Verwendung Ex Vivo Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen von niedermolekularen Inhibitoren auf die Entwicklung fetaler Organe mit Hilfe einer ex vivo Tröpfchenkulturtechnik zu untersuchen. Dazu wird zunächst das Bauchfell einer trächtigen Maus geöffnet und der Embryo mit der Gebärmutter entfernt. Anschließend werden die Embryonen aus der Gebärmutter entnommen und aus dem Eigelb und den Fruchtblasen befreit.

Dann wird der Goad me neph Komplex präpariert und aus dem Embryo isoliert. Schließlich wird der Goad-Meris-Komplex in einem Tröpfchen mit oder ohne einen niedermolekularen Inhibitor kultiviert. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um Veränderungen in der Organarchitektur mit Hilfe von zelltypspezifischen Antikörpern darzustellen.

Der Vorteil unserer aufrechten Tröpfchenkultur für ganze Organe ex vivo im Vergleich zu beispielsweise Zellkulturlinien besteht darin, dass sie den Vorteil hat, dass sie eine dreidimensionale Struktur hat, die aufgrund der Lokalität zu zellulären Wechselwirkungen führt, sowie der extrazellulären Matric-Signalgebung, die für die Organbildung und -musterung wichtig sein kann. Darüber hinaus ermöglicht unsere aufrechte Tröpfchentechnik, dass weniger Reagenzien verwendet werden, wodurch die Kosten und die potenzielle Toxizität aufgrund von Nebenwirkungen reduziert werden. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Ganzorgantechniken und ermöglicht immer noch die Diffusion pharmakologischer Wirkstoffe zum Zielorgan.

Obwohl diese Technik Einblicke in die vaskuläre Entwicklung des fötalen Hodens geben kann, kann sie auch auf andere fötale Organe wie die Lunge angewendet werden, und wir können sie auch zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse verwenden. Es gibt weitere zelluläre Signalwege während der fetalen Entwicklung Bei E 11.5. Nach dem Einschläfern der schwangeren Maus laut Text mit 70%igem Ethanol den Bauch mit einer feinen Schere einsprühen.

Machen Sie einen V-förmigen Schnitt, um die Bauchhaut und das Bauchfell zu öffnen, und ziehen Sie den Gewebelappen zurück, um die vorderen Organe freizulegen. Lokalisieren Sie die Eierstöcke an beiden Enden des Gebärmutterhorns und trennen Sie dann mit einer Schere den Eierstock und das Bindegewebe, um die Gebärmutter mit den Embryonen vom Körper der Mutter zu trennen. Öffnen Sie anschließend die Gebärmutterwand, indem Sie die der Plazenta gegenüberliegende Seite vorsichtig abschneiden und die Dottersäcke freilegen.

Achten Sie darauf, den Dottersack nicht zu durchstechen, um Embryonen nicht zu beschädigen oder zu verlieren. Schneiden Sie dann in der Nähe der Plazenta, um den Embryo mit Dottersäcken zu entfernen, und legen Sie sie in eine Schale, die PBS mit Kalzium und Magnesium enthält, das die Zelladhäsionsmoleküle unterstützt, um die Gewebearchitektur zu erhalten und zu verhindern, dass das Gewebe an den Werkzeugen klebt. Entfernen Sie mit einer Pinzette den Dottersack und das Amnion vom Embryo, indem Sie den Dottersack vorsichtig durchstechen, um ein Loch zu schaffen, in dem der Embryo herausrutschen kann. Sobald sich ein Embryo außerhalb des Dottersacks befindet, durchtrennen Sie die Nabelschnur.

Verwenden Sie von diesem Zeitpunkt an ein Mikroskop, das sich in einer sterilen Gewebekulturhaube befindet. Entfernen Sie den Kopf des Embryos, indem Sie ihn mit einer Pinzette auf beiden Seiten des Halses einklemmen, entsorgen Sie den Kopf, entfernen Sie den Schwanz und legen Sie ihn in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen für die X-Y-P-C-R-Analyse, um das Geschlecht des Embryos zu bestimmen. Befestigen Sie nun den Embryo in Rückenlage am Boden der Kulturschale, indem Sie die Achselhöhlen des Embryos mit einer weiteren Pinzette mit einer Pinzette feststecken.

Entfernen Sie die Haut, die den Bauch bedeckt, und entfernen Sie vorsichtig die Leber, den Darm und andere Organe, um die hintere Körperwand freizulegen, an der sich der Urogenitalkamm befindet. Schaufeln Sie mit der Pinzette unter dem Urogenitalkamm, indem Sie die Pinzette vorsichtig öffnen und anheben. Entfernen Sie den Urogenitalkamm.

Achten Sie darauf, die Keimdrüsen nicht zu beschädigen. Übertragen Sie den Urogenitalkamm in eine Schale mit C-D-M-E-M, um das Gewebe mit 27 Gauge-Nadeln an das Medium zu gewöhnen, um den Gonaden-Sphs-Komplex vom Rest der Urogenitalbrücke zu trennen. Verwenden Sie eine Nadel zum Schneiden, indem Sie nach unten drücken, und die andere, um das Gewebe richtig zu führen, um eine optimale Trennung zur Kultur zu ermöglichen.

Die Gonade mit einem niedermolekularen Inhibitor setzte zwei 20-Mikroliter-Pipetten mit einer sauberen, sterilisierten Rasierklinge auf je 15 Mikroliter. Schneiden Sie etwa ein bis zwei Millimeter von einer der Pipettenspitzen der Barriere ab, um die Gonaden zu übertragen und die Steuerung C-D-M-E-M hinzuzufügen. Richten Sie die Gonaden mit ihrer Längsachse parallel zur Pipettenspitze aus, so dass sie leicht mit einer abgeschnittenen Spitze pipettiert werden können. Beschriften Sie eine Seite eines 35-Millimeter-Schalendeckels als Kontrolltröpfchen und die andere als das tröpfchenhaltige Medikament.

Stellen Sie sicher, dass die Etiketten auf den Deckeln mit den Etiketten auf dem Schwanzgewebe übereinstimmen, das Mikrozentrifugenröhrchen enthält. Pipettieren Sie 15 Mikroliter C-D-M-E-M, das eine einzelne Gonade enthält, in ein Tröpfchen im Deckel. Achten Sie darauf, dass die Gonaden nicht an der Innenseite der Pipettenspitze kleben bleiben, und wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Tröpfchen auf der anderen Seite.

Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Gonaden auf das Tröpfchen übertragen wurden, das als Kontrolle vorgesehen ist. Verwenden Sie die Kontrollpipette, um weitere 15 Mikroliter C-D-M-E-M hinzuzufügen, das DMSO enthält, um ein Tröpfchen von 30 Mikrolitern auf das andere Tröpfchen zu erhalten. Verwenden Sie die für das Medikament vorgesehene Pipette, um mit der Pipette 15 Mikroliter TKI hinzuzufügen, zwei in C-D-M-E-M.

Verteile die Tröpfchen in einem expandierenden kreisförmigen Muster, bis sie einen Durchmesser von etwa 15 bis 18 Millimetern haben und sich die Keimdrüse etwa in der Mitte befindet. Richten Sie die Keimdrüse so aus, dass sie auf der Seite liegt und der Stachel und die Messinen leicht zu erkennen sind. Richten Sie die Lunge so aus, dass die beiden Lungenlappen flach aufliegen und durch die Oberflächenspannung an Ort und Stelle gehalten werden, ohne sich zu berühren.

Legen Sie den Deckel der Kulturschale mit den Tröpfchen aufrecht und flach auf der Wasseroberfläche liegend vorsichtig in eine große Befeuchterschale und achten Sie darauf, dass sich keine Blasen darunter eingeschlossen haben und kein Wasser in den Deckel gelangt. Um eine kleine Befeuchtungskammer zu schaffen, decken Sie die große Schale sofort mit dem Deckel ab und stellen Sie sicher, dass sich die kleinen Schalendeckel in der größeren Schale frei bewegen können und ein Luftaustausch stattfinden kann. Sobald die beiden kleinen Deckel in die Kammer eingesetzt wurden, stellen Sie die Kammer sofort für 48 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Kohlendioxid-Inkubator.

PCR und Immunfluoreszenz gemäß Textprotokoll durchführen. Bei der Kultivierung mit dem Exvivo-Tröpfchenkultursystem haben fetale Gona sphs-Komplexe eine hohe Überlebensrate, wie hier gezeigt. Vergleiche der E 11,5-Gonaden bei der Erstinkubation mit 24 oder 48 Stunden in Kultur zeigen eine dramatische Veränderung der Gonadenform und des Auftretens streifenförmiger Schnurstrukturen in der Kontroll-XY-Gonade, wie hier zu sehen.

Das Tröpfchenkultursystem kann Hodendifferenzierungsereignisse ex vivo nachbilden, da es möglich ist, SOX-Neun-positive Sertoli-Zellen in XY-Gonaden zu visualisieren, die sich zu tuboartigen Schnüren und Gefäßen bilden, die sich im gesamten Organ bilden. In der Lunge führt die 48-Stunden-Kultur zu einer erhöhten Verzweigung der doppelt positiven Epitheläste von SOX nine eco herrin. Während es eine gewisse Zunahme apoptotischer Zellen in der Lunge gibt, werden unter gleichen Kulturbedingungen ähnliche Apoptoseniveaus in Kontrollkulturen und in utero beobachtet.

Keimdrüsen, die darauf hindeuten, dass die Keimdrüse den Kulturbedingungen besonders zugänglich ist. Um die Auswirkungen der Vaskularisierung und des vaskulären Umbaus auf die Morphogenese der Hoden zu untersuchen, wurde der niedermolekulare Inhibitor TKI two verwendet, der die Aktivität der VEGF-Rezeptoren blockiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Störung des Gefäßumbaus im fetalen Hoden im Tröpfchenkultursystem wirksam ist und nachfolgende Defekte in der Hodenstrangmorphogenese nach diesem Verfahren sichtbar gemacht werden können.

Andere Methoden wie quantitative Echtzeit-PCR, Next-Generation-RNA-Sequenzierung oder Durchflusszytometrie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie verschiedene pharmakologische Reagenzien die Expression von Proteinen oder Genen von Interesse beeinflussen. Darüber hinaus können wir Zeitraffer-Live-Bildgebung verwenden, um die zelluläre Dynamik in Echtzeit zu visualisieren, wenn transgene fluoreszierende Embryonen verwendet werden. Darüber hinaus steht eine breite Palette von Reagenzien zur Verfügung, um auf mögliche Signalwege abzuzielen, die an der Organogenese des Fötus beteiligt sein könnten.

Diese Techniken werden uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, die die Entwicklung des Fötus vorantreiben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ganze Organe ex vivo aufrechte Tröpfchenkulturen durchzuführen, um die Signalwege während der fetalen Organogenese aufzuklären. Diese Technik umfasst die Dissektion von Embryonen in der Mitte der Schwangerschaft, die Isolierung von Zielorganen und die Vorbereitung aufrechter Tröpfchenkulturen für die Inkubation dieser Organe mit pharmazeutischen Reagenzien.