2.2: Gen-Silencing mit Morpholinos

Gen-Silencing-Techniken werden häufig im Bereich der Entwicklungsbiologie eingesetzt. Morpholino-basierte Knockdown-Ansätze ermöglichen es Forschern routinemäßig, Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, die an wichtigen zellulären Prozessen beteiligt sind. Antisense-Morpholinos sind heute in vielen Modellsystemen, einschließlich Mäusen, Küken und Zebrafischen, aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit, hohen Spezifität und geringen Kosten sehr beliebt.

Dieses Video gibt einen Überblick über die Morpholino-Mechanismen und Mikroinjektionsstrategien, die wichtigsten experimentellen Kontrollen und darüber, wie Morpholinos heute in Labors eingesetzt werden, um die Entwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen.

Morpholinos wurden ursprünglich entwickelt, um die Translation von RNA-Transkripten in lebenden Zellen und Organismen zu hemmen. Im Allgemeinen sind Morpholinos synthetische Moleküle, die aus 25 Oligonukleotiden bestehen, die durch ein neutral geladenes Rückgrat verbunden sind.

Aber obwohl Morpholinos der DNA sehr ähnlich sehen, enthalten sie Morpholinringe anstelle der Zuckergruppen, die im Phosphatzuckerrückgrat zu finden sind. Diese einfache Umwandlung erhöht die Stabilität des Morpholinos in den Zellen und senkt ihre Produktionskosten.

Innerhalb der Zellen werden Morpholinos durch komplementäre Basenpaarung auf die interessierende RNA ausgerichtet. Die Stelle auf der RNA, an der das Morpholino hybridisiert, bestimmt seinen spezifischen Wirkmechanismus.

Splice-blockierende Morpholinos binden an spezifische Verbindungen und hemmen die korrekte Transkriptverarbeitung, während translationsblockierende Morpholinos in der 5'-untranslatierten Region des Gens in der Nähe der translationalen Startstelle binden und die Ribosomenassemblierung verhindern. Beide Arten von Morpholinos reduzieren die Expression von funktionellen Zielproteinen.

Bei der Planung eines Experiments mit Morpholinos gibt es einige wichtige Überlegungen, die man beachten sollte. Morpholinos können in mehreren Modellsystemen eingesetzt werden, daher ist es wichtig, ein Modell auszuwählen, das in der Lage ist, die jeweilige biologische Fragestellung zu beantworten.

Morpholinos werden kommerziell synthetisiert, und professionelle Unterstützung beim Design steht den Forschern kostenlos zur Verfügung, aber da sie sequenzspezifisch sind, sollten Geninformationen für alle spezifischen Morpholino-Ziele vor dem Design beschafft werden.

Im Zebrafisch-Modellsystem gibt es oft zwei Kopien einzelner Gene, die in anderen Wirbeltieren gefunden werden, aufgrund eines Duplikationsereignisses im gesamten Genom, das bei einem evolutionären Vorfahren des Zebrafisches aufgetreten ist. Daher könnte der Knockdown beider Zebrafisch-Gene notwendig sein, um Proteindefizite in der menschlichen Entwicklung erfolgreich zu modellieren.

Das Entwerfen guter experimenteller Kontrollen ist genauso wichtig wie das Entwerfen Ihrer Zielmorpholinos. Jedes gegebene Morpholino kann an bestimmte Sequenzen auf verschiedenen Genen binden. Es ist ratsam, unabhängige, nicht überlappende Morpholinos zu verwenden, die zum selben Gen komplementär sind, um sicherzustellen, dass eine beobachtete phänotypische Veränderung auf einen Knockdown Ihres interessierenden Gens zurückzuführen ist.

Nachdem wir uns nun mit dem experimentellen Design von Morpholino befasst haben, werfen wir einen Blick darauf, wie Morpholinos in Zebrafische eingeführt werden.

Hier werden wir die Mikroinjektion von Morpholino in Zebrafische beschreiben. Weitere Einblicke und Anweisungen zu den Details der Mikroinjektion finden Sie im JoVE Science Education-Video mit dem Titel "Zebrafisch-Mikroinjektionstechniken".

Morpholinos werden typischerweise in Zebrafischembryonen zwischen dem Ein- und Vierzellstadium injiziert, in das Eigelb oder das Zellzytoplasma. Zytoplasmatische Verbindungen zwischen embryonalen Zellen ermöglichen eine schnelle Diffusion und allgegenwärtige Abgabe von wasserlöslichen Morpholinos im gesamten Organismus. Morpholinos sind in Zellen stabil, da der Zebrafischembryo bei 28,5 °C aufgezogen wird.

Optimale Injektionskonzentrationen und -volumina müssen für jedes Morpholino empirisch getestet werden. In der Regel wird die niedrigste Dosis verwendet, bei der bei mindestens 50-75 % der injizierten Embryonen ein definierter zuverlässiger Phänotyp vorliegt, um embryonale Letalität oder unerwünschte Off-Target-Effekte zu vermeiden.

Die meisten Morpholino-Zebrafisch-Phänotypen werden in den ersten drei Tagen nach der Befruchtung identifiziert, und das Gen-Silencing ist im Allgemeinen bis zum fünften Tag wirksam. Im Falle von Spleißblockern kann die RT-PCR verwendet werden, um relative Mengen an nativen und veränderten Transkripten zu identifizieren. Bei translationsblockierenden Morpholinos kann der Grad des Gen-Knockdowns durch Western Blot bestimmt werden.

Die schnelle äußere Entwicklung und Transparenz von Zebrafischembryonen ermöglicht eine einfache Beobachtung vieler früher biologischer Prozesse. Morpholino-Phänotypen können in der Regel durch die Analyse der Morphologie mittels Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie sowie durch die Beurteilung des Verhaltens bewertet werden.

Nachdem der Morpholino-Phänotyp definiert wurde, kann eine RNA-Rettung durchgeführt werden, um die Zielspezifität zu demonstrieren. Nach dem Morpholino-Knockdown der endogenen mRNA wird synthetische mRNA injiziert, die für dasselbe Protein kodiert, aber die Morpholino-Zielsequenz nicht enthält. Wenn diese injizierte RNA in der Lage ist, den Wildtyp-Phänotyp des Organismus wiederherzustellen, dann können wir daraus schließen, dass der beobachtete Morpholino-Phänotyp spezifisch darauf zurückzuführen ist, dass das Zielgen ausgeschaltet wird.

Nun, da Sie ein Gefühl dafür haben, was Morpholinos sind und wie kontrollierte Morpholino-Experimente durchgeführt werden können, schauen wir uns an, wie Morpholinos heute in biologischen Labors angewendet werden.

In der Zellbiologie werden Morpholinos verwendet, um frühe Entwicklungsprozesse zu verstehen. Die von Zilien erzeugte Flüssigkeitsströmung im Kupffer-Vesikel ist ein Beispiel, das die Links-Rechts-Musterung im Zebrafisch steuert. Der Flüssigkeitsfluss verläuft bei kontrolliert injizierten Embryonen gegen den Uhrzeigersinn, während das Stummschalten eines Gens, das die Organisation der Flimmerzellen reguliert, die Geschwindigkeit und Richtung der Flüssigkeit stört.

Morpholinos eignen sich auch sehr gut, um genetische Erkrankungen des Menschen schnell und zuverlässig zu modellieren. Funktionsverlust-Phänotypen können leicht durch Manipulation der Proteinexpression reproduziert werden, wie in einem Zebrafischmodell der menschlichen Dysplasie zu sehen ist, das Nierenzysten, Perikardödeme und einen gekrümmten Schwanz aufweist. Darüber hinaus können pathogene Mutationen schnell in vivo getestet werden, indem Wildtyp- oder mutierte mRNA verwendet wird, um Phänotypen von Morpholino-Erkrankungen zu retten.

Da Morpholinos auf unterschiedliche Weise in lebende Zellen eingebracht werden können, werden sie bei der Erforschung der Organregeneration und -entwicklung sehr geschätzt. Die Mikroinjektion mit anschließender elektrischer Stimulation von Morpholinos in bestimmte Gewebe hat es den Forschern ermöglicht, das Flossenwachstum und die Netzhautbildung bei erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in das Gen-Silencing mit Morpholinos gesehen. In diesem Video haben wir die Struktur und den Mechanismus von Morpholinos, gängige Anwendungen und wichtige Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und der Auswirkungen von gezieltem Gen-Silencing diskutiert. Da sie einfach zu entwerfen, hochspezifisch und kostengünstig sind, werden Morpholinos ein bedeutender Akteur auf dem Gebiet der reversen Genetik bleiben und dabei helfen, Gene funktionell zu analysieren, die an Krankheit und Entwicklung beteiligt sind. Danke fürs Zuschauen!