorum-Quenching-Enzymen bei der Zerstörung des bakteriellen Biofilms zu demonstrieren. Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der antibakteriellen Therapeutika zu beantworten und die Wirkung von Quorum-Quenching-Lactonasen auf pathogene Bakterien in einer Biofilmumgebung zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Quorum Quenching Lactonasen direkt in einer in vitro Umgebung zugegeben werden können.
Daher kann die Wirkung auf die Disruption des Biofilms leicht quantifiziert werden. Dieses Verfahren wird von Terrence Tay, einem Techniker in unserem Labor, demonstriert. Zu Beginn züchten Sie eine 5-Milliliter-Kultur von A.baumannii S1 in LB bei 30 Grad Celsius in einem Schüttelbrutkasten für 16 Stunden.
Passen Sie die Kultur auf einen OD 600 von 0,8 an. Verwenden Sie dann frisches LB mit 4 Milligramm pro Milliliter gereinigtem GKL-Enzym, um die Kultur um eins auf 100 zu verdünnen. Und geben Sie 100 Mikroliter in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
Decken Sie die Teller mit den Deckeln ab und geben Sie sie in einen 10-Liter-Plastikbehälter. Verschließen Sie den Behälter und inkubieren Sie ihn drei Stunden lang bei 30 Grad Celsius, bevor Sie das Medium vorsichtig entfernen. Geben Sie weitere 100 Mikroliter frisches LB-Medium in die Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte 21 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.
Nach dem vorsichtigen Entfernen des Mediums werden die planktonischen Bakterienzellen mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser sanft gewaschen. Positionieren Sie die Pipettenspitze am Boden der Vertiefung und entfernen Sie vorsichtig das flüssige Medium, um minimale Störungen auf dem Biofilm zwischen der Luft- und Flüssigkeitsschnittstelle zu gewährleisten. Geben Sie dann 100 Mikroliter 1%ige kristallviolette Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie die kristallviolette Lösung, indem Sie die Vertiefungen dreimal mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser waschen. Geben Sie 100 Mikroliter 33%ige Essigsäure in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie unter leichtem Schütteln 15 Minuten lang, um den Farbstoff aufzulösen. Quantifizieren Sie die Menge des Biofilms, indem Sie die Absorption von Kristallviolett bei 600 Nanometern messen.
Die Menge an Kristallviolett ist proportional zur Menge des gebildeten Biofilms. Um eine konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) von A.baumannii S1-Biofilmen durchzuführen, züchten Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur von A.baumannii S1 in LB bei 30 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator für 16 Stunden. Stellen Sie die Kultur von A.baumannii S1 auf einen OD 600 von 0,8 ein.
Verwenden Sie dann frisches LB mit 1,2 Milligramm pro Milliliter gereinigtem GKL-Enzym, um die Kultur zu verdünnen, eins auf 100, und geben Sie einen Milliliter in eine 35-Milliliter-Mikroschale mit Glasboden. Decken Sie die Mikroschale mit einem Deckel ab und legen Sie sie in einen 10-Liter-Plastikbehälter und verschließen Sie ihn, bevor Sie die Schale drei Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach vorsichtiger Entfernung des Mediums wird ein Milliliter frisches Medium mit 30 Mikrolitern gereinigtem GKL-Enzym hinzugefügt und weitere 21 Stunden bei 30 Grad Celsius inkubiert.
Entfernen Sie das Medium vorsichtig ein zweites Mal und ersetzen Sie es durch einen weiteren Milliliter GKL-Enzym in frischem Medium. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig das Medium und fügen Sie 500 Mikroliter von fünf Mikrogramm pro Milliliter Alexa Fluor 488 konjugiertes Weizenkeimagglutinin hinzu, das in HBSS gelöst ist.
Inkubieren Sie die Mikroschale 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Biofilme zu färben. Um die Biofilme zu fixieren, fügen Sie 500 Mikroliter 3,7 % Formaldehyd hinzu, das in HBSS gelöst ist, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie zwei Milliliter HBSS, um die Mikroschale einmal zu waschen, und entfernen Sie dann die Lösung vollständig.
Lagern Sie die Schale vor der CLSM-Bildgebung im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie für die CLSM-Bildgebung und -Analyse ein 63X-Objektiv, um 97 Stapel pro Bild mit einem Intervall von 0,21 Mikrometern pro Stapel zu erzeugen. Im Kristallviolett-Quantifizierungsexperiment wurden Wildtyp-GKL und ein verbessertes GKL-Doppelmutanten-Quorum-Quenching-Enzym für die Lactonase-Aktivität gegen drei Hydroxydecanoyll-L-Homoserinlacton oder 3OHC10HSL, das von A.baumanii verwendete Hauptquorummolekül verwendet S1.As hier gezeigt, beide Enzyme waren in der Lage, die Biofilmbildung in vorbehandeltem Wildtyp-A.baumanii S1 signifikant zu reduzieren. Das Ausmaß der Störung der Biofilme durch beide Enzyme ist nicht proportional zu ihrer Wirksamkeit gegen 3OHC10HSL.
Wie in dieser Tabelle zu sehen ist, ist die Umsatzrate der mutierten GKL sechsmal schneller als die von Wildtyp-GKL gegen 3OHC10HSL. Der Unterschied im Ausmaß der Störung der Biofilme zwischen den Enzymen ist jedoch nur zweifach. In diesem Experiment wurden das verbesserte GKL-mutierte Enzym und sein katecholy-inaktives Enzym zum Vergleich verwendet.
Dieses DIC-Bild zeigt, dass die Behandlung mit dem verbesserten GKL-mutierten Enzym zu einer Abnahme der Biofilmgröße im Vergleich zum inaktiven Enzym führte. Die Analyse der Fluoreszenzbilder zeigte auch, dass es zu einer Verringerung der Oberfläche, der Biomasse und der durchschnittlichen Dicke der Biofilme kam, wenn sie mit dem verbesserten GKL-mutierten Enzym behandelt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden ohne Inkubationszeit durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Entfernung und Störung des Biofilms während der Waschschritte zu minimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zellzählung und Enzymstabilitätsassays durchgeführt werden. Dies wird weitere Fragen beantworten, wie z.B. die Auswirkungen von Quorum-Quenching-Lactonasen auf die Zellpopulation innerhalb des Biofilms sowie deren Wirkungsdauer.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Behandlung von Infektionskrankheiten, um die Auswirkungen potenzieller Quorum Quenching Lactonasen im Biofilm zu untersuchen, der von pathogenen Bakterien produziert wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Biofilmzerstörung durch Kristallviolettfärbung quantifiziert und morphologische Veränderungen des Biofilms durch konfokale Bildgebung beurteilt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenem Material äußerst gefährlich sein kann.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. die Verwendung geeigneter Einrichtungen zur Eindämmung biologischer Risiken.
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Übersicht
Diese Studie zeigt die Wirksamkeit von Quorum-quenching-Enzymen bei der Zerstörung bakterieller Biofilme. Diese Enzyme dienen als anti-virulente Wirkstoffe und mildern die Pathogenese ohne das Risiko von Resistenzen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Biotechnologie
- Infektiologie
Hintergrund
- Quorum-quenching-Enzyme können die Expression von Virulenzfaktoren verhindern.
- Sie sind wirksam gegen Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung.
- Das Verständnis ihrer Rolle kann die antibakterielle Therapie verbessern.
- Diese Studie konzentriert sich auf ihre Anwendung in einer in-vitro-Umgebung.
Ziel der Studie
- Um die Wirksamkeit von Quorum-quenching-Enzymen bei der Biofilmzerstörung zu bewerten.
- Um ihr Potenzial zur Bekämpfung pathogener Bakterien zu erforschen.
- Um Einblicke in antibakterielle Therapiestrategien zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Kultur von A.baumannii S1 in LB-Medium bei 30 Grad Celsius.
- Inkubation in einem Schüttelschrank für 16 Stunden.
- Direkte Zugabe von Quorum-quenching-Lactonasen zur Kultur.
- Quantitative Bewertung der Biofilmzerstörung.
Hauptergebnisse
- Quorum-quenching-Enzyme haben bakterielle Biofilme effektiv zerstört.
- Die Methode ermöglichte eine einfache Quantifizierung der Biofilmzerstörung.
- Das Potenzial zur Reduzierung der Pathogenität in Biofilm-Umgebungen wurde gezeigt.
- Die Entwicklung neuer antibakterieller Therapien wurde unterstützt.
Schlussfolgerungen
- Quorum-quenching-Enzyme sind vielversprechende Werkzeuge in antibakteriellen Strategien.
- Sie können das Risiko von Resistenzen bei pathogenen Bakterien mindern.
- Diese Studie legt den Grundstein für zukünftige Forschung im Biofilm-Management.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Disrupting quorum-sensing-mediated biofilm formation addresses a critical bottleneck in anti-virulence drug discovery, especially for multi-drug resistant pathogens like Acinetobacter baumannii. Engineered quorum-quenching lactonases offer a mechanistically targeted approach to reduce biofilm resilience, supporting predictive confidence in early-stage anti-infective portfolios. This method enables functional validation of anti-virulence strategies, informing risk-adjusted advancement decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of quorum-sensing pathways implicated in pathogenic biofilm formation.
- Supports biological de-risking by quantifying the impact of lactonase variants on biofilm disruption.
- Facilitates functional target validation for anti-virulence mechanisms in clinically relevant strains.
- Provides a platform for triaging enzyme candidates based on quantitative biofilm reduction.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible in vitro system for evaluating quorum-quenching enzyme efficacy.
- Delivers standardized, quantitative readouts via crystal violet staining and confocal imaging.
- Enables comparative assessment of wild-type and engineered enzyme variants for screening pipelines.
- Supports scalability and platform reuse for high-throughput anti-biofilm compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by using clinically significant A. baumannii strains.
- Provides translational continuity from mechanistic discovery to preclinical anti-virulence validation.
- Informs biomarker development by correlating enzyme activity with biofilm phenotypes.
- De-risks advancement of anti-biofilm agents by quantifying functional outcomes in pathogenic systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for anti-infective R&D, bridging mechanistic validation and candidate prioritization.
- Discovery Biology: Quantifies the effect of quorum-quenching enzymes on biofilm formation, clarifying anti-virulence mechanisms.
- Screening: Provides standardized, reproducible assays for enzyme and compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative absorbance and imaging outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant biofilm models for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for evaluating diverse quorum-quenching agents across pathogenic strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in anti-virulence target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardizes biofilm disruption assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of enzyme candidates and anti-biofilm strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, enzymology, and biofilm quantitation techniques.
- Needs access to absorbance plate readers and confocal microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of washing and staining steps to ensure reproducibility.
- Adaptable to other pathogenic strains and quorum-quenching enzyme variants with protocol optimization.
- Biohazard containment and safety protocols are essential when handling clinically relevant pathogens.
