Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die intrazelluläre Genexpression direkt in lebenden Zellen durch die Anwendung von genspezifischen fluoreszierenden Nanopartikeln zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die entsprechenden Zielsequenzen im interessierenden Gen definiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Nanopartikel mit spezifischen Einfang- und Reportersträngen herzustellen.

Anschließend werden die Nanopartikel direkt in das Kulturmedium der lebenden Zelle gegeben. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen mit den Nanopartikeln über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre zu inkubieren. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die genspezifische Fluoreszenz in lebenden Zielzellen sichtbar zu machen, während die Durchflusszytometrie-Analyse verwendet wird, um die Anzahl der fluoreszierenden Zellen zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Immunhistochemie, molekularen Beacons oder PCR-Analysen besteht darin, dass die Genexpression in lebenden Zellen visuell beobachtet werden kann, ohne dass die Zellkultur manipuliert werden muss. Das Verfahren wird von Martina Teresa, Biologin und Doktorandin aus unserem Labor, Lynette Henkel, für die Durchflusszytometrie vorgeführt. Nach der Bestimmung der Zielsequenzen werden lyophilisierte Goldnanopartikel aus kommerziell erhältlichen Quellen bestellt.

Diese Partikel bestehen aus einem zentralen Goldpartikel, das kovalent mit einem Einfangstrang verbunden ist, der an einen Reporterstrang gebunden ist. Wenn die Ziel-mRNA an den Fängerstrang bindet, werden der Reporterstrang und sein verknüpftes Fluorophor in die Lösung freigesetzt, so dass das Fluor vier Fluoreszenz emittieren kann. Vor der Rekonstitution.

Die Nanopartikel sollen bei vier Grad Celsius im Dunkeln in einem Karton gelagert werden. Um die Goldnanopartikel zu rekonstituieren, fügen Sie 20 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu, was zu einer Endkonzentration von 100 Nanomolaren führt. Die rekonstituierten Nanopartikel können bei Raumtemperatur im Dunkeln mindestens ein Jahr gelagert werden.

Am Tag der Anwendung verdünnen Sie die Stammlösung von Goldnanopartikeln zu einer 20-fachen Arbeitslösung in PBS, nehmen Sie eine 24-Well-Platte mit HEK 2 93 Zellen aus dem Zellkulturinkubator, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie dann 237,5 Mikroliter frisches Kulturmedium hinzu, pipettieren Sie dann 12,5 Mikroliter der Arbeitslösung aus Nanopartikeln in jede vorbereitete Vertiefung und schwenken Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre. Am nächsten Tag.

Analysieren Sie die Zellkulturen mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop auf genspezifische Fluoreszenzstelle drei, um die Zellen für die Durchflusszytometrie vorzubereiten. Waschen Sie die HEK 2 9 3 Zellen mit der induzierten Fluoreszenz auf Seite drei einmal mit PBS und fügen Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin EDTA hinzu, inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach der Inkubation 0,5 Milliliter CO-Medium zugeben und auf und ab pipettieren.

Übertragen Sie dann die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie drei Milliliter Nährmedium hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 mal G. Entfernen Sie anschließend das Sat und reaktivieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern eiskaltem Faxpuffer. Füllen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Analyse im Dunkeln auf Eis.

Führen Sie die Zellen vor der Faxanalyse durch einen 30-Mikrometer-Filter, um eine Zellaggregation zu verhindern. Geben Sie dann Propidiumiodid in einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter für mindestens zwei Minuten in die Zellen, bringen Sie die Zellen zum Durchflusszytometer-Wirbel und laden Sie das Probenröhrchen auf das Gerät. Zum Nachweis von SI drei positive Zellen.

Verwenden Sie unbehandelte Kontrollzellen, um die hierarchischen Gatter für die Vorwärtsstreuung oder den FSC-Bereich im Vergleich zur Seitenstreuung oder SSC-Bereichsteilmenge, die FSC-Höhe im Vergleich zu FSC mit Teilmenge und die SSE-Höhe im Vergleich zu SSE mit Teilmenge festzulegen, um Zellreste und nicht verstreute Zellen auszuschließen. Entfernen Sie die toten Zellen aus der Analyse auf der Grundlage der Propidiumiodid-Färbung, indem Sie den PE-Kanal gegen den PE Texas Red Channel anzeigen und dann das endgültige Sortiertor vor Ort mit drei PE-positiven Zellen durchführen. Nachweis von GA dh.

Ein konstitutiv exprimiertes Housekeeping-Gen wurde in HEK 2 93 Zellen durchgeführt, um die experimentelle Machbarkeit zu validieren. Verschlüsselte Negativkontroll-Nanopartikel zeigen wenig bis gar keine Fluoreszenz, während sie dauerhaft positive Aufnahme aufweisen. Die Kontrollen zeigen nach Inkubation über Nacht ein starkes Signal.

Es wurde gezeigt, dass diese Nanopartikel spezifisch die pluripotenten Stammzellmarker, die Nano- und GDF-3-Genexpression bei der Spiegelung von humanen und schweineinduzierten pluripotenten Stammzellen oder IPCs nachweisen. Wichtig ist, dass diese Marker nur in den IPCs und nicht in den Fibroblastenzellen nachgewiesen wurden, die während der IPS-Zellkultur als Feeder-Schicht dienten. Sowohl die visuelle als auch die quantitative Analyse mittels Durchflusszytometrie wurden verwendet, um die Markierungseffizienz von GA DH-Nanopartikeln mit einer abgestuften Edition von Nanopartikeln von null bis 1000 zu bewerten.

PICO molar wurde mit HEK 2 93 Zellen durchgeführt, die einen deutlichen konzentrationsabhängigen Anstieg der Fluoreszenz zeigten. Anschließend wurde eine quantitative Analyse an murinen embryonalen Stammzellen durchgeführt, die nach der Ausgabe von 400 PICOMOLAR GA DH-Nanopartikeln etwa 40 % CY drei positive Zellen aufwiesen. Ähnliche Werte wurden für die Pluripotenzmarker erhalten.

Nano und GDF drei Einmal gemeistert. Diese Technik kann innerhalb von 16 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genspezifische Nanopartikel verwenden können, um intrazelluläre Genexpression direkt in lebenden Zellen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie nachzuweisen.