Name: Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Lernen Sie die Analyse der Darmbarrierefunktion mit ex vivo-Darm-Sacs in Tiermodellen. Diese Methode ermöglicht die gezielte Untersuchung der Mukosaintegrität und des Schleimgels bei Verdauungserkrankungen.

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Diese Arbeit wurde durch den National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 und einen Zuschuss des Hunter Medical Research Institute finanziert, der von Sparke Helmore/NBN Triathlon und dem Nachlass des verstorbenen Leslie Kenneth McFarlane gesponsert wurde.

Alle tierischen Arbeit in diesem Protokoll wird bei strikter Einhaltung University of Newcastle Tierethikkommission genehmigten Verfahren durchgeführt. 1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Pre-warmen Medien 199 (TC199) oder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medien bis 37 ° C. Pre-Oxygenat das Medium durch mit 95% O 2/5% CO 2 sprudeln. Überprüfen Sie, ob das Medium einen endgültigen pH-Wert von 7,3 hat. </li><li> Bereiten Faden durch Schneiden zwei 5 cm Abschnitte für jeden Sack. Schleife die Nähte in eine unverschlossene Knoten. </li></ol> 2. Dissection und Vorbereitung des Gastrointestinaltraktes <ol><li> Ziehen Sie feste Nahrung 12 Stunden vor der Euthanasie. Falls gewünscht, legen Tiere auf Nährgel Ergänzungen während dieser Zeit. </li><li> Euthanize Mäusen durch Natriumpentobarbiton Überdosierung ([200 mg / Kg], intraperitoneale Injektion), gefolgt durch zervikale Dislokation nach Ethik protoSpalten und 70% Ethanol auf den Bauch und Brustkorb sprühen. </li><li> Mit einer Schere, einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches machen und das Bauchfell aus. </li><li> Gehen Sie zu trennen und das Entfernen des Magen-Darm-Trakt, indem der obere Dünndarm aus dem Magen in die Magenpförtner Schneiden und den Dickdarm in den analen Rand schneiden. Verwenden einer Pinzette vorsichtig auf die Gekröse entfernen. Setzen Sie den Darmtrakt in vorgewärmten, sauerstoffreiches Medium. </li><li> Identifizieren Sie den Abschnitt des Darms, der für Durchlässigkeit (Abbildung 1) geprüft und schneiden Sie diesen Abschnitt frei von dem Rest des Verdauungstraktes. <ol><li> Um die Konsistenz zwischen den Tieren zu halten, messen Abschnitte von Duodenum und Jejunum in Bezug auf den Magen, und messen Abschnitte des Dickdarms und Ileum gegenüber dem Blinddarm. </li><li> Wenn Gewebesegmente auszuwählen, beachten Sie das Vorhandensein von Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe wie Peyer-Plaques. Diese können als kleine Anspielung identifiziert werdenules auf der Serosa-Seite des Lumens. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze, spülen sanft die luminalen Inhalte des Darmsegments in eine Petrischale mit vorgewärmtem PBS (37 ° C). Diese fäkal Inhalt kann bei entsorgt oder gelagert werden -80 ° C für zukünftige Analyse wie gewünscht. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Darm Sacs <ol><li> Bereiten einer 1 ml Spritze mit einer 300 ul Volumen der Testverbindung oder Molekül. Zur mukosalen Integrität, einer 1 mg / ml Lösung von FITC-Dextran M.Wt. 4400 verwendet werden. Sonden im Bereich von 4,400-70,000 Da in der Größe kann für eine erhöhte Empfindlichkeit verwendet werden. passen sicher ein kleines Tier Gefäßkatheter auf die Spritze. </li><li> Maßnahme 5 cm von der Öffnung des Darm Segment und das Segment binden fest an dieser Stelle mit einer Naht-Schleife geschlossen. Sanft legen Sie eine vorgebunden Naht-Schleife um die Öffnung des Darms und die abgestumpften Katheter einsetzen. Ziehen Sie die Schlinge geschlossen, um die Darmsegment zu sichernund Loslassen der 300 ul-Volumen aus der Spritze in den Darm, so dass die gesamte Lösung eingespritzt wird. </li><li> Sie vorsichtig den Katheter zu entfernen, während gleichzeitig die Naht Schlinge ziehen Schließung des Darmsack zu sichern. Schneiden Sie das Darmsack lose aus dem Darm und in einen 50 ml konischen Röhrchen gefüllt mit 20 ml sauerstoffreiches Medium, vorgewärmt auf 37 ° C. </li></ol> 4. Messung der Durchlässigkeit <ol><li> Platz konische Röhrchen, die die Darmsäcken in einem beheizten Wasserbad enthält, auf 37 ° C. Bei 0, 30, 60, 90 und 120 min Zeitpunkten, nehmen 100 ul Probe aus dem konischen Rohr und in ein 96-Well-Platte, das Volumen mit 100 ul frisches Medium in jedem Fall zu ersetzen. </li><li> Nachdem die letzte Probe entnommen wird, aufgeschnitten Säcke an der Stelle der Naht und über die gesamte Länge des Segments, die Schleimhautoberfläche freigelegt wird. </li><li> Messen Sie die Länge und Breite jedes Darmsegment. wenn Desirot, einfrieren Schnapp die Segmente und bei -80 ° C für Protein oder biochemischen Analyse oder alternativ Geschäft in RNA-Stabilisierung Lösung für molekulare Tests. </li><li> Eine Standardkurve von log-Verdünnungen für FITC-markierte Moleküle von 1 bis 1 x 10 -6 bis hin. </li><li> Messen Proben und Standards für FITC auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät, FITC Anregungs- / Emissions: 495 nm / 519 nm. </li></ol> 5. Berechnung der Scheindurchlässigkeit für jeden einzelnen Darm-Sac <ol><li> Konvertieren Zeiteinheiten zu sek. </li><li> Für jeden Zeitpunkt berechnen die kumulative Konzentration, Q Q t = (C t * V r) + (Q t Summe * V s), wo: Q t = Kumulative Konzentration zum Zeitpunkt t C t = Konzentration zum Zeitpunkt t V r = Volumen auf der Empfängerseite Q t Summe = Summe aller bisherigen Q t Vs =Volumen abgetastet </li><li> Plot Q gegen die Zeit (T) und die Berechnung der Steigung: &amp; dgr; Q / &amp; dgr; t </li><li> Berechnen Sie die scheinbare Durchlässigkeit (P app) P app = (&amp; dgr; Q / &amp; dgr; t) / (A * Co), wo: A = Fläche des Gewebes C 0 = Anfangskonzentration </li></ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
<li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB%2FDbpA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
<li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor%3A+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier haben wir die Isolierung und Herstellung von Darmsäcken detailliert Schleimhautbarrierefunktion ex vivo zu beurteilen. Darmsack Vorbereitungen sind in der pharmazeutischen Forschung genutzt, die Prüfung der Aufnahme von Wirkstoffkandidaten über den Darm in erster Linie ist. Allerdings ist dieser Test gleichermaßen gut für die Untersuchung von Darmerkrankungen geeignet. Darmdurchlässigkeit kann stark von Region und standortspezifische Bewertung der Durchlässigkeit ermöglicht ein besseres Verständnis für die...

Die intestinale epitheliale Barriere des Gastrointestinaltraktes ist Bereich einer Schleimhautoberfläche bei 400 m 2 in dem erwachsenen Menschen geschätzt. Folglich wird es ständig ausgesetzt von Mikroben, eingenommene Drogen, Nährstoffe und bakterielle Toxine in Frage zu stellen. Der Host muss nicht nur zwischen tolerierbaren kommensalen Bakterien und potentielle Pathogene unterscheiden, aber müssen diese Arten und ihre sezernierten Moleküle vor der Kreuzung die Epithelbarriere, während zur gleichen Zeit ermöglicht die Aufnahme von Nährstoffen zu vermeiden. Somit ist die Rolle des Darmepithels als selektive Barriere zu der luminalen Inhalte 1 zu wirken. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch das angeborene epithelialen Abwehrsystem an der Schleimhaut, die eine reaktions biologischen System wirkt über 2 konstitutiver und induzierbarer Mechanismen aus. Verlust von epithelialen Barrierefunktion ist eine Pathologie, die charakteristisch für eine Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen ist. In vivoPrüfung der epithelialen Barrierefunktion kann durch orale Gabe von Tracer-Molekül und anschließende Serumanalyse 3 bewertet werden. Allerdings bietet diese Technik keinen Hinweis auf den Ort der Schrankenstörung. In-vitro- und Ex-vivo-Bewertung der transepithelialen Widerstand mit Transwell-Systeme 3 und Ussing-Kammern 4,5 bzw. werden als Surrogatmarker der epithelialen Barrierefunktion häufig verwendet, aber nicht über die beitragenden Krankheit Physiologie von Tiermodellen 6. In diesem Protokoll beschreiben wir eine ex vivo Gewebepräparationsmodell, das direkte und lokale Bewertung der Darm-Integrität ermöglicht und die verwendet werden können Schleimhautbarrierefunktion in mehreren Ebenen zu beurteilen. Wichtig ist, kann diese Technik zu Tiermodellen von Krankheiten angewendet werden, oder pharmakologisch manipuliert werden kann, in der Tiefe Abfrage von Schleimhaut-Barriere Dysfunktion zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&nbsp; Nicht resorbierbares Seidennaht</td><td>Braintree</td><td>Scientific SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>Kein Phenolrot, da es die Fluoreszenz beeinträchtigt</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>Kein Phenolrot, da es die Fluoreszenz beeinträchtigt</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein Sigma</td><td>Aldrich</td><td></td><td>Verwendung bei 10 mM in Medien</td></tr><tr><td>Gefäßkatheter für Kleintiere: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4.400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo-darm-sacs zu beurteilen durchlässigkeit der schleimhaut in modelle von magen-darm-krankheit

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Die epitheliale Barriere ist der erste angeborenen Abwehr des Gastrointestinaltraktes und regelt selektiv Verkehr von dem Lumen zu dem darunter liegenden Gewebe Fächer, den Transport von kleineren Molekülen über das Epithel zu beschränken und nahezu vollständig zu verbieten epithelialen makromolekulare Transport. Diese Selektivität wird durch die Schleimhaut Gelschicht bestimmt, die den Transport von lipophilen Molekülen und sowohl den apikalen Rezeptoren und enge Verbindungsprotein-Komplexe des Epithels begrenzt. In-vitro-Zellkulturmodellen des Epithels sind bequem, aber als ein Modell, es fehlt ihnen die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen der Mikroflora, Schleim-Gel, Epithel und Immunsystem. Auf der anderen Seite, in vivo Beurteilung der intestinale Absorption oder Durchlässigkeit kann durchgeführt werden, aber diese Tests insgesamt Magen-Darm-Absorption zu messen, ohne Angabe von Ortsspezifität. Ex-vivo-Durchlässigkeit Tests &quot;Darmsäcken&quot; können; sind eine schnelle und empfindliche Verfahren entweder Gesamtdarm Integrität oder Vergleichs Transport eines spezifischen Moleküls, mit dem zusätzlichen Vorteil der intestinalen Ortsspezifität messen. Hier haben wir die Herstellung von Darmsäcken für Durchlässigkeit Studien und die Berechnung des scheinbaren Durchlässigkeit (P app) beschreiben eines Moleküls durch die Darmbarriere. Diese Technik kann als ein Verfahren zur Beurteilung der Arzneimittelabsorption verwendet werden, oder regional Epithelbarriere Dysfunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um regionale Veränderungen in Darmbarrierefunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen untersuchen. Durch Messung des Flusses eines parazellulären Sonde über der Schleimhautoberfläche in unterschiedlichen Bereichen des Gastrointestinaltraktes 7, die Integrität der epithelialen tight junctions beurteilt werden. Außerdem kann durch die Art der parazellulären Sonde von unterschiedlicher Größe (Abbildung 2) o...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von exzidierten Darmgewebepräparaten oder "Darmsäcken" als ex vivo Modell der Darmbarrierefunktion. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Integrität sowohl der Epithelbarriere als auch der Schleimhautgelschicht an spezifischen Darmstellen in Tiermodellen für Verdauungserkrankungen zu beurteilen.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die lokalisierte Darmintegrität in Tiermodellen gastrointestinaler Erkrankungen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu gastrointestinalen Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise, ob die Mukosaintegrität verloren geht oder ob während der Erkrankung eine erhöhte Aufnahme eines bestimmten Moleküls oder einer bestimmten Bakterienart auftritt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Beurteilung spezifischer Bereiche innerhalb des Magen-Darm-Trakts verwendet werden kann. Um den Magen-Darm-Trakt vorzubereiten, besprühen Sie zunächst Bauch und Thorax der Maus mit 70-prozentigem Ethanol und führen mit einer Schere einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches durch, um das Peritoneum freizulegen. Danach durchtrennen Sie den oberen Teil des Dünndarms am Pylorus vom Magen und den Dickdarm am Analkanal. Entfernen Sie vorsichtig das Mesenterium mit einer Pinzette und legen Sie den Darmtrakt in ein vorgewärmtes, mit Sauerstoff angereichertes Medium. Identifizieren Sie den Bereich, der auf Permeabilität untersucht werden soll, und messen Sie die Abschnitte von Duodenum und Jejunum bezogen auf den Magen sowie die Abschnitte von Colon und Ileum bezogen auf den Blinddarm, um eine Konsistenz zwischen den Versuchstieren sicherzustellen. Achten Sie auf das Vorhandensein mukosaassoziiierter lymphoider Gewebe wie der Peyer-Plaques, die als kleine Knötchen auf der serösen Seite des Lumens erkennbar sind. Schneiden Sie danach den ausgewählten Abschnitt zu und spülen Sie mit einer 1-ml-Spritze vorsichtig den luminalen Inhalt des Segments in eine Petrischale, die 37

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Kleintierbildgebung Techniken ermöglichen Serien diagnostische Untersuchungen und therapeutische Interventionen in vivo. Vor kurzem hat der Umfang der Anwendungen erheblich erweitert und umfasst gegenwärtig Beurteilung Colontumorentwicklung, Wundheilung und Kontrolle von Entzündungen. Dieses Protokoll zeigt diese verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der murinen Endoskopie.

Murine Endoskopie für In Vivo Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Aktuelle Behandlungen von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zielen darauf ab, die Krankheitssymptome zu lindern, kann aber schwere Nebenwirkungen verursachen. Somit sind alternative Strategien in Tier Colitis-Modellen untersucht. Hier erklären wir, wie die positiven Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln auf die klinische IBD Zeichen sind in einer solchen ulcerosa Modell analysiert.

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

Hier beschreiben wir eine Technik zur Quantifizierung der Barriereintegrität kleiner Darmorganoide. Die Tatsache, dass die Methode auf lebenden Organoiden basiert, ermöglicht die sequenzielle Untersuchung verschiedener Barriereintegritätsmodulisierungssubstanzen oder Kombinationen davon in einer zeitaufgelösten Weise.

Untersuchung des Darmbarriereabbaus bei lebenden Organoiden

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode, die Luzifergelb in einem apikalen enteroiden Modell verwendet, um die Darmpermeabilität zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität in Enteroiden zu bestimmen, die entzündliche Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis modellieren.

Bestimmung der Darmpermeabilität mit Lucifer Yellow in einem apikalen enteroiden Modell

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Dieser Artikel beschreibt: (1) die orale Abgabe von Testmolekülen an Neugeborenenmäuse bereits ab DOL 6; und (2) ex-vivo-Bewertung der Funktion der Colonepithelbarriere in Biopsien von DOL 10 bis zum Abstillen (DOL 20) Jungen durch Bewertung der parazellulären und transzellulären Permeabilität mit Ussing-Kammern.

Orale Gavage bei neonatalen Mauswelpen und funktionelle Beurteilung der Integrität der Darmbarriere mittels Ussing-Kammern

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

Lernen Sie die Analyse der Darmbarrierefunktion mit ex vivo-Darm-Sacs in Tiermodellen. Diese Methode ermöglicht die gezielte Untersuchung der Mukosaintegrität und des Schleimgels bei Verdauungserkrankungen.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

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