Beurteilung der immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs)

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die immunmodulatorischen Eigenschaften menschlicher mesenchymaler Stammzellen oder msc zu bewerten. Diese Methode kann helfen, die an der Immunmodulation durch menschliche mesenchymale Stammzellen beteiligten Mechanismen aufzuklären, ein Vorgang, der therapeutische Relevanz haben könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sowohl das Auftreten der Effektor-Leukozytenproliferation als auch die Anzahl der Zellteilungen bewertet werden können, was zeigt, dass das Verfahren pro Schuh durchgeführt wird.

Eine Technikerin aus meinem Labor beginnt mit der Isolierung von PBMC, indem sie 25 Milliliter einer heparinisierten Vollblutprobe mit 25 Millilitern PBS in einem 50-Milliliter-Konischgefäß verdünnt. Anschließend werden 15 Milliliter einer Ficoll-Paque-Dichtegradientenlösung in ein neues 50-Milliliter-Gefäß gegeben. Dann wird das verdünnte Zellsuspension unter leichtem Neigen des Gefäßes vorsichtig schichtweise über den Dichtegradienten aufgeschichtet.

Wenn dies beachtet wird, kommt es zu keiner Durchmischung der Schichten. Einer der kritischsten Schritte in diesem Experiment ist das vorsichtige Aufschichten des Blutes, ohne das Dichtegradientenmedium zu stören. Dies dient dazu, eine hohe Reinheit und eine geringe Kontamination mit roten Blutkörperchen in den isolierten PBMC sicherzustellen.

Nun die Zellen durch Zentrifugation trennen. Es sollten sich drei deutliche Schichten zeigen: die obere Plasmaschicht, die untere Fial-Pak-Dichtegradientenschicht und eine dünne mittlere PBMC-Schicht.

Entfernen Sie mit einer PE-Pipette die obere Schicht, wobei darauf geachtet werden muss, die Interphasenschicht nicht abzusaugen. Übertragen Sie dann vorsichtig das PBMC mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein 50-Milliliter-Konischrohr. Vermischen Sie die Zellen mit 20 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie sie anschließend, um geringste Reste der Dichtegradientenlösung zu entfernen.

Waschen Sie das Pellet anschließend in weiteren 20 Milliliter PBS, um die Thrombozyten zu entfernen. Resuspendieren Sie das zweite Pellet in vollständigem Leukozytenmedium bei einer Konzentration von einer mal 10 hoch 7 Zellen pro Milliliter. Um eine MSC-Leukozyten-Kokultur anzusetzen, erwärmen Sie das vollständige MSC-Medium vorab auf 37 Grad Celsius, und zwar nicht länger als 30 Minuten.

Dann säen Sie fünf mal 10 hoch vier MSC pro Milliliter vollständigem MSC-Medium pro Vertiefung in 24-Vertiefungs-Platten für die nächtliche Anheftung bei 37 Grad Celsius aus, sodass die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen. Am nächsten Morgen aspirieren Sie das Medium und geben die entsprechende Anzahl CFSE-markierter PBMCs in einem Milliliter vollständigem Leukozyten-Medium zu den MSC hinzu. Aktivieren Sie die Zellen im Verhältnis von 1:10 (MSC zu PBMC) mit 10 Mikrogramm PHA pro Milliliter vollständigem Leukozyten-Medium.

Anschließend überführen Sie am dritten und fünften Tag der Ko-Kultur die entsprechende Anzahl der Ko-Kultur in runde Röhrchen mit abgerundetem Boden und bewerten die Proliferation der mit CFSE markierten Leukozyten durch Durchflusszytometrie-Analyse, um einen Effektor-Suppressions-Assay durchzuführen. Beginnen Sie damit, eine MSC-PBMC-Ko-Kultur wie zuvor gezeigt aufzusetzen, wobei 2,5 × 10⁶ PBMCs mit 250.000 MSCs ko-kultiviert werden. Dies dient der Sicherstellung ausreichender MSC-PBMCs für die Selektion von Teilpopulationen.

Nach 48 bis 72 Stunden bei 37 Grad Celsius werden die gewünschten mit MSC induzierten immunmodulatorischen Leukozyten mit den entsprechenden magnetischen Mikrokügelchen ausgewählt. Anschließend werden CFSE-markierte allogene CD4-positive T-Zellen in je einem Milliliter vollständigem Leukozytenmedium pro Vertiefung in verschiedenen experimentellen Verhältnissen hinzugefügt. Danach werden anti-CD3/28-konjugierte Mikrokügelchen im Verhältnis 1:1 (Kügelchen zu Zelle) zugegeben, um die CD4-positiven T-Zellen zu stimulieren.

Am dritten Tag der Kultur mit gemeinsamer Züchtung bewerten Sie die Proliferation der mit CFSE markierten CD4-positiven T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. MSCs sind adhärente Zellen mit einer fibroblastischen, spindelförmigen Morphologie, während PBMCs und Leukozyten kleine, runde, nicht-adhärente Zellen sind, was eine klare Unterscheidung dieser beiden Zellpopulationen ermöglicht. In einer Kultur mit gemeinsamer Züchtung wird, wenn keine Proliferation stattfindet, ein einzelner, stark positiver und scharf fluoreszierender Peak der mit CFSE markierten Zellen beobachtet, sobald die Zellen aktiviert wurden.

Die Proliferation zeigt sich als mehrere kleinere Peaks mit einem Verlust und einer nach links verschobenen Fluoreszenzintensität, wenn eine Proliferationshemmung aufgetreten ist. Zum Beispiel nimmt bei einer MSC-Kokultur die Anzahl der kleineren Peaks ab, während gleichzeitig die Fluoreszenzintensität zunimmt, was sich in einer Verschiebung der Peaks nach rechts und einer Zunahme der Schärfe des rechtesten Peaks zeigt, der die nicht teilenden Zellen in einem Effektor-Suppressionsassay darstellt. Der suppressive Effekt der MSC auf die Proliferation von CD4-positiven T-Zellen kann zusätzlich dosisabhängig bewertet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die immunmodulierenden Eigenschaften menschlicher mesenchymaler Stammzellen beurteilt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen gefährlich sein kann und stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.