Name: Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Lernen Sie eine automatisierte modulare Hochdurchsatz-Methode zur schnellen Identifizierung mikrobieller Exopolysaccharid-Produzenten und Analyse ihrer Kohlenhydrat-Fingerabdrücke. Diese flexible Plattform beschleunigt die Polymere-Forschung erheblich.

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Wir danken Thomas Howe und Jörg Carsten herzlich für die Programmierung und technische Unterstützung bei den Liquid-Handling-Systemen.

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Wir haben nichts offenzulegen.

Polysaccharids Detektion mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren: Verschiedene Monosaccharide zeigen unterschiedliche Absorptionsmaxima und molare Extinktionskoeffizienten durch Anwendung dieser Methode 9. Daraus ergeben sich unterschiedliche Absorptionsmaxima von Polymeren, die in unterschiedlichen Mengen mehrerer Zucker enthalten. Die verschiedenen Wellenlängen der Absorptionsmaxima für 16 verschiedene handelsübliche Polymere sind in Tabelle 5 angegeben. Die Polymere gelöst (1 g / L) in ddH 2 O, gerührt (150 rpm) über Nacht und mit dem Phenol-Schwefelsäureverfahren gemessen . Diutan Gummi zeigte die niedrigsten Absorptionsmaxima bei 470 nm und Scleroglucan und Hyaluronsäure höchsten bei 484 nm. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde 480 nm für diese Screening-Plattform entschieden. Die relative Absorption der Polymere wurde auf der Basis der Absorption mit 1 g / l Glucose (eingestellt als 100%) erhalten wurde, berechnet. Die niedrigsten Ergebnisse wurden mit Scleroglucan und Succinoglycans erhalten, beide mit 92%. Dies war expektiert weil Scleroglucan nur Glucose enthält und Succinoglycan enthält Glucose und Galactose in einem Verhältnis von 7: 1. Beide kommerziellen Polymere unterschiedliche Verluste der Trocknung und unterschiedliche Aschegehalte haben, ist dies der Grund, warum der theoretische Wert von ~ 110% wurde nicht erreicht. Xylan zeigte die höchste relative Absorption bei 311%. Der Grund dafür liegt in der hohen molaren Extinktionskoeffizienten von Xylose erreicht aufgrund der dominanten Furanose Form. In einer Menge von 0,1 g / l Glucose wurde die Bestimmungsgrenze erreicht hat, sowie die Nachweisgrenze in einer Konzentration &lt;0,05 g / L. Jedoch ist die Nachweisgrenze für positive Spannungen in dem Screening von mehr als 0,7 g / L, und daher der Assay zeigte eine gute Leistung. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, die verbleibende Glucose nach Gelfiltration wurde mit einem Glucose-Assay bestimmt und dieser Wert wurde aus dem Wert aus der Phenol-Schwefelsäure-Verfahren abgezogen. Automatisierte Glucose-Assay Verdünnung: Die Leistungder Glucosebestimmung nach der Kultivierung (Verdünnung 1: 100) untersucht. Hierzu wurden 10 ul Überstand wurden auf 990 &amp; mgr; l ddH 2 O in einem tiefen Well - Platte überführt und über zehnmal gemischt Ansaugen und Abgeben von 180 &amp; mgr; l aus dieser Verdünnung. Der zweite entscheidende Schritt war die richtige Pipettieren von nur 5 ul Aliquot für die Verdünnung von 1:10 aus der Glucose-Test nach Gel-Filtration. Um die Verdünnung 25 ul ddH 2 O übertragen wurden mit einer 50 &amp; mgr; l-Spitze zu erzeugen , wurden zusammen abgesaugt zuerst, danach 20 ul ddH 2 O und 5 ul Gel-Filtrat. Dies gewährleistet eine bessere Entfernung der 5 ul-Aliquot aus der Spitze. Beide Verdünnungsschritte wurden mit verschiedenen Glukosestandards über einen Glucose-Assay überprüft. Die Ergebnisse für zwei beispielhafte Konzentrationen sind in Tabelle 6 gegeben , um die . 1: 100 - Verdünnung für die Bestimmung der Glucosegehalt nach der Kultivierung hoher Präzision für beide Standards mit einem CV &amp; # zeigten60; 1,2%. Zur gleichen Zeit wird die Genauigkeit für die höheren Standard betrug bis zu 11,6 (% Fehler). Dies ist jedoch vernachlässigbar, da die Glukose-Bestimmung nur die verbleibenden Glucosegehalt nach der Kultivierung darstellt, und daher ist nicht wichtig für die Polymerdetektion. Die Verdünnung von 1:10 für die restliche Glucose nach Gel-Filtration zeigte eine sehr zuverlässige Ergebnisse mit einem CV &lt;1,4% und einer Genauigkeit &lt;2,1% Fehler. Berücksichtigung der Verdampfung: Das Screening erfordert 3,5 Stunden aus dem ersten Schritt zu dem ersten glucose-Assays. Um zu erfahren, ob dieser Zeitrahmen einen Einfluss auf die nicht begrenzten MTP Lagerung hat, 50 ul Glucose-Test Kalibrierungsstandards wurden für 3,5 Stunden in der Roboter-Karussell mit und ohne Deckel gespeichert. Im Kalibrierungsbereich (45 bis 4,5 mg / l) die Probenkonzentration kaum erhöht. Eine Erhöhung - verursacht durch Verdunstung - lag unter 2,1% und nur für die beiden niedrigsten Konzentrationen (1,8 und 0,9 mg / l) erreichte bis zu 12,4% ( <strOng&gt; Tabelle 7). Gel-Filtration: Hohe Mengen an nicht-metabolisierten Glucose stören die quantitative Bestimmung von Glukose aus dem hydrolysierten Polymer. Daher wurde eine Gel-Filtrationsschritt erforderlich, um die verbleibende Glucose nach der Kultivierung zu entfernen. Zudem reinigt die Gelfiltration des Polymers aus Salzen und monomeren Kohlenhydratverbindungen, andere als Glucose enthaltenden Überstand, die analytische Hintergrund in der Monomer-Analyse zu minimieren. Bei dem Gel-Filtrationsschritt 35 &amp; mgr; l des Filtrats wurden in der Mitte des Bohrloches angeordnet. Zur Validierung der Robustheit der Gel-Filtration in dem automatisierten System acht Kalibrierstandards von 0,045 bis zu 9 g / l Glucose wurden filtriert (n = 8). Die Glucose jeder Konzentration wurde stets um mehr als 95% des Ausgangswertes (Tabelle 8) reduziert. so zeigte das Gel-Filtration sehr gute Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von Glucose zu tun. Zusätzlich kann die verbleibende Glucose nach Gel-ffast filtration wurde auch mit einem Glukoseassay und subtrahiert von dem Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung zu empfangen, die richtige Menge an Glucose-Äquivalent für das hydrolysierte Polymer bestimmt. Pyruvat-assay: Erstens, wurde untersucht, ob die neutralisiert und verdünnt (1:10) TFA-Matrix aus dem Hydrolyseschritt mit der enzymatischen Reaktion stört. Daher wurde die vollständige Test zweimal durchgeführt, einmal mit und einmal ohne Matrix und zeigte zuverlässige Ergebnisse. Schließlich wurde die Pyruvat - Gehalt von 16 im Handel erhältlichen Polymeren erfolgreich gemessen und ist in Figur 3 dargestellt ist . Es ist allgemein bekannt , dass nur aus diesen Polymeren 16 Succinoglycan und Xanthan natürlich Pyruvat enthalten. Mit unserem Pyruvat-Assay beide dieser Polymere wurden korrekt identifiziert. In Scleroglucan, Welangummi und Xylan Pyruvat wurde auch in signifikanten Mengen nachgewiesen. Insgesamt wurde die Fähigkeit des Ansatzes validiert und das Pyruvat-Assay showed eine hohe Leistung. Es erwies sich als in der Lage sein Pyruvat in verschiedenen Polymeren nach der Hydrolyse zu detektieren. Carbohydrate Fingerabdruck: Nach Durchführung aller analytischen Module im automatisierten Screening, potenzielle EPS Produzenten wurden für den Kohlenhydratfingerabdruckanalyse ausgewählt. Hierzu wurden mehrere Kriterien gelten: 1) Positive Beobachtung der Viskositäts nach Zentrifugation und / oder nach der Filtration. 2) Niederschlag vor und nach der Filtration. Beobachtete Fasern und Flocken wurden als positiv bewertet. 3) Glucose-Äquivalentwert aus dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren. Werte&gt; 700 mg / l wurden als positiv und Werte zwischen 300 und 700 mg / l wurden als mutmaßliche EPS Produzenten bewertet bewertet. Wenn zwei oder drei Kriterien als positiv bewertet wurden, wurden die Stämme zur weiteren Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse ausgewählt. Die Kriterien können an den individuellen Zweck der EPS - Screening (zB niedrige Viskosität EPS) angepasst werden. Unser Ansatz bei der Suche nach effici Zielent EPS Produzenten. Wenn für die Stämme zu suchen, die nur geringe Mengen an EPS die Bewertungsgrenze des Glucoseäquivalent produzieren sollte reduziert werden. Technische Nutzen und zukünftige Anwendungen: Ein interessantes Merkmal dieses Protokolls ist der modulare Charakter der Schritte und die verschiedenen Analysemodulen. Sie können auf verschiedene Weise kombiniert werden, angepasst auf die individuellen Anforderungen und neue Module leicht implementiert werden kann. Darüber hinaus können die Analysemodule separat verwendet werden, beispielsweise die Hydrolyse - Modul in Verbindung mit dem HT-PMP-Derivatisierung Modul kann eine monomere Zusammensetzungsanalyse von verschiedenen Polymerlösungen (1 g / l) in 96-Well - Format durchzuführen. Für Laboratorien, ohne die vollständige Abschirmung manuell Zugriff auf ein Flüssigkeitshandhabungssystem, ohne Änderungen in dem Pipettierschema gehandhabt werden kann. Jedoch ein Flüssigkeitshandhabungssystem erhöht den Durchsatz bis zu 768 Stämmen (anstelle von 192 Stämmen wenn Screened manuell) pro Tag. Das Protokoll , das hier beschrieben wird , ist in der Lage ein Screening für verschiedene Gattungen und daher für das Screening von großen Stammsammlungen neuartige EPS Hersteller zu identifizieren und deren Kohlenhydrat - Fingerabdrucks analysiert in einem Ansatz (Abbildung 4). Weiterhin ist ein gezieltes Screening für Polysaccharide mit seltenen Zucker wie Fucose, können Uronsäuren oder sogar unbekannte Zucker über die detaillierte Monosaccharid-Analyse durchgeführt werden. Außerdem können verschiedene Zuckerkombinationen in definierten Verhältnissen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die einfache Identifizierung von strukturell verwandten Varianten bereits bekannter EPS oder neuartige EPS.

Mikrobielle Exopolysaccharide (EPS) sind eine strukturell sehr heterogene Gruppe von Polymeren, die verschiedene biologische Funktionen erfüllen. Sie sind meist aus komplexen Wiederholungseinheiten aufgebaut, die von verschiedenen Arten von Monomeren (Zucker, Zuckerderivate, Zuckersäuren) auszeichnen, die Bindungen zwischen den Monomeren und deren Substitutionen. Die strukturelle Vielfalt von mikrobiellen Polysacchariden verleiht eher unterschiedlichen Eigenschaften an die Mitglieder dieses Moleküls Klasse, die in verschiedenen Bereichen wie Lebensmittel 1, Kosmetika 2,3 ihre Anwendung ermöglicht es , bauchemische 4 oder Wasseraufbereitung 5. Zur Erweiterung auf dem Gebiet der Anwendung dieser biobasierten und so eine nachhaltige Polymere die Identifizierung von neuen natürlichen mikrobiellen Polysacchariden sowie das Engineering von Strukturvarianten vielversprechende Ansätze darstellt. So oder so, ein schnelles Screening-Verfahren ist erforderlich, schnell eine große Anzahl von Mikrobenstämme für thei scannenr Polysaccharid-Bildung und ihre Produkte zu analysieren. Daher haben wir kürzlich eine 96-Well - HT-Screening - Plattform für die Analyse von mikrobiellen Polysaccharid - Produktion aus natürlichen Isolaten oder künstlich Stammvarianten entwickelt, die die Identifizierung der monomeren Zusammensetzung umfasst 6. Die Anwendung dieser Plattform für einen ersten Screeningrunde von ~ 500 natürlichen Isolaten konnten wir nur etwa 10 bis 20% der isolierten Stämme zu identifizieren, in der Lage, EPS zu produzieren (Daten nicht gezeigt). Dies bedeutet, dass 80-90% der analysierten Stämme produzieren nicht EPS unter den Bedingungen angewendet wird, und daher wird eine weitere Analyse des Fingerabdrucks detaillierten Kohlenhydrat war nicht erforderlich. Da diese hochentwickelte Identifizierung der monomeren Zusammensetzung ist ein zeitaufwendiges Verfahren, insbesondere für die Datenanalyse, eine schnelle Vor-Screening-Verfahren mit den Stämmen positiv in EPS Produktion zu identifizieren, würde die Effizienz drastisch erhöhen. Weiterhin Reagenzien,Verbrauchsmaterialien und Messzeit an der UHPLC-UV-ESI-MS würde reduziert werden. Darüber hinaus werden die verschiedenen Analysemodule, während einerseits die Methode sehr zuverlässig machen, sind auf der anderen Seite die manuelle Handhabung von mehr als zwei 96-Well-Platten parallel zu komplizieren, und als solche, das volle Potenzial des Verfahrens beschränken. Aus diesen Gründen haben wir uns entschlossen, ein automatisiertes Screening-Plattform zu entwickeln. Daher kombinierten wir die modularen Format des vorhandenen Kohlenhydratfingerabdrucktechnik mit einem vollautomatischen Schnellnachweisverfahren der Gesamtzuckergehalt, bezogen auf die Absorptionsmessung. Das Phenol-Schwefelsäure-Methode stellt immer noch das Mittel der Wahl für die schnelle Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalt von bakteriellen und pflanzlichen Polysacchariden 7,8. Diese Methode wurde erstmals von Dubois et al. 9 und für verschiedene Anwendungen und Probengrößen angepasst, auch bei kleinen Maßstab in 96-Well - Platten 10,11. Die phenol-Schwefelsäureverfahren misst die Gesamtkohlenhydratgehalt um einen Wert, Summieren aller monomeren, oligomeren und polymeren Kohlehydraten der Proben. Unter diesen Aspekten Rechnung zu tragen, ist die Wahl eines geeigneten Kultivierungsmedium wichtig, diese Methode anzuwenden. Komplexen Medien oligomeres oder polymeres Kohlenhydratverbindungen wie Hefeextrakt könnte zu einer veränderten Polymergehalt führen und daher unbedingt vermieden werden sollte. Weiterhin werden als C-Quelle für die Kultivierung der Stämme hohe Mengen an Zuckern verwendet. Hohe Konzentrationen von restlichen Kohlenhydrate aus dem Kultivierungsprozess könnte negativ mit der Messung des EPS-Gehalt stören. Daher wird die Verwendung von definierten und reine Zucker empfohlen. In unseren Experimenten verwendeten wir Glukose zur Kultivierung der Zellen. Der verbleibende Glucose nach der Kultivierung wurde über eine Gelfiltration verringert und über einen Glucose-Assay bestimmt. Schließlich ist die Glucose äquivalents der Polysaccharide wurden durch Subtrahieren der verbleibenden Glucose nach der Gel-Filtration von der Gesamtkohlenhydratgehalt berechnet, die mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren nachgewiesen worden war. Gel-Filtration und Glucose-Assay in Kombination mit dem Phenol-Schwefelsäure-Methode zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten und imstande sind, das erste, vollständig automatisierte Erfassungssystem ist. Zwei neue Analysemodule wurden in der automatisierten Screening-Plattform enthalten, die Menge von Informationen von dem EPS-Erkennungssystem zu erhöhen: die Fällung und die Beobachtung einer Erhöhung der Viskosität. Viele verschiedene EPS - zB Succinoglycans, Xanthan und Kolon - Säure 12 - berichtet , mit einem nicht-Kohlenhydrat - Pyruvat - Ketal auf Zucker Positionen C4 und C6 modifiziert werden. Diese Pyruvat Ketale (wie Succinyl Halbester und Uronsäuren) tragen zur polyanionische Natur und daher auf die physische properties des Polymers durch über zweiwertige Kation Brücken 13 zusammenwirkt. Um diese speziellen Polymere die Bestimmung von Pyruvat zu identifizieren wurde als ein weiteres zusätzliches Analysemodul etabliert. Dadurch erhöht sich die Information über die Polysaccharid-Substituenten und ihre möglichen makroskopischen Eigenschaften. sowie eine schnelle und effiziente Bestimmung der EPS-Hersteller alle Module Kombination ermöglicht die Identifizierung verschiedener EPS. Durch diesen Ansatz kann die Screening - Plattform in zwei Hauptteile (1) aufgeteilt werden. Im Rahmen der automatisierten Screening (Teil I) tritt der Workflow vollautomatisiert (Tabelle 1) , um schnell die EPS - produzierenden Stämme vorgewählt werden . Das Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse (Teil II) bestimmt quantitativ die Monomerzusammensetzung der durch den vorgewählten Stämme produzierten EPS. Dadurch wurde die Datenanalyse minimiert, um das Screening von großen Stammsammlungen zu optimieren. Diesbietet die Möglichkeit, 384 Stämme in einem einzigen automatisierten Screening-Lauf und mit zwei Läufen zu analysieren, die pro Tag von 768 Stämme pro Tag möglich sind. Darüber hinaus gibt der Kohlenhydrat-Fingerprint-Analyse einen noch detaillierteren Überblick über alle identifizierten EPS. Dies ermöglicht die gezielte Analyse und Identifizierung von nur leicht unterschiedlichen EPS-Varianten oder ganz neue im Vergleich zu den bereits beschriebenen chemischen Strukturen von EPS.

<table><tbody><tr><td>96 Well Deep-Well-Platte 2,0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Hauptkultur (CP 1-1 bis 1-4), Äquilibrierungsplatten für die Gelfiltration (CP 1-6, 1-7, 2-6 und 2-7), 1:100 Verdünnung für den Glukose-Assay (CP 4-1 bis 4-4) mit 990&nbsp; &Mikro; l aus ddH2O</td></tr><tr><td>Atmungsaktive Siegelfolie</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>Inkubationsfolie für Vor- und Hauptkulturen DWP</td></tr><tr><td>Aluminium-Siegelfolie</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg; C Aufbewahrungsfolie für Glycerin-Lagerplatten</td></tr><tr><td>MCA96 Nested Disposable Tips 200 & micro; l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>Arbeitstischposition (WTP 2-1 bis 2-4)</td></tr><tr><td>A/B Glas-Filterplatte 1&nbsp; &Mikro; m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>Lagerung auf einer Kollektorplatte (CP 2-1 bis 2-4)</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>Kollektorplatte für Filtrationsplatte (CP 2-1 bis 2-4)</td></tr><tr><td>96-Well-SpinColumn G-25</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5612</td><td>Lagerung auf Waschplatte DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 und 2-7)</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>Auffangplatte für Gel-Filtrationsplatte (CP 3-1 bis 3-4)</td></tr><tr><td>Nested Einweg-Spitzen SBS 50 & micro; l Spitzen</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>Karussellposition (CP 4-6, 4-7 und 5-1 bis 5-6)</td></tr><tr><td>Rinne 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Wasser WTP 1-1, Glukoseassay Reagenzien-Mix WPT 1-2, Ammoniumacetat-Puffer pH 5,6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte F-Boden (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Fällung 1 (CP 6-1 bis 6-4), pH-Wert (CP 7-1 bis 7-4), Fällung 2 (CP 8-1 bis 8-4), Phenol-Schwefelsäure-Methode (CP 8-5 bis 8-8), Glukose-Assay (CP 9-1 bis 9-9), Dummy-Platten (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>96-Well-Silikonkappenmatte;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>Abdeckmatte für MTP</td></tr><tr><td>200 & micro; l Pipettenspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>Für die manuelle Handhabung</td></tr> von <tr><td>1.000 & Mikro; l Pipettenspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>Für die manuelle Handhabung</td></tr> von <tr><td>96-Well-PCR-Mikrotiterplatten&nbsp;</td><td>Marke</td><td>781350</td><td>Hydrolyse, PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>TPE (thermoplastisches Elastomer) Deckelmatte&nbsp;</td><td>Marke</td><td>781405</td><td>Hydrolyse, PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Filterplatte 0,2&nbsp; &Mikro; m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>Filtration von Proben für die UHPLC-ESI-MS-Analyse mit einer MTP-Auffangplatte</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen LHS 5-300&nbsp; &Mikro; l</td><td>Marke</td><td>732150</td><td>Marke LHS System</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>Glukose-Assay</td></tr><tr><td>Meerrettich-Peroxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Glukose-Assay, Pyruvat-Assay</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)-diphenylamin-Natriumsalz)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Pyruvat-Assay</td></tr><tr><td>Pyruvatoxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Pyruvat-Assay</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat dibasisch</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Pyruvat- und Glukose-Assay</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Pyruvat- und Glukose-Assay</td></tr><tr><td>Thiaminpyrophosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Pyruvat-Assay</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Pyruvat-Assay</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>Fällung</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>Phenol-Schwefelsäure-Verfahren</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Phenol-Schwefelsäure-Verfahren</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Hydrolyse</td></tr><tr><td>Ammoniumlösung</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>Hydrolyse, PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Hydrolyse, PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Phenol rot &nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>Hydrolyse, PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Methanol LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Acetonitril LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP-Derivatisierung</td></tr><tr><td>Methylrot</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>pH-Wert</td></tr><tr><td>Robotergestütztes Liquid-Handling-System&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>Aufbau des Arbeitstisches in Abbildung 2Liquid-Handling-Station</td></tr> <tr><td>LHS</td><td>Marke</td><td>709400</td><td>Aufbau des Arbeitstisches in Abbildung 2</td></tr><tr><td>Tip-Adapter</td><td>Brand</td><td>709434</td><td>Aufbau des Arbeitstisches in Abbildung 2</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&nbsp; &Mikro; l</td><td></td><td>Arbeitstischaufstellung 709416 Marke in Abbildung 2</td><td></td></tr><tr><td>Adapter 60 mm</td><td>Fabrikat</td><td>709430</td><td>Aufstellung des Arbeitstisches in Abbildung 2</td></tr></tbody></table>

automatisierte modular high throughput exopolysaccharid screening-plattform mit hochsensiblen carbohydrate fingerabdruck-analyse gekoppelt

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Viele Mikroorganismen sind in der Lage zu erzeugen und zu sekretieren Exopolysaccharide (EPS), die wichtige Auswirkungen in medizinischen Bereichen, Lebensmittelanwendungen oder in den Ersatz von petro basierten Chemikalien haben. Wir beschreiben ein analytisches Plattform auf einem Flüssigkeitshandhabungssystem automatisiert werden, die eine schnelle und zuverlässige Analyse des Typs und der Menge an EPS von Mikroorganismen hergestellt werden können. Es ermöglicht dem Benutzer, neue natürliche mikrobielle Exopolysaccharid Hersteller zu identifizieren und die Kohlenhydrat Fingerabdrucks der entsprechenden Polymere innerhalb eines Tages in Hochdurchsatz (HT) zu analysieren. Mit Hilfe dieser Plattform, Stammsammlungen sowie Bibliotheken von Stammvarianten, die in technischen Ansätzen gewonnen werden könnten kann gescreent werden. Die Plattform hat einen modularen Aufbau, der eine Trennung des Protokolls in zwei Hauptteile ermöglicht. Erstens gibt es ein automatisiertes Screening-System, das verschiedene Polysaccharid Detektionsmodule kombiniert: a semi-quantitative Analyse von viscosity Bildung über einen Zentrifugationsschritt, einer Analyse der Polymerbildung durch Alkoholfällung und die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalts über eine Phenol-Schwefelsäure-Transformation. Hier ist es möglich, bis zu 384 Stämme pro Lauf zu screenen. Der zweite Teil enthält eine detaillierte Monosaccharid-Analyse für alle ausgewählten EPS Produzenten im ersten Teil die von zwei wesentlichen Module kombinieren: die Analyse der gesamten Monomerzusammensetzung über ultra Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit UV-und Elektrospray-Ionisations-Ionenfalle Erkennung ( UHPLC-UV-ESI-MS) und die Bestimmung von Pyruvat als Polymer Substituent (Vorhandensein von Pyruvat-Ketal) durch enzymatische Oxidation, die zu einer Farbbildung gekoppelt ist. Alle analytischen Module dieser Screening-Plattform kann auf unterschiedliche Weise und angepasst auf die individuellen Anforderungen kombiniert werden. Zusätzlich können sie alle mit einer Flüssigkeitshandhabungssystem oder manuell durchgeführt gehandhabt werden. Dadurch wird das Screening plaTForm ermöglicht eine enorme Flexibilität, um verschiedene EPS zu identifizieren.

Wir präsentieren eine automatisierte modulare Hochdurchsatzmethode zur Identifizierung und Charakterisierung von mikrobiellen Exopolysacchariden in kleinem Maßstab. Diese Methode kombiniert eine schnelle Vorselektion zur Analyse der Gesamtmenge an sezernierten Polysacchariden mit einem detaillierten Kohlenhydrat-Fingerabdruck, um ein schnelles Screening von neu isolierten Bakterienstämmen oder ganzen Stammsammlungen zu ermöglichen.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist das schnelle und zuverlässige Screening auf mikrobielle Exopolysaccharid-Produzenten und die Identifizierung ihres Kohlenhydrat-Fingerabdrucks. Dies ist ein wesentlicher Schritt, um die unerforschte Vielfalt der Exopolysaccharide zu nutzen. Unsere Methode kann dazu beitragen, die Polymerforschung auf dem Gebiet der mikrobiellen Exopolysaccharide zu beschleunigen.Es ermöglicht die schnelle Identifizierung neuartiger Polysaccharidvarianten mit unterschiedlichen Eigenschaften für spezifische Anwendungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kombination verschiedener Exopolysaccharid-Detektionssysteme in einem modularen und vollständig automatisierten Screening-Konzept. Das macht es extrem schnell und zuverlässig.Diese Technik kann auch manuell in Laboren durchgeführt werden, in denen keine Automatisierungsplattform zur Verfügung steht, wodurch ihr Einsatz sehr flexibel ist und an unterschiedliche Screening-Anforderungen angepasst werden kann. Diese Exopolysaccharid- oder EPS-Screening-Plattform verfügt über einen modularen Aufbau, der eine Trennung des Protokolls in zwei Hauptteile ermöglicht: automatisiertes Screening und Kohlenhydrat-Fingerabdruck. Die erste Aufgabe besteht darin, die Stämme für das Screening zu kultivieren und die Zellen durch Zentrifugation zu entfernen.Die Stämme werden auf Glukose als Kohlenstoffquelle in 96-Well-Platten kultiviert, die mit atmungsaktiver Versiegelungsfolie auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei 30 Grad Celsius und 1.000 U/min bedeckt sind. Bereiten Sie am Tag des Bildschirms den Roboterarbeitstisch und das Lagerkarussell vor, wie im Protokolltext beschrieben. Entfernen Sie die atmungsaktive Siegelfolie von den Platten und ordnen Sie die Hauptkulturen in den Karussellpositionen 1-1 bis 1-4 an.Starten Sie das automatisierte Roboterprogramm. Um Zellen nach der Kultivierung zu entfernen, überführen Sie die Deep-Well-Platten der Hauptkultur aus dem Karussell in die Zentrifuge und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 4.300 x g und 20 Grad Celsius. Für die Fällung vor der Filtration bewegen Sie die Mikrotiterplatten sowie die Mikrotiterplatten des pH-Indikators vom Karussell auf den Arbeitstisch.Übertragen Sie auch die Filterplatten, die die vollständige Entfernung aller Bakterienzellen gewährleisten, zusammen mit den Kollektorplatten an ihre Arbeitstischpositionen. Nach der Zentrifugation werden 180 Mikroliter des Hauptkulturüberstands auf die Filtrationsplatte überführt. 150 Mikroliter aus dem Überstand der Hauptkultur aspirieren und 50 Mikroliter zur Fällung vor der Filtration in die Mikrotiterplatte und 100 Mikroliter in die pH-Indikatorplatte geben.Die Fällung des Überstands mit 2-Propanol wird durchgeführt, um die EPS-Produktion zu beurteilen. Verwenden Sie eine mehrstufige 12,5-Milliliter-Pipette, um manuell 150 Mikroliter 2-Propanol in jede Vertiefung zu geben. Nachdem Sie die Mikrotiterplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 900 U/min geschüttelt haben, beobachten Sie visuell Faser- oder Flockenbildungen, die auf eine EPS-Produktion hinweisen.Nachdem die Hauptkulturplatten wieder im Karussell gelagert wurden, untersuchen Sie die Fermentationsbrühen, die nach der Zentrifugation eine verminderte Sedimentation aufweisen sollten. Die Erhöhung der Viskosität ist ein weiteres Indiz für die EPS-Produktion. Die zweite Aufgabe besteht darin, die vollständige Zellentfernung aus der viskosen Fermentationsbrühe über eine 96-Well-Filtration sicherzustellen.Zentrifugieren Sie die Filtrationsplatten bei 3.000 x g und 20 Grad Celsius für 10 Minuten. Bringen Sie dann die Platten wieder in ihre Karussell-Ausgangsposition und führen Sie die Äquilibrierung der Gelfiltration durch, wie im Protokolltext beschrieben. Pipettieren Sie anschließend 35 Mikroliter Filtrat in die Mitte der äquilibrierten Gelfiltrationsplatte und 50 Mikroliter in die Mikrotiterplatte, die für die Fällung verwendet wird.Bewegen Sie die Gelfiltrationsplatten in die Zentrifuge und bewegen Sie alle anderen Platten vom Arbeitstisch zurück in die Ausgangspositionen im Karussell. Nach der Lagerung aller Platten wieder im Karussell sind die hochviskosen Überstände zu beachten, die durch Rückstände in der Filterplatte angezeigt werden. Ein Mangel an Filtrat kann in den folgenden Analysemodulen zu falsch negativen Ergebnissen führen.Die dritte Aufgabe beim automatisierten Screening ist die Entfernung der restlichen monomeren Zucker aus dem Wachstumsmedium über eine 96-Well-Gelfiltration. Zentrifugieren Sie die Gelfiltrationsplatten bei 1.000 x g und 20 Grad Celsius für zwei Minuten. Bereiten Sie den Arbeitstisch über den Robotermanipulator für die Verarbeitung der Gelfiltrate vor.Um die verbleibende Glukose nach der Gelfiltration zu detektieren, verwenden Sie 50-Mikroliter-Spitzen, um 25 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser auf eine frische Mikrotiterplatte zu übertragen. Aspirieren Sie 20 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser, fünf Mikroliter Luft und 5 Mikroliter Gelfiltrat und geben Sie es in dieselbe Platte. Nehmen Sie 200-Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 50 Mikroliter Glukose-Assay-Reagenzien-Mischung aus den Positionen 1-2 des Arbeitstisches, um den ersten Assay zu starten.Schieben Sie die Mikrotiterplatten in den Inkubator. Bewegen Sie die Platten nach 30 Minuten Inkubation aus dem Inkubator in den Mikrotiter-Reader und zeichnen Sie die Absorption bei 418 und 480 Nanometern auf. Um den Gesamtkohlenhydratgehalt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode zu bestimmen, pipettieren Sie 20 Mikroliter Gel-Filtrat auf die Mikrotiterplatten.Entnehmen Sie die Platten manuell aus dem Karussell und legen Sie sie in die Liquid-Handling-Station. Die Kalibrierplatte mit 20 Mikrolitern unterschiedlicher Glukosekonzentrationen in dreifacher Ausführung enthalten. Stellen Sie einen Abfallbehälter auf Position 1, eine 300-Mikroliter-Tippbox auf Position 2 und eine 250-Milliliter-Wanne mit 110 Millilitern frisch zubereiteter Phenol-Schwefelsäure auf Position 3.Verwenden Sie eine 8-Kanal-Pipette mit 300-Mikroliter-Spitzen, um 180 Mikroliter Phenol-Schwefelsäure in jede Reihe aller Platten zu übertragen. Alle Mikrotiterplatten mit Deckeln abdecken und durch Schütteln fünf Minuten bei 900 U/min bei Raumtemperatur mischen. 35 Minuten bei 80 Grad Celsius in einem Ofen für die Farbreaktion inkubieren.Nach dem Abkühlen der Platten unter einem Abzug messen Sie die Extinktion bei 480 Nanometern. Stämme aus dem automatisierten Screening werden als EPS-positiv bezeichnet, wenn sie mindestens zwei der folgenden drei Kriterien erfüllen. Viskositätskontrolle, Nachweis von Polymer und berechnetes Glukoseäquivalent.Das Glukoseäquivalent wird anhand dieser Gleichung berechnet. Der Kohlenhydrat-Fingerabdruck der Screening-Plattform enthält die letzten drei Aufgaben, die manuell ausgeführt werden. Das verbleibende Filtrat der positiven Treffer aus Aufgabe zwei bildet die Grundlage für das Gel-Filtrat in Aufgabe fünf.Aufgabe sechs ist die 96-Well-Mikrohydolyse des Gelfiltrats. Um dies zu erreichen, verwenden Sie zunächst eine 12-Kanal-Pipette mit 50 Mikrolitern, um 20 Mikroliter Gel-Filtrat auf eine neue PCR-Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine 1,25-Milliliter-Mehrstufenpipette, um 20 Mikroliter vier molare Trifluoressigsäure in jede Vertiefung zu geben.Decken Sie die PCR-Platte mit einer Deckmatte aus thermoplastischem Elastomer ab und legen Sie die PCR-Platte in eine spezielle Klemmvorrichtung. Mischen Sie die Lösungen, indem Sie die Spannvorrichtung 10 Mal umdrehen. Nachdem Sie die PCR-Platte zentrifugiert und in der Spannvorrichtung fixiert haben, legen Sie die gesicherte Spannvorrichtung in ein vorgewärmtes Sandbad und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 121 Grad Celsius.Fügen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette von 200 Mikrolitern eine 3,2%ige Ammoniaklösung hinzu, um den pH-Wert auf etwa acht einzustellen. Decken Sie die PCR-Platte mit einer Deckmatte aus thermoplastischem Elastomer ab und schütteln Sie sie manuell mit der Klemmvorrichtung. Die letzte Aufgabe besteht darin, den Kohlenhydrat-Fingerabdruck mit der Hochdurchsatz-1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (HTPMP)-Methode zu analysieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette mit 50 Mikrolitern, um 25 Mikroliter des neutralisierten Hydrolysats auf eine frische PCR-Platte zu übertragen. Fügen Sie 75 Mikroliter Derivatisierungs-Reagenzien-Mischung hinzu und decken Sie die Platte mit einer thermoplastischen Elastomer-Deckmatte ab. Legen Sie die PCR-Platte für 100 Minuten bei 70 Grad Celsius in einen PCR-Cycler, anschließend kühlen Sie sie auf 20 Grad Celsius ab.Übertragen Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot in eine neue Mikrotiterplatte und fügen Sie dann mit einer 12-Kanal-Pipette von 200 Mikrolitern 130 Mikroliter 19,23 millimolare Essigsäure zu jeder Leitung hinzu. Mischen Sie direkt durch Aspirieren und Dispensieren mindestens sechsmal und geben Sie die gesamte Flüssigkeit auf eine 0,2-Mikrometer-Filterplatte mit einer Mikrotiter-Kollektorplatte. Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1.000 x g, entfernen Sie die Filterplatte und versiegeln Sie die Mikrotiter-Kollektorplatte mit einer Silikonkappenmatte.Legen Sie die Mikrotiterplatte in das UHPLC-UV-ESI-MS zur Bestimmung des Kohlenhydrat-Fingerabdrucks. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von drei exemplarischen neuartigen Stämmen, die mit dieser Screening-Plattform erfolgreich identifiziert wurden. Im linken Teil der Tabelle sind die Ergebnisse der automatisierten Screening-Module zur Viskositätsbildung, zur Polymerherstellung und zum Glukoseäquivalent aus der Gesamthydrolyse dargestellt, die als Auswertungsparameter für die detaillierte Kohlenhydrat-Fingerprint-Analyse herangezogen wurden.Der Kohlenhydrat-Fingerabdruck auf Basis von kalibrierten Zuckern sowie unbekannten Zuckern, Dimeren und Substituenten ist im rechten Teil der Tabelle angegeben. Mit Hilfe dieser Informationen kann die monomere Zusammensetzung berechnet und mit bereits bekannten Polymerstrukturen verglichen werden. Darüber hinaus kann ein gezieltes Screening auf interessante monomere Zusammensetzungen und seltene Kohlenhydrate durchgeführt werden.Einmal gemeistert, kann diese Technik für 386 Stämme innerhalb von nur fünf Stunden durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Assays wie das bereits vorhandene Pyruvat oder weitere Assays für Acetate oder Phosphat einbezogen werden, um zusätzliche Fragen der Exopolysaccharid-Deklaration zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik durch ihre hohe Empfindlichkeit den Weg für unsere Forschung auf dem Gebiet der gentechnisch veränderten, mikrobiellen Exopolysaccharid-Produzenten, um die Wirkung veränderter Exopolysaccharid-Biosynthesewege auf die bestehende chemische Struktur zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie neuartige Exopolysaccharidproduzenten sehr schnell und zuverlässig identifizieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine schnelle Art und Weise beschrieben, Einblicke in die Struktur der Polysaccharide in einer extrazellulären Matrix zu gewinnen. Die Methode nutzt die Spezifität von Glykosylhydrolasen und die Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht winzige Mengen von Materialien analysiert werden. Diese Technik ist anpassungsfähig, um direkt auf das Gewebe selbst verwendet werden.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

In diesem Video demonstrieren wir einen Hochdurchsatz-Assay für das Screening kohlenhydrataktiver Enzyme unter Verwendung unlöslicher chromogener Polymer-Hydrogel-Substrate. Das Enzym baut diese Substrate zu einem löslichen farbigen Produkt ab, das durch Messung der Farbintensität des Produkts quantifiziert werden kann.

Chromogener Polymer-Hydrogel-basierter Enzym-Screening-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zum Screening der kohlenhydrataktiven Enzyme unter Verwendung synthetischer Substrate

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Schnelle glykoqualitative Bewertung rekombinanter Proteine mit einem vollautomatischen System

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Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt (Video) | JoVE Journal

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