Generation von Aggregaten von embryonalen Stammzellen der Maus, die Symmetriebrechung, Polarisation und Emergent Collective Verhalten anzeigen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, gleichmäßige Aggregate aus embryonalen Stammzellen der Maus herzustellen, die Selbstorganisation und axiale Verlängerung in Suspensionkultur durchlaufen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise zur Rolle von Gewebeinteraktionen bei der Achsspezifikation und Selbstorganisation in Prozessen wie der Keimblattanlage. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass entwicklungsbiologische Vorgänge aus einer neuartigen, dekonstruktiven Perspektive außerhalb des Embryos vor der Aggregation untersucht werden können.

Halten Sie embryonale Mauszellen oder MMECs in ES.Lift-Medium auf mit Gelatine beschichteten Zellkulturgefäßen mit einer Fläche von 25 Quadratzentimetern zur Aggregatbildung. Beginnen Sie mit dem Zellkulturgefäß, das Zellen mit einer Konfluenz von 40 bis 60 % enthält, aspirieren Sie das Medium und spülen Sie das Gefäß zweimal mit PBS. Geben Sie ein Milliliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten, um die Zellen vom Gefäß zu lösen.

Fügen Sie anschließend fünf Milliliter Es.Lift-Medium zur abgelösten Zellsuspension hinzu und mischen Sie gründlich. Überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und entnehmen Sie ein Ein-Milliliter-Aliquot, um die Zellen zu zählen. Geben Sie fünf mal 10 hoch vier Zellen zu fünf Milliliter warmer PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 170 × g für fünf Minuten.

Aspirieren Sie die Lösung, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie dann vorsichtig fünf Milliliter PBS hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Aspirieren Sie das maximale Volumen, ohne das Zellpellet zu stören.

Um eine Übertragung von PBS zu verhindern. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter warmem N2B27-Medium. Mischen Sie gründlich mit einer P1000-Pipette, um eine homogene Zellsuspension zu erzeugen.

Anschließend mit zusätzlichen vier Millilitern N2B27-Medium verdünnen. Die Zellsuspension mit einer Mehrkanalpipette in ein steriles Reservoir überführen. Die Zellen gründlich mischen und 40 Mikroliter der Zellsuspension aus dem Reservoir in jedes Well einer ubo-non-Gewebezüchtungs-Behandlung überführen.

96-Well-Platte. Es wird ausdrücklich eine Nicht-Gewebekulturplatte verwendet, um die Anheftung der Zellen an die Platte zu minimieren. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um nach 48 Stunden die Zellaggregation zu ermöglichen.

Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um das Vorhandensein von Aggregaten zu bestätigen. Geben Sie ein Volumen der 10 millimolaren CHI 9 9 0 2 1-Stammlösung zu warmem N zwei B 27, um eine Endkonzentration von drei Mikromolar zu erreichen. Dies ist ein sekundäres Medium zur Zellstimulation.

Mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter des sekundären Mediums in jede Vertiefung geben. Mit ausreichender Kraft, um eventuell anhaftende Aggregate zu lösen. Die Platte nach der Inkubation 24 Stunden lang in den Zellkulturschrank zurückstellen.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig, ohne das Zellaggregat abzusaugen. Geben Sie 150 Mikroliter frisches N2B27 in jede Vertiefung mit ausreichender Kraft, um anhaftende Aggregate zu lösen. Wiederholen Sie dies alle 24 Stunden über eine Gesamtinkubationszeit von etwa fünf Tagen.

Um Aggregate für die Fixierung vorzubereiten, aspirieren Sie zunächst vorsichtig die Inkubationslösung aus jedem Wells, wobei Sie die Pipette in einem Winkel von 30 Grad halten. Um zu verhindern, dass das Zellaggregat aspiriert wird, geben Sie 150 Mikroliter PBS zu jedem Well hinzu. Warten Sie einige Minuten, bis sich das Aggregat am Boden abgesetzt hat, und aspirieren Sie dann das PBS.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch zweimal mit sterilen Scheren. Schneiden Sie eine P-1000-Pipettenspitze etwa drei Millimeter über ihrer Abgabestelle ab. Verwenden Sie diese Spitze, um eine kleine Flüssigkeitsmenge in eine Vertiefung aufzusaugen und abzugeben.

Um das Aggregat zu bewegen und vom Boden der Vertiefung zu lösen. Dann das Aggregat in die Pipettenspitze aufziehen und in eine Glas-Drosophila-Präparierschale überführen. Mit derselben Methode sammeln Sie alle Aggregate, die identischen Immunfärbungsverfahren unterzogen werden, in einer einzigen Präparierschale.

Stellen Sie die Dissektionsmulde unter das Mikroskop und schwenken Sie sie, um die Aggregate zur Mitte zu bewegen. Saugen Sie dann vorsichtig das PPS vom Rand der Mulde ab, wobei Sie darauf achten, keine Aggregate zu entfernen.

Um die Aggregate zu fixieren, einen Milliliter frisch zubereitete 4 % Formaldehydlösung hinzufügen und die Schalen zwei Stunden bei vier Grad Celsius in einem Rüttelapparat inkubieren. Auf niedriger Geschwindigkeit einstellen. Die Formaldehyllösung vorsichtig absaugen, um ein Absaugen der Aggregate zu vermeiden, und anschließend einen Milliliter PBS in die Vertiefung geben.

Bringen Sie die Platte erneut für 10 Minuten auf den Rüttler. Entfernen Sie den PBS aus dem Brunnen und wiederholen Sie diesen Waschschritt noch zweimal. Fügen Sie anschließend ein Milliliter P-B-S-F-T-Lösung hinzu und stellen Sie die Platte für 10 Minuten auf den Rüttler.

Lösen Sie die Lösung ab und wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal. Geben Sie je einen Milliliter P-B-S-F-T pro Mulde zu, um die Aggregate vor unspezifischer Immunreaktivität zu blockieren. Stellen Sie die Platte für eine Stunde bei vier Grad Celsius auf den Rotationsrüttler auf niedriger Stufe.

Nach der Inkubation die Blockierungslösung vorsichtig aus den Vertiefungen abpipettieren und 500 Mikroliter des in P-B-S-F-T verdünnten primären Antikörpers hinzufügen. Die Platte mit Parafilm abdichten, um Verdunstung zu verhindern, und über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rütteltablett mit geringer Geschwindigkeit inkubieren. Danach die Lösung mit dem primären Antikörper durch vorab gekühltes P-B-S-F-T ersetzen.

Waschen Sie die Aggregate, indem Sie die Platte auf den Rüttler stellen. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf niedrig bei vier Grad Celsius für fünf Minuten ein. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.

Führen Sie zwei zusätzliche Waschzyklen mit P-B-S-F-T bei vier Grad Celsius an einem Rotationsschüttler mit niedriger Geschwindigkeit durch. Wie im Textprotokoll angegeben, entfernen Sie die Waschlösung und inkubieren mit 500 Mikrolitern sekundärem Antikörper, der in P-B-S-F-T verdünnt ist. Geben Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Herst zu, um die Kerne sichtbar zu machen, und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius an einem rotierenden Rotor, wobei die Probe vor Licht geschützt ist.

Führen Sie einen weiteren Waschzyklus mit PBS FT bei vier Grad Celsius durch, dabei vor Licht geschützt in einer mit Folie umwickelten Box. Führen Sie zusätzliche Waschungen mit PBS, der 0,2 % FBS und 0,2 % Triton X-100 oder PBT-Puffer enthält, bei Raumtemperatur durch. Nach sorgfältigem Absaugen der Lösung inkubieren Sie die Aggregate mit einem Milliliter einer 1:1-Mischung aus Glycerin und PBT für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Anschließend inkubieren Sie sie für 30 Minuten mit einem Milliliter einer 7:3-Glycerin-zu-PBT-Lösung. Um die Proben für die konfokale Bildgebung vorzubereiten, saugen Sie die Glycerin-zu-PBT-Lösung ab und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter Einbettmedium. Danach montieren Sie die Aggregate in 17-Mikroliter-Tropfen auf einem Objektträger.

Präparieren Sie mit einer Pipettenspitze einen Abstandshalter, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband viermal auf sich selbst falten. Platzieren Sie dann auf jeder Seite der Aggregate auf dem Objektträger einen Abstandshalter, setzen Sie die Deckglasabdeckung umgekehrt auf die Abstandshalter auf und nehmen Sie die Aggregate mittels konfokaler Mikroskopie auf. 48 Stunden nach der Aussaat bilden sich Aggregate mit einem Durchmesser von etwa 150 Mikrometer, die glatte Ränder aufweisen.

Andererseits könnte eine schlechte Mediumqualität, eine nicht optimale Zellanzahl beim Ansäen oder eine unzureichende Zelladhärenz dazu führen, dass die Zellen sich nicht richtig aggregieren. Eine 120-stündige kontinuierliche Behandlung mit CHI 9 9 0 2 1, einem Hemmstoff der Glykogensynthasekinase drei, bewirkt, dass das sphärische Aggregat sich verlängert. Zudem zeigt sich nach der Behandlung eine deutliche Lokalisation von SOX-GFP-positiven Zellen an einem Ende des Aggregats; unterschiedliche Behandlungen führen zu verschiedenen morphologischen Veränderungen sowohl in der Gestalt eines einzelnen Aggregats als auch im fluoreszierenden Marker.

Die Lokalisation innerhalb des Aggregats kann über die Zeit verfolgt werden. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann der Forscher Aggregatbildungen innerhalb von etwa 45 Minuten erzeugen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Sobald die Aggregate gebildet wurden, können andere Methoden wie Q-R-T-P-C-R anstelle der Immunfärbung angewendet werden, um Veränderungen in der Genexpression innerhalb der Aggregate zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Aggregate aus MECs bildet, spezifische Stimuli anwendet und die Aggregate für die immunhistochemische Färbung und die Analyse mittels konfokaler Mikroskopie vorbereitet.