Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist das schnelle und zuverlässige Screening auf mikrobielle Exopolysaccharid-Produzenten und die Identifizierung ihres Kohlenhydrat-Fingerabdrucks. Dies ist ein wesentlicher Schritt, um die unerforschte Vielfalt der Exopolysaccharide zu nutzen. Unsere Methode kann dazu beitragen, die Polymerforschung auf dem Gebiet der mikrobiellen Exopolysaccharide zu beschleunigen.

Es ermöglicht die schnelle Identifizierung neuartiger Polysaccharidvarianten mit unterschiedlichen Eigenschaften für spezifische Anwendungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kombination verschiedener Exopolysaccharid-Detektionssysteme in einem modularen und vollständig automatisierten Screening-Konzept. Das macht es extrem schnell und zuverlässig.

Diese Technik kann auch manuell in Laboren durchgeführt werden, in denen keine Automatisierungsplattform zur Verfügung steht, wodurch ihr Einsatz sehr flexibel ist und an unterschiedliche Screening-Anforderungen angepasst werden kann. Diese Exopolysaccharid- oder EPS-Screening-Plattform verfügt über einen modularen Aufbau, der eine Trennung des Protokolls in zwei Hauptteile ermöglicht: automatisiertes Screening und Kohlenhydrat-Fingerabdruck. Die erste Aufgabe besteht darin, die Stämme für das Screening zu kultivieren und die Zellen durch Zentrifugation zu entfernen.

Die Stämme werden auf Glukose als Kohlenstoffquelle in 96-Well-Platten kultiviert, die mit atmungsaktiver Versiegelungsfolie auf einem Mikrotiterplattenschüttler bei 30 Grad Celsius und 1.000 U/min bedeckt sind. Bereiten Sie am Tag des Bildschirms den Roboterarbeitstisch und das Lagerkarussell vor, wie im Protokolltext beschrieben. Entfernen Sie die atmungsaktive Siegelfolie von den Platten und ordnen Sie die Hauptkulturen in den Karussellpositionen 1-1 bis 1-4 an.

Starten Sie das automatisierte Roboterprogramm. Um Zellen nach der Kultivierung zu entfernen, überführen Sie die Deep-Well-Platten der Hauptkultur aus dem Karussell in die Zentrifuge und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 4.300 x g und 20 Grad Celsius. Für die Fällung vor der Filtration bewegen Sie die Mikrotiterplatten sowie die Mikrotiterplatten des pH-Indikators vom Karussell auf den Arbeitstisch.

Übertragen Sie auch die Filterplatten, die die vollständige Entfernung aller Bakterienzellen gewährleisten, zusammen mit den Kollektorplatten an ihre Arbeitstischpositionen. Nach der Zentrifugation werden 180 Mikroliter des Hauptkulturüberstands auf die Filtrationsplatte überführt. 150 Mikroliter aus dem Überstand der Hauptkultur aspirieren und 50 Mikroliter zur Fällung vor der Filtration in die Mikrotiterplatte und 100 Mikroliter in die pH-Indikatorplatte geben.

Die Fällung des Überstands mit 2-Propanol wird durchgeführt, um die EPS-Produktion zu beurteilen. Verwenden Sie eine mehrstufige 12,5-Milliliter-Pipette, um manuell 150 Mikroliter 2-Propanol in jede Vertiefung zu geben. Nachdem Sie die Mikrotiterplatten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 900 U/min geschüttelt haben, beobachten Sie visuell Faser- oder Flockenbildungen, die auf eine EPS-Produktion hinweisen.

Nachdem die Hauptkulturplatten wieder im Karussell gelagert wurden, untersuchen Sie die Fermentationsbrühen, die nach der Zentrifugation eine verminderte Sedimentation aufweisen sollten. Die Erhöhung der Viskosität ist ein weiteres Indiz für die EPS-Produktion. Die zweite Aufgabe besteht darin, die vollständige Zellentfernung aus der viskosen Fermentationsbrühe über eine 96-Well-Filtration sicherzustellen.

Zentrifugieren Sie die Filtrationsplatten bei 3.000 x g und 20 Grad Celsius für 10 Minuten. Bringen Sie dann die Platten wieder in ihre Karussell-Ausgangsposition und führen Sie die Äquilibrierung der Gelfiltration durch, wie im Protokolltext beschrieben. Pipettieren Sie anschließend 35 Mikroliter Filtrat in die Mitte der äquilibrierten Gelfiltrationsplatte und 50 Mikroliter in die Mikrotiterplatte, die für die Fällung verwendet wird.

Bewegen Sie die Gelfiltrationsplatten in die Zentrifuge und bewegen Sie alle anderen Platten vom Arbeitstisch zurück in die Ausgangspositionen im Karussell. Nach der Lagerung aller Platten wieder im Karussell sind die hochviskosen Überstände zu beachten, die durch Rückstände in der Filterplatte angezeigt werden. Ein Mangel an Filtrat kann in den folgenden Analysemodulen zu falsch negativen Ergebnissen führen.

Die dritte Aufgabe beim automatisierten Screening ist die Entfernung der restlichen monomeren Zucker aus dem Wachstumsmedium über eine 96-Well-Gelfiltration. Zentrifugieren Sie die Gelfiltrationsplatten bei 1.000 x g und 20 Grad Celsius für zwei Minuten. Bereiten Sie den Arbeitstisch über den Robotermanipulator für die Verarbeitung der Gelfiltrate vor.

Um die verbleibende Glukose nach der Gelfiltration zu detektieren, verwenden Sie 50-Mikroliter-Spitzen, um 25 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser auf eine frische Mikrotiterplatte zu übertragen. Aspirieren Sie 20 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser, fünf Mikroliter Luft und 5 Mikroliter Gelfiltrat und geben Sie es in dieselbe Platte. Nehmen Sie 200-Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 50 Mikroliter Glukose-Assay-Reagenzien-Mischung aus den Positionen 1-2 des Arbeitstisches, um den ersten Assay zu starten.

Schieben Sie die Mikrotiterplatten in den Inkubator. Bewegen Sie die Platten nach 30 Minuten Inkubation aus dem Inkubator in den Mikrotiter-Reader und zeichnen Sie die Absorption bei 418 und 480 Nanometern auf. Um den Gesamtkohlenhydratgehalt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode zu bestimmen, pipettieren Sie 20 Mikroliter Gel-Filtrat auf die Mikrotiterplatten.

Entnehmen Sie die Platten manuell aus dem Karussell und legen Sie sie in die Liquid-Handling-Station. Die Kalibrierplatte mit 20 Mikrolitern unterschiedlicher Glukosekonzentrationen in dreifacher Ausführung enthalten. Stellen Sie einen Abfallbehälter auf Position 1, eine 300-Mikroliter-Tippbox auf Position 2 und eine 250-Milliliter-Wanne mit 110 Millilitern frisch zubereiteter Phenol-Schwefelsäure auf Position 3.

Verwenden Sie eine 8-Kanal-Pipette mit 300-Mikroliter-Spitzen, um 180 Mikroliter Phenol-Schwefelsäure in jede Reihe aller Platten zu übertragen. Alle Mikrotiterplatten mit Deckeln abdecken und durch Schütteln fünf Minuten bei 900 U/min bei Raumtemperatur mischen. 35 Minuten bei 80 Grad Celsius in einem Ofen für die Farbreaktion inkubieren.

Nach dem Abkühlen der Platten unter einem Abzug messen Sie die Extinktion bei 480 Nanometern. Stämme aus dem automatisierten Screening werden als EPS-positiv bezeichnet, wenn sie mindestens zwei der folgenden drei Kriterien erfüllen. Viskositätskontrolle, Nachweis von Polymer und berechnetes Glukoseäquivalent

Das Glukoseäquivalent wird anhand dieser Gleichung berechnet. Der Kohlenhydrat-Fingerabdruck der Screening-Plattform enthält die letzten drei Aufgaben, die manuell ausgeführt werden. Das verbleibende Filtrat der positiven Treffer aus Aufgabe zwei bildet die Grundlage für das Gel-Filtrat in Aufgabe fünf.

Aufgabe sechs ist die 96-Well-Mikrohydolyse des Gelfiltrats. Um dies zu erreichen, verwenden Sie zunächst eine 12-Kanal-Pipette mit 50 Mikrolitern, um 20 Mikroliter Gel-Filtrat auf eine neue PCR-Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine 1,25-Milliliter-Mehrstufenpipette, um 20 Mikroliter vier molare Trifluoressigsäure in jede Vertiefung zu geben.

Decken Sie die PCR-Platte mit einer Deckmatte aus thermoplastischem Elastomer ab und legen Sie die PCR-Platte in eine spezielle Klemmvorrichtung. Mischen Sie die Lösungen, indem Sie die Spannvorrichtung 10 Mal umdrehen. Nachdem Sie die PCR-Platte zentrifugiert und in der Spannvorrichtung fixiert haben, legen Sie die gesicherte Spannvorrichtung in ein vorgewärmtes Sandbad und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 121 Grad Celsius.

Fügen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette von 200 Mikrolitern eine 3,2%ige Ammoniaklösung hinzu, um den pH-Wert auf etwa acht einzustellen. Decken Sie die PCR-Platte mit einer Deckmatte aus thermoplastischem Elastomer ab und schütteln Sie sie manuell mit der Klemmvorrichtung. Die letzte Aufgabe besteht darin, den Kohlenhydrat-Fingerabdruck mit der Hochdurchsatz-1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (HTPMP)-Methode zu analysieren.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette mit 50 Mikrolitern, um 25 Mikroliter des neutralisierten Hydrolysats auf eine frische PCR-Platte zu übertragen. Fügen Sie 75 Mikroliter Derivatisierungs-Reagenzien-Mischung hinzu und decken Sie die Platte mit einer thermoplastischen Elastomer-Deckmatte ab. Legen Sie die PCR-Platte für 100 Minuten bei 70 Grad Celsius in einen PCR-Cycler, anschließend kühlen Sie sie auf 20 Grad Celsius ab.

Übertragen Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot in eine neue Mikrotiterplatte und fügen Sie dann mit einer 12-Kanal-Pipette von 200 Mikrolitern 130 Mikroliter 19,23 millimolare Essigsäure zu jeder Leitung hinzu. Mischen Sie direkt durch Aspirieren und Dispensieren mindestens sechsmal und geben Sie die gesamte Flüssigkeit auf eine 0,2-Mikrometer-Filterplatte mit einer Mikrotiter-Kollektorplatte. Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1.000 x g, entfernen Sie die Filterplatte und versiegeln Sie die Mikrotiter-Kollektorplatte mit einer Silikonkappenmatte.

Legen Sie die Mikrotiterplatte in das UHPLC-UV-ESI-MS zur Bestimmung des Kohlenhydrat-Fingerabdrucks. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von drei exemplarischen neuartigen Stämmen, die mit dieser Screening-Plattform erfolgreich identifiziert wurden. Im linken Teil der Tabelle sind die Ergebnisse der automatisierten Screening-Module zur Viskositätsbildung, zur Polymerherstellung und zum Glukoseäquivalent aus der Gesamthydrolyse dargestellt, die als Auswertungsparameter für die detaillierte Kohlenhydrat-Fingerprint-Analyse herangezogen wurden.

Der Kohlenhydrat-Fingerabdruck auf Basis von kalibrierten Zuckern sowie unbekannten Zuckern, Dimeren und Substituenten ist im rechten Teil der Tabelle angegeben. Mit Hilfe dieser Informationen kann die monomere Zusammensetzung berechnet und mit bereits bekannten Polymerstrukturen verglichen werden. Darüber hinaus kann ein gezieltes Screening auf interessante monomere Zusammensetzungen und seltene Kohlenhydrate durchgeführt werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik für 386 Stämme innerhalb von nur fünf Stunden durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Assays wie das bereits vorhandene Pyruvat oder weitere Assays für Acetate oder Phosphat einbezogen werden, um zusätzliche Fragen der Exopolysaccharid-Deklaration zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik durch ihre hohe Empfindlichkeit den Weg für unsere Forschung auf dem Gebiet der gentechnisch veränderten, mikrobiellen Exopolysaccharid-Produzenten, um die Wirkung veränderter Exopolysaccharid-Biosynthesewege auf die bestehende chemische Struktur zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie neuartige Exopolysaccharidproduzenten sehr schnell und zuverlässig identifizieren können.