Name: Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Lernen Sie eine minimal-invasive Methode zur wiederholten Blutentnahme bei adulten Zebrafischen. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Blutbiochemie und Glukosestoffwechsel ohne Verletzung der Tiere.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 und 25590073. Wir bedanken uns bei Frau Yui Namie für die handgezeichnete Illustration und bei Herrn Koshi Kataoka und Frau Sayuri Ichikawa für die Unterstützung bei der Pflege der Zebrafische.

Alle tierischen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Universität Mie genehmigt und wurden gemäß den japanischen Tierschutzverordnung &quot;Gesetz über die Wohlfahrt und Verwaltung von Animals &#39;(Ministerium für Umwelt, Japan) durchgeführt und mit den internationalen Richtlinien eingehalten werden. 1. Herstellung der Nadel HINWEIS: Alle Experimente wurden unter Vollnarkose durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, um das Leiden zu minimieren. Um Sterbehilfe, Fische wurden in einem Eis-Wasser-Bad (at ≤4 ° C 5 Teile Eis / 1 Teil Wasser) für ≥20 min eingetaucht. <ol><li> Bereiten Sie die Glas Mikrokapillare Nadeln durch Ziehen einer Glaskapillare 1,0-mm-Außendurchmesser mit einer Nadel puller (Abbildung 1A). </li><li> Schneiden Sie die Spitzen der Nadeln schräg mit einer feinen Schere (1B). 200 &amp; mgr; m (Abbildung 1c) - der ideale Spitzendurchmesser sollte etwa 100 sein. Wenn die Spitze diameter zu schmal ist, wird Blut nicht in die Nadel. </li><li> Aufzulösen Heparin in Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5 mg / ml. </li><li> Legen Sie eine vorgeschnittene Nadel im Objektivrevolver Ende einer Wasserstrahlpumpe Rohranordnung und halten Sie das Mundstück in den Mund, oder schließen Sie die Nadel in einer Glühbirne Spender. Tauchen Sie die Nadelspitze in der Heparin-Lösung und Heparinisierung die Nadel durch Saugen und Blasen durch die Lösung (Abbildung 1D und 1E). Hinweis: Das Ansaugrohr Montage für Zebrafisch Spermien Kryokonservierung 16 verwendet. Lange Gummischlauch kann kein Blut fliegen in den Mund zu stoppen. Setzen eines Filters in der Mitte der Röhre können die Gefahren zu vermeiden. </li><li> Bewahren Sie die heparinisierte Nadeln in einer 10 cm Petrischale und an der Luft trocknen für mindestens 1 Std. Eine große Anzahl von Nadeln im Voraus vorbereitet werden. </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Bereiten Sie die Anästhesielösung in einem kleinen Kunststoffgehäuse durch Mischen von 200 ml Fischwasser mit 100 ul 2-Phenoxyethanol (2-PE). Endkonzentration der Anästhetika ist 500 ppm. VORSICHT! 2-PE hat eine schnelle Wirkung. </li><li> Entfernen gewünschte Anzahl von Fischen (AB-Stamm) aus dem Kreislauf-System. </li><li> Verwenden Sie ein Netz, um die Fische in die Anästhetika für 1 übertragen - 2 min (1F). Beobachten Sie die Fische nach und nach zu schwimmen, zu verbreiten, die Brustflossen horizontal, Keuchen und haben schnelle Operculum Bewegungen innerhalb 1 min. </li><li> Wie die Zeit vergeht, beobachten die Fische lagen auf dem Boden des Gehäuses und schließlich zu stoppen Schwimmen. Die chirurgische Ebene der Anästhesie wird erreicht, wenn der Fisch stoppt nach Luft zu schnappen und die Operculum Bewegungen sind langsam. An dieser Stelle ist Fisch bereit für die Blutentnahme. </li><li> Mit einem Schaumlöffel heben Sie den narkotisierten Fisch aus dem 2-PE und legen Sie sie vorsichtig auf ein Papiertuch mit den Anästhetika (1G) eingeweicht. Bedecken Sie den Kopf des Fisches mit weichem Tissue-Papier auch mit 2-PE-Lösung getränkt, um Augentrockenheit zu verhindern, und verwenden Sie ein anderes trockenes weiches Seidenpapier vorsichtigtrocknen die Körperoberfläche. </li></ol> 3. Blutentnahme <ol><li> Legen Sie eine heparinisierte Nadel im Objektivrevolver Ende des Ansaugrohr-Baugruppe (oder der Glühbirne Spender) und halten Sie die Mundstückende des Ansaugrohr Montage in den Mund. </li><li> Fassen Sie den Objektivrevolver Ende und die Nadel zusammen, und entfernen Sie vorsichtig die störenden Waagen mit der Nadelspitze. Führen Sie die Nadel in einem 30 - 45 ° Winkel in den Blutsammel Website. Durchstechen des Gastrointestinaltraktes (Figur 1H) vermeiden. Im Falle der Verwendung von Lampenspender, drücken Sie die Lampe mit Daumen und Mittelfinger, und blockieren die Öffnung an der Spitze der Lampe mit dem ersten Finger, und setzen Sie die Nadel wie oben beschrieben. Hinweis: Der Ort für die Blutentnahme ist entlang der Körperachse und hinter dem Anus in dem Bereich des dorsalen Aorta. Der dorsalen Aorta (DA) und die hintere Cardinalvene (PCV) nur ventral zur Wirbelsäule (Abbildung 2). </li><li> Fangen Sie an, die saugenMundstückende des Ansaugrohres Anordnung, wenn die Nadel zu berühren die Wirbelsäule zu spüren. Wenn Blut steigt nicht, bewegen Sie die Nadelspitze auf subtile Weise von Hand, um die Durchblutung zu fördern. Beachten Sie, dass, wenn Blut in die Nadel steigen, sofort aufhören zu zittern und saugen sanft (1I). Im Falle der Verwendung von Lampenspender, den Druck der Glühbirne, um das Blut zu saugen. </li><li> Beachten Sie das Blut langsam pulsatil in die Nadel steigen ohne Absaugung, die wegen der arterielle Blutdruck wahrscheinlich ist. Somit ist es nicht notwendig ist, zu saugen, wenn die Nadel die Arterie richtig eindringt. </li><li> Stoppen Absaugung nach dem geeigneten Volumen Blut gesammelt. Entfernen Sie die Nadel aus dem Fisch und drücken Sie die Einstichstelle mit weichem Tissue-Papier, um Blutungen zu stoppen. Beachten Sie die Blutung zu stoppen nach ca. 10 - 20 sec von Fingerdruck (Abbildung 1J). </li><li> Nachdem die Blutung gestoppt ist, den Fisch sofort wieder zurück zu übertragen, um eine cleein Warmwasser (~ 28 ° C) Tank. Helfen Sie dem Fisch vorsichtig wirbelnden Wasser zu den Kiemen, bis es anfängt zu schwimmen zu erholen. Hinweis: Bewahren Sie bis zu 5 postsampling Fisch in einem 2 l-Tank und verbinden Sie den Tank in den Kreislauf-System, um die Fische mit Sauerstoff zu versorgen. Zugabe von Antibiotika zum Fischwasser nicht erforderlich ist. Pflegen Sie den Fisch mit normaler Haltung und Fütterung. </li><li> Vertreibt das Blut von der Nadel auf eine saubere Fläche von einem Stück Parafilm (Abbildung 1 K). </li><li> Messen Blutzucker mit jeder kommerziellen Hand glucometer (Abbildung 1 l). Anmerkung: Die glucometer verwendet eine Glucose-Dehydrogenase-Flavinadenindinucleotid Elektrode und erfordert ein Probenvolumen von 0,6 &amp; mgr; l. <ol><li> Legen Sie einen Teststreifen vollständig in das Messgerät und direkt berühren Sie den Blutstropfen. Automatisch Beachten Sie die Blutentnahme in den Teststreifen und erhalten die Blutzucker 5 Sekunden auf der Anzeigefläche. Nehmen Sie das Ergebnis und entsorgen Sie den Teststreifen. Benutze einenneuen Teststreifen für jede Messung. </li></ol></li><li> (optionaler Schritt) Nehmen genaue Mengen von Blut durch eine Pipettiervorrichtung und übertragen das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen für weitere Analysen (Hämoglobin, Triacylglycerin (TG), Gesamtcholesterin, etc.). Wenn nötig, verdünnen das Vollblut von einem Fisch mit Kochsalzlösung. Zentrifugieren der Blutproben für 3 min bei 680 · g bei RT und Ernte der Plasma. Übertragen des Plasmas in ein neues Röhrchen. An dieser Stelle ist es bereit, in biochemischen Analysen verwendet werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll zur seriellen Blutentnahme von erwachsenen Zebrafisch. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen und wir sie verwenden im Labor auf einer täglichen Basis. Das Blutsammelverfahren zum Einsetzen einer Glaskapillare Nadel in den Zebrafisch der dorsalen Aorta basiert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig zu sein, um nicht zu ablatieren die Wirbelsäule, weil sie das Kriterium für die Suche nach der dorsalen Aorta ist. Die Verringerung der Wirbelsäulenverletz...

Zebrafische sind gewinnt zunehmend an Popularität als ein wertvolles Modell der menschlichen Krankheiten, weil ihre Organe und Genetik ähnlich denen des Menschen 1,2 sind. Auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, haben viele Studien gezeigt, dass die Zebrafisch und Menschen zeigen deutliche Ähnlichkeit in der Hämatopoese 3, Blutstillung 4,5 und Myelopoese 6. Erwachsenen Zebrafisch sind ebenfalls für die Untersuchung immunologischer 7, neurodegenerative 8 und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten 9, weil dieses Modellorganismus Aktien gemeinsamen Wege mit denen in menschlichen Erkrankungen gestört verwendet. Für Übergewicht und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten (Diabetes, Fettleber und nichtalkoholische Steatohepatitis und Atherosklerose), Zebrafisch-Blutzucker und Lipide Ebenen wurden gründlich in mehreren transgenen und ernährungsbedingte Fettleibigkeit Modelle 10-13 untersucht. Wiederholte Entnahme von Blut aus einzelnen Tiere Tiernutzung und Dezember zu reduzierenRease interindividuelle Unterschiede. Jedoch ist wiederholte Probennahme wegen ihrer relativ kleinen Blutvolumen und der Mangel an leicht zugänglichen Gefäßen technisch schwierig bei kleinen Tieren wie Zebrafisch. Verschiedene Methoden für die einmalige Blutentnahme von Zebrafisch entwickelt, obwohl diese Methoden haben ihre eigenen Nachteile, einschließlich Letalität assoziiert Gewebeschäden und begrenzte Blutvolumen. B. 1-5 &amp; mgr; l Blut von einem seitlichen Einschnitt von etwa 0,3 cm in der Länge in dem Bereich des dorsalen Aorta 5 geerntet werden. Enthauptung mit einer Schere durch Schneiden durch den Schultergürtel kann 5-10 &amp; mgr; l Blut 10 zu sammeln. Eine weitere praktische Blutentnahme Methode ist tail Ablation 14. Herzpunktion ist eine mögliche alternative Verfahren für wiederholte Blutentnahme aus dem gleichen Fisch, aber die sehr geringe Menge erhalten (etwa 50 nl) mit diesem Verfahren begrenzt die Anzahl der Analysen, die Leis sein kannMed. 11 Dementsprechend wird ein neues Protokoll benötigt, um wiederholter nicht-tödliche Blutabnahme, die zu kritischer Voraus erforderlich wäre dafür Organismus auf eine Standard-Modellorganismus für menschliche Krankheiten zu ermöglichen. Diese Technik würde zum Testen pharmakologische Reaktion, Entdeckung von Molekular Biomarker für die Diagnose, die Bestimmung der Prognose und die Überwachung von verschiedenen Krankheiten, wie Stoffwechselerkrankungen, degenerativen Erkrankungen und verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen ermöglicht. Deshalb entwickelte eine minimal-invasive Verfahren zur Gewinnung von Blut von Zebrafischen in Reihe 15. Hier werden wir den Vorgang visuell nachweisen und ein detailliertes Protokoll für diese Technik. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden der normale Wert auf der Grundlage verschiedener Parameter, einschließlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker und Lipide im Blut von gesunden erwachsenen Zebrafisch ausgewertet. Zusätzlich haben wir auch bewertet, ob diese Methode eignet sich für Studien, die serielle Proben durch m verlangenBERWACHUNG die zeitlichen Veränderungen der Blutzuckerwerte während der Überfütterung Experimenten.

<table><tbody><tr><td>Glaskapillaren mit Filament</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td>1,0 mm Außendurchmesser.</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Zur Herstellung der Nadeln</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>081-00136</td><td>Für die Heparinisierung</td></tr><tr><td>Aspirator Schlauchbaugruppe</td><td>Drummond</td><td>2-040-000</td><td>Für die Blutentnahme</td></tr><tr><td></td><td>Bulb Dispenser Drummond</td><td>1-000-9000</td><td>Für die Blutentnahme</td></tr><tr><td>2-Phenoxyethanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-12075</td><td>Zur Betäubung von Fischen</td></tr><tr><td>DRI-CHEM3500V</td><td>Fujifilm</td> <td>-</td> <td>Zur Hämoglobinmessung</td></tr><tr><td>DRI-CHEM Objektträger</td><td>Fujifilm</td><td>Hb-WII</td><td>Zur Hämoglobinmessung</td></tr><tr><td>Glutest Neo Super</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho</td> <td>-</td> <td>Zur Glukosemessung</td></tr><tr><td>Wako L-Typ TG Kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>464-44201</td><td>Für TG Messung</td></tr><tr><td>Wako L-Typ CHO Kit</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>460-44301</td><td>Für die Messung des Gesamtcholesterins</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan Packaging</td><td>PM996</td><td>Zum Ausstoßen des Blutes auf</td></tr></tbody></table>

wiederholte blutentnahme für bluttests in adult zebrafisch

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Wiederholte Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken bei Labortieren durchgeführt. Allerdings hat eine nicht-tödliche Protokoll für die Blutentnahme aus Zebrafisch nicht nachgewiesen. Die bisherigen Verfahren zur Blutentnahme aus Zebrafisch sind tödlich, wie laterale Inzision, Enthauptung und Schwanz Ablation. So haben wir eine neuartige &quot;wiederholte&quot; Blutabnahmeverfahren ein detailliertes Protokoll umreißt dieses Verfahren entwickelt, und heute hier. Dieses Verfahren ist minimal-invasiv und führt zu einer sehr geringen Sterblichkeit (2,3%) für Zebrafisch, wodurch wiederholte Entnahme von Blut aus dem gleichen Individuum. Das maximale Volumen der Blutabnahme ist abhängig vom Körpergewicht der Fische. Das Volumen für wiederholte Entnahme von Blut in Abständen sollte ≤0.4% des Körpergewichts pro Woche oder ≤1% alle 2 Wochen, was durch Messungen der Hämoglobin bewertet wurden sein. Zusätzlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker, Plasma Triacylglycerol (TG) und c insgesamtholesterol Ebenen bei männlichen und weiblichen erwachsenen Zebrafisch wurden gemessen. Wir wendeten diese Methode auch, um die Fehlregulation des Glukosestoffwechsels in ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu untersuchen. Dieses Blutsammelverfahren wird viele Anwendungen, einschließlich Glucose- und Fettstoffwechsels und hämatologischen Studien, die die Verwendung eines Zebrafischs als menschliche Krankheitsmodell Organismus erhöhen können.

Das Blutsammelverfahren bewirkt minimale Verletzung Zebrafisch (ein &lt;1 mm Punktion; Figur 1J) und ergibt eine sehr niedrige Mortalitätsrate von 2,3%. Wir untersuchten das maximale Volumen an Blut, die von einem einzelnen Fisch gesammelt und ausgewertet werden, die die Beziehung um sein Körpergewicht (Abbildung 3) werden könnte. Wir haben festgestellt, dass der maximale Blutvolumen gesammelt wurden linear mit dem Körpergewicht (R = 0,813) korreliert. Das größte Volumen von Blut von ei...

Wiederholte Blutentnahme ist notwendig und wichtig in Tierversuchen. Wir haben eine neuartige, nicht-letale und zuverlässige Methode zur wiederholten Blutentnahme von adulten Zebrafischen entwickelt und diese Methode auf die Untersuchung der Blutbiochemie, einschließlich des Glukosestoffwechsels, angewendet.

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine minimalinvasive Blutentnahme von einem erwachsenen Zebrafisch durchzuführen, die mehrfache Entnahmen vom selben Individuum ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst die Spitzen von Glas-Mikrokappillarnadeln gezogen und abgeschnitten werden. Im zweiten Schritt werden die Nadeln heparinisiert und luftgetrocknet.Danach wird eine Nadel in die Blutentnahmestelle eingeführt und das Blut in die Nadelspitze aspiriert. Im letzten Schritt wird das Blut aus der Nadel in den entsprechenden Behälter zur weiteren Analyse abgegeben. Abschließend können die Glukosespiegel der Blutproben mit einem tragbaren Glukosemesser gemessen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Schwanzablation oder Herzpunktion besteht darin, dass diese Blutentnahmemethode minimalinvasiv ist und wiederholte Entnahmen von halb individuellen Zebranieren ermöglicht. Diese Methode erleichtert die schnelle und genaue Beurteilung sowie Kennzeichnung von Blutparametern bei Zebranieren und liefert Erkenntnisse über Stoffwechselstörungen sowie andere Blutparameter wie Triglyceride und die Pharmakokinetik spezifischer Arzneimittel. Zur

repeated-blood-collection-for-blood-tests-in-adult-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir, wie retro-orbitalen Injektion bei erwachsenen Zebrafisch zu tun.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Dieser Beitrag stellt eine Methode zur Gewinnung von Blut aus der Aorta dorsalis von Zebrafisch. Es bietet auch Anweisungen für das Abrufen Serum zur Verwendung in biochemischen Analysen, wie etwa Tests zur Bestimmung von Cholesterin und Triglyceriden.

Blutentnahme für Biochemische Untersuchungen an adulten Zebrafisch

Die zunehmende Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell erfordert die Entwicklung effektiver Methoden für die Lieferung von bekannten Mengen von Verbindungen und Lösungen. Die Magensonde unten beschriebene Verfahren ermöglicht die orale Verabreichung von genauen Volumina der Lösung zuverlässig, sicher und effizient zu erwachsenen Zebrafisch.

Gavaging Adult Zebrafisch

Die Verwendung von Zebrafischen für die Herz-Kreislauf-Forschung weitet sich auf die Forschung an erwachsenen Herzen aus. Für diese Anwendungen ist die schnelle und einfache Isolierung von Herzgewebe von entscheidender Bedeutung, um postmortale Veränderungen zu vermeiden und eine ausreichende Anzahl von Proben zu erhalten. Hier beschreiben wir eine schnelle und reproduzierbare Methode zum Präparieren von adulten Zebrafischherzen.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Hier diskutieren wir eine Methode-Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in Einstellungen des langfristigen vaskuläre Krankheiten Neoangiogenese und strukturelle Veränderungen verbunden.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Hier präsentieren wir eine zuverlässige, minimalinvasive und kostengünstige Methode zur Aufzeichnung und Interpretation von Elektrokardiogrammen in lebenden anästhesisierten erwachsenen Zebrafischen.

In Vivo Surface Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische

Dieser Test ist eine einfache Methode, um hämatopoetische Zellen bei der Entwicklung embryonaler Zebrafische zu quantitieren. Blutzellen von dissoziierten Zebrafischen werden einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Dies ermöglicht den Nachweis von Blutdefekten bei mutierten Tieren und nach genetischer Veränderung.

Verwendung der Durchflusszytometrie zum Erkennen und Quantitieren veränderter Blutbildung in den sich entwickelnden Zebrafischen

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entfernung des Bauchlappens der Leber bei erwachsenen Zebrafischen, um die Untersuchung der Leberregeneration zu ermöglichen.

Partielle Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen

Lernen Sie eine minimal-invasive Methode zur wiederholten Blutentnahme bei adulten Zebrafischen. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Blutbiochemie und Glukosestoffwechsel ohne Verletzung der Tiere.

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

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