Gen-Silencing mit Morpholinos

Gene Silencing with Morpholinos

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Developmental Biology

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Gene Silencing with Morpholinos

2.1: Invertebrate Lifespan Quantification

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April 30, 2023

Overview

Morpholino-vermittelte Gen-silencing ist eine verbreitete Methode, Rollen bestimmter Gene während der Entwicklung zu studieren. Morpholinos hemmen Genexpression durch Hybridisierung zu ergänzenden mRNAs. Aufgrund ihrer einzigartigen Chemie sind Morpholinos einfach zu produzieren und zu speichern, wodurch sie besonders kostengünstig im Vergleich zu anderen Gen-silencing Methoden.

Dieses Video Bewertungen richtige experimentelles Design, wenn diese Oligonukleotide mit. Danach eine Erklärung der Morpholino Mikroinjektion Techniken im Zebrafisch und die Analyse der resultierenden Phänotypen erörtert werden. Zu guter Letzt präsentieren wir Beispiele für spezifische Anwendungen wo Morpholino Technologie, Entwicklungsstörungen zu modellieren oder Geweberegeneration zu studieren verwendet wird.

Procedure

Gen-Silencing-Techniken sind auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie gebräuchlich. Morpholino Knockdown Ansätze erlauben routinemäßig Forscher zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene wichtige zelluläre Prozesse beteiligt. Antisense Morpholinos sind jetzt sehr beliebt in vielen Modellsystemen, einschließlich Mäuse, Küken und Zebrafisch, durch ihre hohe Wirksamkeit, hohe Spezifität und niedrige Kosten.

Dieses Video bietet einen Überblick Morpholino Mechanismen und Strategien der Mikroinjektion, experimentelle Schlüsselkontrollen und wie Morpholinos in Laboren heute verwendet werden, um vertebrate Entwicklung zu untersuchen.

Morpholinos entstanden zunächst als eine Möglichkeit, die Übersetzung von RNA-Transkripte in lebenden Zellen und Organismen zu hemmen. Im Allgemeinen sind Morpholinos synthetische Moleküle bestehend aus 25 Oligonukleotide durch ein neutral geladenen Backbone verbunden.

Aber obwohl Morpholinos DNA viel aussehen kann, sie enthalten Morpholine Ringe anstelle der Zuckergruppen in Phosphat Zucker Rückgrat gefunden. Diese einfache Konvertierung Morpholino Stabilität in den Zellen erhöht und senkt ihre Kosten der Produktion.

Innerhalb der Zellen werden Morpholinos auf die RNA von Interesse durch komplementäre Basenpaarung ausgerichtet. Die Lage auf der RNA wo die Morpholino hybridisiert bestimmt seine spezifischen Wirkmechanismus.

Spleiß-blocking Morpholinos binden an spezifische Kreuzungen und ordnungsgemäße Niederschrift Verarbeitung, während Übersetzung-blocking Morpholinos innerhalb der 5′ unübersetzte Region des Gens in der Nähe der translationalen Startsite binden und verhindern, Ribosom Versammlung dass zu hemmen. Beide Arten von Morpholinos reduzieren Ausdruck des funktionalen Zielproteine.

Bei der Planung ein Experiment mit Morpholinos gibt es ein paar wichtige Aspekte im Auge zu behalten. Morpholinos kann in mehreren Modellsystemen verwendet werden, daher es wichtig ist, ein Modell auszuwählen, die in der Lage ist, die biologische Frage auf der hand.

Morpholinos sind kommerziell synthetisiert, sollte und professionelle Design-Unterstützung gibt es ohne Kosten für Forscher, weil sie Sequenz-spezifische sind, gen-Informationen für alle spezifischen Morpholino Ziele jedoch aus der Region vor dem design.

Oft gibt es im Zebrafisch Modellsystem zwei Kopien einzelner Gene, die in anderen Wirbeltieren, aufgrund einer Vollständiggenom Vervielfältigung Ereignis in einem evolutionären Vorfahren der Zebrafisch gefunden. Daher kann Knockdown von beiden Zebrafisch-Gene erfolgreich Modell Protein Mängel in der menschlichen Entwicklung erforderlich.

Gute experimentelle Kontrollen zu entwerfen ist genauso wichtig wie Ihre gezielte Morpholinos entwerfen. Alle angegebenen Morpholino kann spezifische Sequenzen auf verschiedene Gene binden. Es ist ratsam, unabhängige, nicht-überlappende Morpholinos ergänzen das gleiche gen zu verwenden, um sicherzustellen, dass eine beobachteten phänotypische Veränderung durch Knockdown von Ihrem gen von Interesse ist.

Nun, da wir Morpholino Versuchsanordnung behoben haben, lassen Sie uns schauen Sie sich wie Morpholinos in Zebrafisch eingebracht werden.

Hier beschreiben wir Morpholino Mikroinjektion in Zebrafisch. Für weitere Einblicke und Anleitung über die Einzelheiten der Mikroinjektion unter dem Titel bitte Referenz Jupiter Science Education video “Zebrafisch Mikroinjektion Techniken.”

Morpholinos sind in der Regel in Zebrafisch-Embryonen zwischen den – und vier-Zell-Stadium, in das Eigelb injiziert oder Zelle Zytoplasma. Zytoplasmatischen Verbindungen zwischen embryonalen Zellen ermöglichen schnelle Verbreitung und allgegenwärtige Bereitstellung von wasserlöslichen Morpholinos im gesamten Organismus. Morpholinos sind stabil in den Zellen, da die Zebrafish Embryos bei 28,5 ° c angehoben wird

Optimale Einspritzung Konzentrationen und Mengen müssen für jede Morpholino empirisch getestet werden. In der Regel ist die niedrigste Dosis, die bei der gibt es ein definierter zuverlässige Phänotyp in mindestens 50-75 % der injizierten Embryonen verwendet, um embryonale Tödlichkeit oder Ziel Nebenwirkungen zu vermeiden.

Die meisten Morpholino Zebrafisch Phänotypen werden in den ersten drei Tagen nach Befruchtung identifiziert, und Gen-silencing ist in der Regel wirksam durch Tag fünf. Bei Splice-blocking Morpholinos kann RT-PCR zur relative Mengen der einheimischen und veränderte Abschriften zu identifizieren. Für Übersetzung-blocking Morpholinos können Ebenen der gen-Knockdown von Western-Blot beurteilt werden.

Die rasante äußere Entwicklung und Transparenz der Zebrafisch-Embryonen ermöglicht einfache Beobachtung der vielen frühen biologischen Prozessen. Morpholino Phänotypen können häufig durch die Analyse der Morphologie mit Hellfeld oder Fluoreszenz-Mikroskopie, sowie durch die Beurteilung von Verhalten gewertet.

Nachdem der Morpholino Phänotyp definiert wurde, kann RNA Rettung durchgeführt werden, um Ziel-Spezifität demonstrieren. Nach Morpholino Knockdown von endogenen mRNA ist synthetisches mRNA injiziert, die das gleiche Protein kodiert, aber enthält keine Morpholino Zielsequenz. Ist diese injizierten RNA, den Wildtyp Phänotyp des Organismus wieder herzustellen, können wir feststellen, dass die beobachteten Morpholino-Phänotyp ist speziell durch das Zielgen abgerissen bekommen.

Jetzt haben Sie eine Gefühl für was Morpholinos sind und wie kontrollierte Morpholino Experimente durchgeführt werden können, lassen Sie uns betrachten wie Morpholinos in biologischen Laboren heute umgesetzt werden.

In der Zellbiologie werden Morpholinos zur frühen Entwicklungsprozessen zu verstehen. Zilien erzeugte Strömung in Kupffer Vesikel ist ein Beispiel, das rechts-links-Muster im Zebrafisch steuert. Strömung verläuft gegen den Uhrzeigersinn in Kontrolle injiziert Embryonen während Stummschaltung eines Gens, das ciliated Zelle Organisation regelt flüssige Geschwindigkeit und Richtung stört.

Morpholinos eignen sich auch sehr schnell und zuverlässig modellieren menschliche Erbkrankheiten. Verlust der Funktion Phänotypen können leicht reproduziert werden durch Manipulation der Proteinexpression, wie in einem Zebrafisch-Modell der menschlichen Dysplasie Anzeige Nieren Zysten, Herzbeutel Ödem und eine geschwungene Rute zu sehen. Darüber hinaus können pathogene Mutationen schnell in vivo untersucht werden mithilfe von Wildtyp oder mutierte mRNA Morpholino Krankheit Phänotypen zu retten.

Da Morpholinos in lebende Zellen auf unterschiedliche Weise eingeführt werden können, sind sie hoch geschätzt, im Studium der Organregeneration und Entwicklung. Mikroinjektion gefolgt durch elektrische Stimulation der Morpholinos in bestimmten Geweben ermöglichte Forscher Fin Wachstum und Netzhaut Bildung im Erwachsenen Zebrafisch zu studieren.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Gen-silencing mit Morpholinos beobachtet. In diesem Video haben wir die Struktur und Mechanismus der Morpholinos, gängige Anwendungen für die Verwendung und wichtige Möglichkeiten, um die Wirksamkeit zu beurteilen und Wirkungen der gezielte Gen-silencing diskutiert. Weil sie einfach zu gestalten sind, bleibt sehr spezifisch und kostengünstige, Morpholinos ein bedeutender Akteur auf dem Gebiet der reversen Genetik helfen, um Gene, die in Krankheit und Entwicklung funktionell zu analysieren. Danke fürs Zuschauen!

Transcript

Gene silencing techniques are commonly used in the field of developmental biology. Morpholino-based knockdown approaches routinely allow researchers to both identify and characterize genes involved in important cellular processes. Antisense morpholinos are now widely popular in many model systems, including mice, chicks, and zebrafish, due to their high efficacy, high specificity, and low cost.

This video will provide an overview of morpholino mechanisms and microinjection strategies, key experimental controls, and how morpholinos are being used in labs today to investigate vertebrate development.

Morpholinos were first developed as a way to inhibit the translation of RNA transcripts in living cells and organisms. Generally, morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone.

But although morpholinos may look a lot like DNA, they contain morpholine rings in place of the sugar groups found in phosphate sugar backbone. This simple conversion increases morpholino stability in cells, and lowers their cost of production.

Inside cells, morpholinos are targeted to the RNA of interest by complementary base pairing. The location on the RNA where the morpholino hybridizes determines its specific mechanism of action.

Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, whereas translation-blocking morpholinos bind within the 5′ untranslated region of the gene near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types of morpholinos reduce expression of functional target proteins.

When planning an experiment using morpholinos, there are a few important considerations to keep in mind. Morpholinos can be used in several model systems, so it is important to select a model that is able to address the biological question at hand.

Morpholinos are commercially synthesized, and professional design assistance is available at no cost to researchers, but because they are sequence-specific, gene information for all specific morpholino targets should be sourced prior to design.

In the zebrafish model system, there are often two copies of single genes found in other vertebrates, due to a whole-genome duplication event that occurred in an evolutionary ancestor of the zebrafish. Therefore, knockdown of both zebrafish genes may be necessary to successfully model protein deficiencies in human development.

Designing good experimental controls is just as important as designing your targeted morpholinos. Any given morpholino can bind to specific sequences on different genes. It is advisable to use independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene, in order to ensure that an observed phenotypic change is due to knockdown of your gene of interest.

Now that we’ve addressed morpholino experimental design, let’s have a look at how morpholinos are introduced into zebrafish.

Here, we will describe morpholino microinjection into zebrafish. For more insight and instruction on the details of microinjection, please reference the JoVE Science Education video entitled “Zebrafish Microinjection Techniques.”

Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. Morpholinos are stable in cells, since the zebrafish embryo is raised at 28.5°C.

Optimum injection concentrations and volumes must be empirically tested for each morpholino. Typically, the lowest dose at which there is a defined reliable phenotype in at least 50-75% of injected embryos is used in order to avoid embryonic lethality or unwanted off-target effects.

Most morpholino zebrafish phenotypes are identified in the first three days post-fertilization, and gene silencing is generally effective through day five. In the case of splice-blocking morpholinos, RT-PCR can be used to identify relative amounts of native and altered transcripts. For translation-blocking morpholinos, levels of gene knockdown may be assessed by Western blot.

The rapid external development and transparency of zebrafish embryos allows for easy observation of many early biological processes. Morpholino phenotypes can commonly be scored by analyzing morphology using brightfield or fluorescence microscopy, as well as by assessing behavior.

After the morpholino phenotype has been defined, RNA rescue can be performed to demonstrate target specificity. Following morpholino knockdown of the endogenous mRNA, synthetic mRNA is injected, which encodes the same protein, but does not contain the morpholino target sequence. If this injected RNA is able to restore the wild-type phenotype of the organism, then we can conclude that the observed morpholino phenotype is specifically due to the target gene getting knocked down.

Now that you have a feel for what morpholinos are and how controlled morpholino experiments can be performed, let’s look at how morpholinos are being applied in biological labs today.

In cell biology, morpholinos are used to understand early developmental processes. Cilia-generated fluid flow in Kupffer’s vesicle is one example, which controls left-right patterning in zebrafish. Fluid flow runs counterclockwise in control-injected embryos, whereas silencing of a gene that regulates ciliated cell organization disrupts fluid speed and direction.

Morpholinos are also very suited to quickly and reliably model human genetic diseases. Loss-of-function phenotypes can be easily reproduced by manipulating protein expression, as seen in a zebrafish model of human dysplasia displaying kidney cysts, pericardial edema, and a curled tail. Additionally, pathogenic mutations can be rapidly assayed in vivo by using wild-type or mutant mRNA to rescue morpholino disease phenotypes.

Since morpholinos can be introduced into living cells in different ways, they are highly valued in studying organ regeneration and development. Microinjection followed by electrical stimulation of morpholinos into specific tissues has allowed researchers to study fin growth and retina formation in adult zebrafish.

You’ve just watched JoVE’s introduction to gene silencing with morpholinos. In this video, we’ve discussed the structure and mechanism of morpholinos, common applications for use, and important ways to assess efficacy and effects of targeted gene silencing. Because they are easy to design, highly specific, and cost-effective, morpholinos will remain a significant player in the field of reverse genetics, helping to functionally analyze genes involved in disease and development. Thanks for watching!

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